Transcript Cours vecteurs non réplicatifs Powerpoint

Principes des vecteurs non réplicatifs
Virus défectifs
Un ou plusieurs gènes essentiels à la réplication sont délétés afin de rendre
les virus incompétents pour toute réplication dans l’hôte.
« Packaging cell line »
Une lignée cellulaire exprimant les gènes essentiels délétés dans le vecteur
est construite afin de produire les vecteurs viraux.
Séquences essentielles aux vecteurs
Séquence  : séquence d ’encapsidation du vecteur recombinant
Séquence poly A : séquence permettant la stabilisation des ARNm
Séquences promotrices : Promoteur adapté en amont du TG
Transgène

Réplication des rétrovirus
gag
pol
LTR
env
LTR
Fixation et entrée
Bourgeonnement
Cytoplasme
Rétrotranscription
Décapsidation
Transport
au noyau
Intégration
Noyau
Vecteurs rétroviraux
 Particularités des rétrovirus
 Virus enveloppés  pseudotype HIV/VSV env
(ou autre protéines d ’enveloppe)
Leur génome est un ARN + de taille réduite (10kb)  limitation de la taille
des inserts
 Ils intègrent leur matériel génétique de manière aléatoire  risque de
transformation
 Ils infectent largement les cellules mammifères
 Les lentivirus infectent les cellules quiescentes
Principe de fonctionnement des vecteurs rétroviraux (1)

Principe de fonctionnement des vecteurs rétroviraux (2)

LTR
Transgène
LTR
Principe de fonctionnement des vecteurs rétroviraux (3)
Vecteurs lentiviraux (HIV)
Vecteurs rétroviraux commerciaux
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Avantages et limitations des vecteurs rétroviraux et lentiviraux
 Avantages
Tropisme : large choix de protéines d ’enveloppe
Pas de réplication autonome et production minimum de protéines virales chez l’hôte
Réponse immunitaire très limitée
Intégration aléatoire et persistance du DNA rétrotranscrit (sauf méthylation des
promoteurs)
Survie des cellules infectées
Grand choix de promoteurs possibles
Risque de recombinaison limité par le fractionnement des constructions
Les vecteurs lentiviraux transduisent des cellules quiescentes
 Inconvénients
Production difficile de hauts titres infectieux
Intégration aléatoire, risque pathogène
Insert de petite taille (max 10 kb)
« Packaging cell lines » : constructions complexes exprimant gag, pol et env
Les vecteurs rétroviraux classiques ne transduisent pas les cellules quiescentes
Vecteurs alphaviraux (SFV)

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Réplicases
Protéines de structure
 Virus à ARN+ simple brin
 Matériel génétique de petite taille (10kb)
 Virus enveloppés
 Entrée dans la cellule, via des récepteurs spécifiques
Ils infectent tous les systèmes eucaryotes dont les cellules mammifères
Cycle des
alphaviraux (SFV)
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T7
Vecteurs alphaviraux (SFV)

1.Transcription in vitro (T7 polymérase)
ARNm
3.Co-transfection
2. Clonage des protéines de
structures et mutagénèse du
site de clivage de la
protéine d’enveloppe par un
site sensible à la
chymotrypsine

4.Traitement à
la chymotrypsine
Avantages et limitations des vecteurs alphaviraux
 Avantages
Facilité de constructions et d’études de nombreux mutants
Tropisme : infecte tous les types cellulaires eucaryotes
Choix possible des protéines d’enveloppe (mutagénèse du site de clivage/sécurité)
Pas de réplication autonome
Survie des cellules infectées
Choix de promoteurs possibles
Idéale pour la vaccination
 Inconvénients
Difficulté de production des ARNm en grande quantité industrielle
Production difficile de hauts titres infectieux
Pas d ’intégration, expression transitoire
Insert de petite taille (max 10 kb)
« Packaging cells lines » : exprimant les protéines de structure
Production des réplicases virales chez l’hôte
 Non déterminé
Réponse immunitaire ?
Infection des cellules quiescentes?
Vecteurs adénoviraux (Ad2, Ad5)
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 Virus non enveloppés
 génome ADN 2 brins linéaires 36kb
 infectent les cellules quiecentes
 tropisme large (récepteur aux intégrines avb5 et avb3 )
 niveau d’expression élevée
Infection par les adénovirus
Cycle viral des
adénovirus
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Organisation génétique des adénovirus
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
E1A : transactivation et entrée en phase S
E1B : fonction anti-apoptotique
E2 : réplication du DNA
E3 : contrecarre les défenses innées
E4 : régule le processing et l’export des ARNm tardifs
IVa2 : transactivation du promoteur tardif
Première génération de vecteurs adénoviraux
Formation de virus recombinants
Particularité des protéines E1 et E3 :
•E1 transactive l ’expression des gènes viraux et transforme les cellules
•E3 une protéine non essentielle qui contrecarre les défenses de l’hôte anti-adénovirus
 la délétion de E1 et E3 libère 7kb pour insérer un transgène
ITR
Séquences de
recombinaison homologue
(E2)
Génome viral 3’
Transfection
ITR
Recombinaison homologue
Promoteur
Adénovirus
recombinant
Cellules 293
(expriment E1)
Noyau
Vecteurs adénoviraux commerciaux
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Deuxième génération de vecteurs adénoviraux
Avantages et limitations des vecteurs adénoviraux
 Avantages
Tropisme pour des récepteurs largement exprimés (sauf lignées lymphoïdes)
Pas de réplication autonome et production minimum de protéines virales chez l’hôte
Survie des cellules infectées
Choix de promoteurs, niveau d ’expression élevé
Production de hauts titres infectieux
Vecteur transduisant des cellules quiescentes
« Packaging cell lines » : les cellules 293 expriment les protéines E1
 Inconvénients
Pas de choix possible des récepteurs
La réponse immunitaire reste un obstacle majeur (80% de la population est
séropositive)
L ’ADN ne s ’intègre pas (épisome)  persistance limitée dans le temps du DNA (2
semaines)
Insert de petite taille (max 7 kb)
Risque de recombinaison théorique avec des infections endogènes
Vecteurs adéno-associés
 Utilisation principale : expression de protéines en cellules mammifères à des
fins de thérapie génique (cellules quiescentes)
 Cycle réplicatif
Virus nus
ADN simple-brin linéaire (5 kb)
Leur cycle réplicatif implique :
L ’entrée dans la cellule par endocytose, via les héparines sulfates et récepteurs
secondaires (avb5, FGF) (large spectre de cellules infectées)
Adressage de l ’ADN au noyau
Transcription en ADN double-brin (nécessite un virus helper du type adéno
(E4), herpes)
Intégration dans le chromosome 19
Expression des ARNm (facilitée par les virus helper )
La production de particules virales (très résistantes : pH, température,
détergents)
Ils infectent la plupart des cellules mammifères
Formation de virus recombinants
 Particularité des vecteurs adéno-associés :
•Tous les gènes viraux sont délétés
•Les « packaging cell lines » sont complémentés pour les protéines virales et helper
Gènes rep
Gènes cap
Plasmide E2 et E4
adénovirus
ITR
Promoteur
Transfection
ITR
Virus adéno-associé
recombinant
Cellules 293
(expriment E1)
Noyau
Avantages et limitations des vecteurs adéno-associés
 Avantages
Tropisme pour un récepteur largement exprimé
Pas de réplication autonome et absence de production de protéines virales par l’hôte
Survie des cellules infectées
Production de hauts titres infectieux
L ’ADN s ’intègre dans le chromosome 19  persistance de l ’expression
 intégration aléatoire limitée
Réponse immunitaire très faible
Les vecteurs transduisent des cellules quiescentes
 Inconvénients
Pas de choix possible des récepteurs
Insert de petite taille (max 4 kb)
« Packaging cell lines » : expriment rep, cap (adéno-associées) E1, E3 et E4
(adénovirus)
Stratégies d’utilisation des alphavirus
5’
SP6
ou
T7

Poly A
réplicases
Pro
3’
Transgène
Transcription in vitro (SP6 ou T7 polymérase)
ARNm
* Possibilité de transfecter l’ADN
*
Transfection
sous le contrôle d ’un promoteur eucaryote
Packaging cell line
exprimant les
protéines de structures
SFV
recombinant
Noyau