Transcript 한림대-김은지-교육자료

독성시험 및 기능성 확인을
위한 동물시험 이해
한림대학교
식의약품의 효능평가 및 기능성소재개발센터
김 은지
발표 내용 및 목차
• 동물실험 개요
• 실험동물을 이용한 독성 실험
• 실험동물을 이용한 기능성 평가
동물실험 개요
동물실험 및 실험동물
 동물실험
실험동물을 사용하여 특정 시료에 의해 동물에 나타나는 반응을 관
찰하고 그 반응을 통해 사람이나 기타 동물 종에 미칠 영향에 대해
예측하는 실험
 동물실험의 중요성
• 새로운 시료의 인체내 대사기전 및 안전성에 대한 정보를 줌
 인간에 적용 가능
• 질환의 원인, 치료 및 예방을 위하여 인간과 유사한 동물을 사용하여
정보 획득
• 사람에게 제어하기 어려운 환경조건을 동물에게 연구 가능
• 얻어진 동물 실험 정보는 인간 및 동물 복지에 기여
 실험동물
연구(검사, 검정, 진단, 교육, 제조) 목적으로 개발, 개량된 동물
척추동물(설치류, 조류, 양서류)과 무척추동물
Rat
Mouse
Beagle
Hamster
Cat
Rabbit
Guinea
Pig
 실험동물의 유용성
• 포유동물로서 생물학적으로 인간과 유사
(마우스 – 면역기전, 돼지 – 전반적인 생리적 기전)
• 세대기간이 짧아 차세대에 미치는 연구 가능
• 실험에 영향을 주는 환경 컨트롤 용이
 실험동물의 분류 및 구분
1. 유전적 통제에 의한 구분
군
규정
근교계
Inbred strain
20세대이상 형매교배가 지속된 것으로 유전자가 98%이상 균일
Rat: Fisher 344, Lewis, SHR etc
Mouse: BLAB/c, C57BL/6 etc
돌연변이계
Mutant strain
특수한 돌연변이유전자를 보유하는 것
Rat: Nude, Gunn etc
Mouse: BLAB/c-nu etc
5년 이상 다른 곳으로부터 유전자를 도입하지 않은 상태로 유지되
폐쇄군
고 있는 계통
Closed colony Rat: SD, Wistar, Long-Evans etc
Mouse: ICR, DDY etc
교잡군
Hybrid
계통사이의 잡종
Mouse: BDF1 (C57BL/6×DBA/2), CDF1 (CBA/N×DBA/2) etc
2. 미생물적 통제에 의한 구분
군
미생물 상태
유지
무균동물
Germ free
검출할 수 있는 모든 미생물 ∙ 기생충이 없
는 동물
Isolator
노토바이오트
Gnotobiotes
보유하고 있는 미생물이 명확하게 알려져
있는 동물
Isolator
특별히 지정된 미생물 · 기생충이 없는 동물
Barrier
system
SPF 동물
Specific pathogen
free
일반동물
미생물 컨트롤이 전혀 되지 않은 동물
Conventional animals
Conventional
room
실험동물 관리
 실험동물의 품질 관리
유전학적
관리
연구 결과를 보증해
주는 중요한 과정
→ 건강평가 혹은 연구자가 요구하
는 품질에 적합한가를 확인
연구자가 원하는 동물인지 확인
→ 연구 목적에 맞게 번식·육성되어
유전적으로 형질 보존
품질
관리
미생물학적
관리
환경
관리
온도 및 습도, 환기 배출수,
풍속, 소음, 조명, 낙하균수,
분진, 냄새 등을 정기적으로
검사하여 시설 운영
 실험동물 시설의 환경
청정한
공기송풍
온/습도
압력유지
미립자의
회수방지
Clean
Room
미립자의
누적방지
발생원의
제거
미립자의
유입방지
항목
마우스, 랫드, 햄스터, 기니픽, 토끼
온도
18~28℃ (급격한 변화는 피함)
습도
30~80% (급격한 변화는 피함)
환기횟수
난류방식 10~15회/시간, 기류방식 8~15회/시간
기류속도
13~18㎝/초
분진
Class 10,000
낙하세균
3개 이하
냄새
실내의 암모니아농도에서 25ppm을 넘지 않음
조명
150~300 Lux (바닥 위 85㎝)
소음
65dB 이하를 넘지 않도록 함
동물실험 계획 및 실시
 동물실험윤리위원회 제도 및 취지
동물보호법 제14조 규정에 의하여 대통령령이 정하는
동물실험시설에는 ‘동물실험윤리위원회’를 설치
무분별한
동물실험방지
실험동물의 보호와
윤리적인 취급도모
연구결과의
신뢰성 증대
 Replacement :
3Rs
원칙
가능한 동물실험을 사용하지 않는 대체 방안 강구
(하등동물, 배양세포, 컴퓨터 시물레이션 등)
 Reduction : 실험동물 사용수 최소한으로 감소
 Refinement :
동물 반응을 안정화 (동물품질 향상, 실험환경 정비)
동물에게 고통을 주지 않는 실험방법 적용
실험결과의 호환성 (실험기법의 표준화)
 동물실험계획(서) 시 고려사항
1. 동물실험 대체 가능성 판단
[3Rs : Replacement]
2. 목적에 부합하는 동물 종 및 계통 선정
3. 특별 사육관리 필요성 점검
: 대사케이지 실험, 감염실험, 장시간 보정 등
4. 실험동물의 미생물 품질에 따른 사육시설 점검
5. 사용동물 수에 대한 합리적인 근거 [3Rs : Reduction]
: 목적한 결과를 도출하기 위하여 계획한 동물의 총 수와 해당 동물실험의
내용이 일치하는지 실험군별 동물 수가 통계적으로 유의한지 등 적절성 여
부 검토
6. 실험동물실 이외 장소에서 동물실험 실시 여부
: 오염이나 감염문제 등의 유발 가능성 및 동물 이동 시 스트레스 감소 방
안 고려
7. 실험방법 개요
: 사육기간, 투여 용량, 투여 경로, 투여 횟수, 투여 기간, 시료 채취 간격 및
횟수, 대조약물 등 가능한 실험방법 구체화
8. 시료채취를 위한 실험과정 중 또는 종료시 실험동물의 고통관리
[3Rs : Refinement]
: 실험 처치에 따른 통증과 스트레스의 정도를 평가하여 적합한 동물종별
진정, 진통, 마취제 및 투여용량 결정
9. 실험 처치 후 관리의 적절성 여부 판단
: 수술 후 통증관리와 수술 후 감염방지를 위한 항생제 투여 등에 대한 실험
내용을 구체화
< 대표적인 진정, 마취제 및 투여용량 >
랫드
약제명
투여량
(mg/kg)
투여경로
투여량
(mg/kg)
투여경로
44-50
IV (infusion)
12-24
IV
Chloropromazine
0.25
IM, SC, IP
12.5/25
IP/SC
50
IM
Atropine
0.04
IM, SC, IV
0.004
SC, IM
Tribromoethanol(avertin 2.5%)
300
IP
125
IP
110-300
PO
300
IP
10-30
IP
7.5
PO
0.004
SC, IM
30-70
IP
40
IP, IV
Propofol
비마약류
Acetaminophen
Ibuprofen
Aspirin
Pentobarbital sodium
Thiopental sodium
마약류
마우스
Ketamine
Ketamine + Diazepam
Ketamine + Xylazine
Butophanol
30-70
IP
40
IP
40-90
IP
25-50
IV
25-50
IV
30-40
IV
50-90
IP
100
IM
100-200
IM
40-80+5-10
IP
200+5
IM + IP
90+10
IM
40-80+5-10
IP
100+10
IM + IP
23.2
SC
5.4
SC
10. 인도적인 실험 종료의 기준 설정
실험종료
특징
적용
식욕부진과 수척의 지속
정상 체중의 20% 감소
전이성 질병, 만성 감염증
독성실험, 전신성 질환
심각한 기관 또는
전신에 관한 증상
호흡계 : 호흡곤란, 빈호흡, 기침
심혈관계 : 쇼크, 출혈, 과민반응
위장관계 : 심한 설사, 구토
말초신경계 : 근육이 약해지거나 경련성 마비
중추신경계 : 회전(circling), 맹목(blindness), 치매, 경
련
종양이 체중의 10%를 초과
괴사, 감염, 궤양이 급식, 급수에 지장을 초래하는 경우
피하 및 복강 종양, Hybridoma
종양의 성장 및 영향
11. 동물의 안락사 방법
: 동통이나 고통 없이 급속한 무의식 상태와 사망을 유발하는 방법으로 동물
을 죽이는 행위
: 물리적 방법보다 화학적 방법(주사제, 흡입약제) 권장:
동물종
약제명
Pentobarbital sodium
설치류
Euthanasia solutions
(Euthasol, Beuthanasia-D)
CO2
투여용량 (mg/kg)
투여경로
150-200
IP, IV
2.2-22(ml/kg)
IP, IV
70% 이상
12. 적절한 절차 확인
: 인체유래 조직이나 세포를 이용하여 동물실험을 실시할 경우, 적법
한 절차를 거쳐 획득한 검체 인지 확인 (생명 윤리 및 안전에 관한
법률)
13. 위험물질 여부
: 방사선 동위원소(Radioisotope, RI)
: 독성화합물질(Physical hazard)
: 생물학적 위해 물질(Biohazard)
14. 동물실험은 적절한 자격과 교육을 이수한 전문 인력이 수행
 동물실험 실시 시 고려사항
•
•
•
•
•
동물 실험 계획에 따라 실시할 것
적절한 사육관리를 실시할 것
실험계획에 따라서 분담사항을 실시할 것
동물개체의 취급이 틀리지 않은 것
실험결과에 영향을 미친다고 생각되는 사항에 관하여 기록하고 데이
터 해석 시 이용할 것
실험동물을 이용한
독성시험
< 건강기능식품 기능성 원료 인정에 관한 규정 (식약청 고시)
<그림 > 건강기능식품 기능성원료의 안전
성평가를 위한 의사결정도
실험동물을 이용한 독성시험
1. 건강기능식품의 섭취로 인해 발생할 수 있는 잠재적 위해 와 인체적용
시험에서 파악하기 힘든 독성결과까지 동물시험 연구를 통해 예측해 볼
수 있음
2. 일반적으로 물질의 독성은 포유류 전반에 걸쳐 유사하므로 동물시험을
통해 관찰된 독성은 별도의 안전성 근거자료가 없는 경우 안전성평가를
위해 유용하게 사용될 수 있음
3. 단회투여독성시험(설치류, 비설치류), 3개월 반복투여독성자료(설치류),
유전독성시험(복귀돌연변이시험, 염색체이상시험, 소핵시험)을 기본으
로 하며, 원료의 특성에 따라 필요한 경우 생식독성, 면역독성, 발암성
시험 등이 추가로 필요할 수 있음
4. 독성시험에 사용되는 시험물질은 제출 원료와 동일한 것 이어야 하
며, 실험동물의 종은 시험물질의 독성을 가장 민감하게 반영할 수 있
는 것으로 선택해야 하며, 시험물질은 경구투여를 원칙으로 함
5. 독성시험자료는 우수실험실운영기준 (Good Laboratory Practice,
GLP)에 따라 지정된 기관에서 OECD 독성시험 지침(Toxicity Test
Guideline)에 준하여 시험한 보고서로 제출하여야 함
관찰
< 국내독성시험 가능한 GLP 인정 기관 >
기관명
지정시험 항목
단회투여
반복투여
생식발생
유전
면역
발암성
국소
기타
한국화학연구원 부설
안전성평가연구소
○
○
○
○
○
○
○
○
㈜유한양행
○
○
LG생명과학기술연구원
○
○
○
○
○
○
○
㈜바이오톡스텍
○
○
○
○
○
○
산업안전보건연구원
○
○
㈜켐온
○
○
○
○
㈜아모레퍼시픽
○
○
○
서울대병원
○
○
한국화학시험연구원
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
○
설치류, 비설치류를 이용한 단회투여 독성시험
☞정의 : 시험물질을 실험동물에 1회 투여하고 그 후 중독증상 및 치사량을
정성 및 정량적으로 평가, 조사하는 시험 (급성독성시험)
1. 동물 종: 2종 이상의 동물 (1종은 설치류, 다른 1종은 토끼 이외 의 비 설치류), 폐
쇄군(closed colony)인 SD랫드, Wister랫드, ICR마우스 사용, 개는 Beagle dog 사
용
2. 성별: 적어도 1종에서는 암 · 수 동물 사용하여 성 차를 검토
3. 동물 수: 일반적으로 설치류는 군별 5마리, 비 설치류는 군별 2마리
4. 체중 또는 주령: 설치류의 경우 5-6 주령, 개의 경우 5-6 개월령
5. 투여경로 및 관찰 기간: 임상적용경로 원칙, 경구투여의 경우 강제투여 원칙, 통상
14일
6. 용량: OECD 허용 한계용량인 2000 mg/kg에서 사망이 관찰되지 않아도 이 용량 이
상에서의 시험은 수행하지 않음
 실험방법
실험동물 준비
☞ 관찰 항목
1. 관찰기간 중
4~6 hr or
overnight 절식
익일 시험물질 투여
관찰기간(14일) 동
안 관찰
1) 체중 측정
2) 중독증상
- 자극에대한 반응 및 행동
- 호흡
- 경련
- 피모 및 피부
- 배설물
2. 관찰기간 종료 및 사망시
결과분석
1) 부검 및 기관과 조직의
병리조직학 검사
2) 치사량(LD50)
 단회투여독성시험 예
• 사망동물
• 체중변화
• 중독증상 관찰
• 병리조직학적 검사
<Korean J. Oriental Physiology & Pathology 22(6): 1562-1565, 2008>
설치류를 이용한 3개월 반복투여 독성시험
☞정의 : 시험물질을 일정기간(3개월) 연속적으로 실험동물에 투여하여 시험
물질을 일정시간에 걸쳐 섭취한 경우 생기는 독성증상 및 유해성을 예측
하고 시험물질을 사용할 때 대체적인 안전성을 추정하는 시험
1. 동물 종: 폐쇄군(closed colony)인 SD 랫드, Wister 랫드, ICR 마우스 사용
2. 성별: 암 · 수 동물 사용하여 성 차를 검토
3. 동물 수: 일반적으로 설치류는 군별 5~10마리
4. 체중 또는 주령: 설치류의 경우 5-6주령, 개의 경우 12개월령부터 투여 시작
5. 투여경로 및 투여기간: 임상적용경로 원칙, 경구투여의 경우 강제투여 원칙, 통상 1
일 1회 주 7회
6. 용량: 적어도 3단계, 확실 중독량과 무해용량이 파악되도록 설정
 실험방법
☞ 관찰 항목
실험동물 준비
4~6 hr or
overnight 절식
익일 시험물질 투여
관찰
관찰기간이 3개월이
되었는가?
YES
결과분석
NO
1. 관찰기간 중
1)
2)
3)
4)
5)
6)
체중 측정(사료 섭취 및 음수량)
중독증상
사망률
혈액 검사
뇨 검사
안과학적 검사
2. 관찰기간 종료(사망) 시
1) 병리학적 검사
- 육안, 장기 무게측정, 조직학적 검사
2) 확실중독량, 무해용량
 반복투여 독성시험 예
1) 체중 변화
♂
♀
 반복투여 독성시험 예
2) 체중대비 장기중량비율
 반복투여 독성시험 예
3) 혈액학적 검사
4) 혈액생화학적 검사
 반복투여 독성시험 예
5) 뇨 검사
 반복투여 독성시험 예
6) 병리조직학적 검사
< Korean J. Lab. Anin. Sci. 17(1): 109-118, 2001>
유전독성 시험
☞정의 : 물리화학적인 요인 또는 생리적인 요인 등에 의해 DNA의 염기나
유전자 및 염색체에 직접 손상을 주어 형태학적 및 기능적 이상을
일으키는 현상(유전 독성) 여부를 판단
정상 체세포
정상 생식세포
돌연변이원/발암물질
돌연변이원/발암물질
(DNA/염색체)에 돌연변이 유발
현 세대
기능 이상 유발
(암, 기형 발생)
다음 세대의 유전적
상해
 유전독성의 종류
DNA 손상 (DNA damage)
DNA 수복 (DNA repair)
유전자 돌연변이 (Gene mutation)
I. 복귀돌연변이 시험
염색체 이상 (Chromosomal aberration)
II. 염색체이상시험, 소핵시험
I. 복귀돌연변이 실험
☞정의 : 특정 아미노산 요구성 균주를 이용하여 시험물질에 의한 돌연변이(저해
된 아미노산 합성 균주)로 전환되는지를 확인함으로 유전독성을 측정하
는 시험
negative
살모넬라균(his-)
약 10 시간
배양(109/ml)
시험물질 처리 +/- S9(5 mg/plate)
선택배지에서
약 48 시간 배양(37℃)
Salmonella typhimurium
(His+) 집락 계수
판정
positive
 복귀돌연변이 실험에 사용되는 균주
Salmonella typhimurium
Amino acid requiring
돌연변이 형태
돌연변이 특징
TA98
his-
Frameshift
Codon의 배열이 어긋나는 돌연변이
TA100
his-
Base-pair
substitution
한 개의 염기가 교환되는 점 돌연변이
TA102
his-
Base-pair
substitution
한 개의 염기가 교환되는 점 돌연변이
TA1535
his-
Base-pair
substitution
한 개의 염기가 교환되는 점 돌연변이
TA1537
his-
Frameshift
Codon의 배열이 어긋나는 돌연변이
Escherichia coli
Amino acid requiring
돌연변이 형태
돌연변이 특징
WP2uvrA
trp-
Base-pair
substitution
한 개의 염기가 교환되는 점 돌연변이
WP2uvrA
(pKM101)
trp-
Base-pair
substitution
한 개의 염기가 교환되는 점 돌연변이
* Histidine-requiring bacterial strain (his-), Tryptophan-requiring bacterial strain (trp-)
 복귀돌연변이 실험 방법
(-), (+) S9mix(대사활성계)
① Negative
control
48hrs
incubation
1)
Preparation
of
minimum
glucose
agar plate
② Positive
control
2) Pre-incubation
in liquid culture
medium
: 1X109 cells/ml
4) Mix with top 5) Pouring of
agar
mixture to
minimum
③ Test
glucose agar
substance
plate
 복귀돌연변이 실험 예
<J Korean Soc Food Sci Nutr 36(8): 960-964, 2007>
II. 염색체이상실험
☞ 정의 : 시험물질에 의한 염색체이상 유발 유무와 유발 정도를 염색체 수의
이상 및 구조의 이상 판단을 통해 검색하는 시험
염색체 수의 이상: 이수성 (aneuploidy), 배수성 (polyploidy)
염색체 구조의 이상
< http://floriascience.spaces.live.com/>
 In vitro 포유류 배양세포를 이용한
염색체이상실험
☞정의 : 사람 또는 그 외 포유 동물의 배양세포를 이용하여 시험물질이 염색체이상
을 유발하는지와 그 정도를 확인하는 시험으로 포유류 돌연변이원과 발암원
의 가능성을 검사하는 시험. 생체내 시험법보다 감수성이 높고 조작이 간편
함
1. 세포: Chinese hamster 세포주 (Chinese hamster ovary; CHO, Chinese hamster lung
fibroblast; CHL 등), 사람 또는 다른 포유동물의 림프구
2. 용량: 용해성과 세포독성 평가를 통해, 용해성이 좋고 세포독성이 나타나지 않는 농도에서
시험 (시험물질의 최고 처리 농도는 5mg/ml 또는 10mM을 넘지 않도록 함)
3. S9 mix:
1) 직접법: S9 mix를 처리하지 않는 경우
2) 대사활성화: S9 mix를 처리하는 경우
4. 대조군
1) 음성대조군: 시험물질 조제에 사용된 용매만을 처리
2) 양성 대조군: 대사활성화 (S9 mix) 유무에 대응하는 염색체 이상 유발물질 처리
 실험방법
CHL 정상염색체
세포 파종
시험물질 및 대조군 처리 (-/+ S9 mix )
3~6시간 배양
정상 배지에서 배양
(시험물질 제거)
시험물질 처리 후
1.5 세포 주기 경과
CHL 염색체이상
콜세미드 (Colcemid) 처리
(최종농도 0.2mg/ml)
->세포분열중기(metaphase)
염색체 표본 제작
: 고정 및 5% Giemsa 염색
염색체이상 계수
판정
※ 콜세미드: microtuble 형성을 억제
하여 metaphase로 유지시킴.
Fig> Cisplatin에 의해 유도된 염색체의 수 및 구조적 이상
<Oncogene 27: 32–43, 2008>
 In vivo 설치류 골수세포를 이용한
염색체이상실험
☞정의 : 설치류의 골수 세포를 이용한 생체내 염색체이상시험은 설치류 등의 포유류
에서 시험물질에 의한 염색체이상을 검색하는데 사용되며, 시험물질의 체내
물질대사, 약물 동태 등을 고려한 유전적 위험을 평가하는 시험
1. 동물 종: 일반적으로 랫드, 마우스, Chinese hamster가 많이 사용됨
2. 성별: 일반적으로 암 · 수 양성을 사용하나 성 특이물질인 경우 또는 실험상 필요하다고 사료 될 때
에 해당되는 성을 선택하여 사용
3. 동물수: 8~12 주령, 군당 5마리 이상 사용
4. 투여경로: 일반적으로 경구투여 또는 복강투여를 하며, 시험물질의 임상 적용 경로를 고려하여 선정
5. 투여 횟수: 투여 횟수는 1회 투여를 원칙으로 하며, 필요에 따라 24시간 간격으로 2회 이상 투여함
6. 용량: 용량단계는 3가지 이상으로 함
독성이 나타나지 않는 범위에서 2g/kg/day이 최고한도임
7. 대조군: 1) 음성대조군: 시험물질 조제에 사용된 용매 만을 투여
2) 양성대조군: 염색체이상을 유발하는 물질로 알려진 물질을 투여 (mitomycin C 등)
 실험방법
Fig> Cyclophosphamide에 유도된
염색체 손상
실험 동물 준비
순화-체중 측정-군 분리
1. Negative control
시험 물질 및 대조군 투여
18~72시간
콜세미드 복강내 주입
: 표본 제작 3~5시간 전
2. 50 mg Cyclophosphamide/kg
골수 채취
염색체 표본 제작
: 고정→ 세척→ 5% Giemsa 염색
염색체이상 계수
판정
<http://homepages.wmich.edu/~ficsor/r
esearch-reports. htm>
III. 소핵실험
☞ 정의 : 시험물질에 의해 소핵이 생성되는 정도를 관찰함으로써 시험물질에 의한
염색체 또는 유사분열 기관의 손상 여부를 통해 유전독성을 평가하는 시험
방법
※ 소핵(Micronucleus): 세포의 주핵으로부터 분리된 작은 핵을 말하며, 시험물질에 의하여 절
단 및 탈락된 염색체의 단편이 세포분열 후기 또는 말기에 딸세포로 전달되지 않고 남아 있
는 것을 말함
 In vitro 세포주를 이용한 소핵실험
☞ 정의 : 시험물질에 의한 염색체 수준에서의 손상이나 세포분열장치 이상 유도에
의해 형성된 소핵 형성 평가를 통해 유전 독성을 검색하는 시험
1. 세포: Chinese hamster 세포주 (CHO, CHL 등), 포유동물의 림프구
2. 용량: 세포독성 평가 후 세포독성을 나타내지 않는 범위에서 3단계 이상의 농도 선택
3. 대사 활성화:
1) S9 mix를 처리하지 않는 경우
2) S9 mix (v/v: 10%)를 처리하는 경우
4. 대조군
1) 음성대조군: 시험물질 조제에 사용된 용매 처리
2) 양성 대조군: 대사활성화 (S9 mix) 유무에 대응하는 유발물질 처리
(S9 mix -: mitomycin C, S9 mix +: cyclophosphamide)
 실험방법
세포 파종
배양
시험물질 및 대조군 처리 (-/+ S9 mix )
Fig> CHO-K1 세포에서 관찰되는 소핵
Cytochalasine B 처리
(최종 농도 3mg/ml)
: 세포질 분열 억제
1 세포주기
(약 20시간 배양)
세척 및 고정
<http://lpi.oregonstate.edu/ CCP/
micronucleus.html>
염색체 표본 제작
: 0.24mM acridine orange염색
소핵 계수
판정
 In vivo 설치류를 이용한 체내소핵실험
☞ 정의 : 골수 및 말초 혈액에서 채취한 적혈구의 분석을 통해 시험물질에 의해 유도
되는 염색체 또는 유사분열기관의 손상을 체내의 물질대사, 약물동태, DNA
복구과정의 요소들을 고려하여 유전적 위험을 평가하는 데 적절한 시험
1. 동물 종: 일반적으로 마우스나 랫드를 사용하며, 말초혈액을 이용 할 때는 마우스가 권장됨
2. 성별: 일반적으로 암 · 수 양성을 사용하나, 시험물질이 성 특이물질인 경우 또는 실험상 필요하다고 사료
될 때에 해당되는 성을 선택하여 사용
3. 동물 수: 군 당 5마리 이상
4. 투여경로: 일반적으로 경구투여 또는 복강투여를 하며, 시험물질의 임상 적용 경로를 고려하여 선정
5. 투여 횟수: 투여 횟수는 1회 투여를 원칙으로 하며, 필요에 따라 24시간 간격으로 2회 이상 투여 함
6. 용량: 3단계 이상의 용량을 선정
7. 대조군
1) 음성 대조군: 시험물질 조제에 사용된 용매 만을 투여
2) 양성 대조군: 기존에 소핵을 유발하는 것으로 알려진 물질을 투여 (mitomycin C 등)
 실험방법
실험 동물 준비
순화-체중 측정-군 분리
시험 물질 투여
1) 음성 대조군
2) 양성 대조군
3) 시험군
24, 48, 72시간
실험동물 도살
:골수 또는 말초 혈액 채취
염색체 표본 제작
: 고정→ Acridine orange 염색
염색체이상 계수
판정
1. Negative control
2. Positive control(MMC)
계수 및
판정
3. 시험물질 (고농도)
<The Internet Journal of
Health™ ISSN: 1528-8315>
생식독성실험
☞ 정의 : 생식세포의 발생으로부터 출생 후 성장까지의 영향을 평가 함으로서 인체
기형유발성, 수태장애 등의 부작용을 실험동물을 이용하여 검색하는 시험
수태능 및 초기배 발생시험
암 · 수 동물에 대하여 교배 전부터 교미, 착상까지
시험물질을 투여하여 나타나는 독성 및 장애를 조사
배 · 태자 발생시험
시험물질을 아급성 용량으로 실험동물에 투여 하여
배자 및 태자의 발달에 독성을 유발할 수 있는지 조
사
출생 전 · 후 발생 및 모체기능
시험
암컷에 착상부터 이유까지 시험물질을 노출시켜 임
신/수유기의 암컷, 출생자의 발생에 미치는 독성 조
사
면역독성시험
☞ 정의 : 인체에서 페니실린 쇼크와 같은 심각한 부작용 및 독성을 유발할 가능
성이 있는 식품을 검색하고 알레르기 및 과민반응을 예측하는 시험
아나필락시스 쇼크란?
아나필락시스 쇼크
반응시험
수동 피부 아나필락시스
반응시험
피부 감작성시험
알레르기 반응 중 가장 심각하며, 호흡곤란, 설사, 현기증을
일으킴
실험동물에 시험물질을 감작한 후 항원을 정맥주사 함으로서
아나필락시스 반응을 확인
실험동물에 시험물질을 항원으로 감작시켜 얻은 항혈청을 랫드의
배부 피내에 수동면역 시킨 후에 항원을 정맥내에 주사하여 조직
친화성 항체의 역가를 알아보기 위한 시험
시험물질이 피부에 반복적으로 노출되었을 경우 나타날 수 있는
홍반 및 부종 등의 면역학적 피부과민반응 평가
피부에 생성된 아나필락시스
발암성 시험
☞ 정의 : 실험동물을 이용하여 종양의 유발 가능성을 검색함으로 인간의 발암성
위해도를 예측하기 위해 실시하는 시험
시험물질을 투여 후 병리조직검사를 실시하여 투여군의 종양
발생이 대조군에 비하여 증가 또는 감소하는지 여부 조사
장기 발암성시험
마리수
투여군
투여방법
투여기간
랫드
50마리 이상
군당3~4마리
사료나 강제경구투여
24개월 이상
마우스
50마리 이상
군당3~4마리
사료나 강제경구투여
18개월 이상
발암성 대체시험
형질전환 동물을 이용한 단기발암성 모델 또는 발암개시, 발암
촉진 모델이나 신생아 동물모델 중 선택
실험동물을 이용한
기능성 평가
세포시험
인체시험
동물시험
생리학적 의미??
비용
안전
기능성 평가를 위한 동물시험에서
중요 고려사항
바이오마커의 선택 & 분석법??
사용 동물
* 일반적으로 흰쥐 (rat)과 생쥐 (mouse)가 많이 사용됨
* 실험목적에 따라 유전자 결손 또는 유전자 변이 동물 사용
AKITA mice
(2형 당뇨모델)
NC/Nga
(아토피성 피부염 모델)
투여 방법
* 식품일 경우 실험동물의 식이 (사료 또는 물)에 혼합하여 투여
* 식물 유래 특정 성분일 경우 경구 투여 및 식이에 혼합하여 투여
* 의약품인 경우 정맥 주사 또는 복강 투여
투여기간
* 투여 기간은 실험 목적에 따라 수일에서 수개월까지 다양
투여용량
* 투여 용량은 최대무유해작용량 (NOAEL: No Observed Adverse
Effect Level) 한도 내에서 투여, 예비실험을 통해 투여 용량 설정
바이오마커 선정 및 분석법 선택
* 실험목적에 따라 적합한 바이오마커 선택하고 적합한 분석법을
선택하여야 함
기능성 평가에 사용되는 동물모델 I
류마티스
관절염
노화촉진
SAMP1
SAMP6
SAMP8
SAMP10
마우스
DBA/1J 마우스
LEWIS 랫드
DA 랫드
☞ 사진출처: 중앙실험동물(주)
알러지
BALB/c 마우스
BN 랫드
Guinea 피그
NC/Nga 마우스
고혈압
SHR 랫드
WKY 랫드
Dahl 랫드
동맥경화 및 고지혈증
Apoe Knock-out
마우스
F1B 햄스터
기능성 평가에 사용되는 동물모델 II
체중
New Zealand Obese 마우스
KK 마우스
ob/ob 마우스
db/db 마우스
fa 마우스
fa/fa Zucker 랫드
OLETF 랫드
혈당
db/db 마우스
(제2형 당뇨병 모델, 비만형)
ob/ob 마우스
(제2형 당뇨병 모델, 비만형)
non-obese diabetic (NOD) 마우스
(제1형 당뇨병 모델)
GK 랫드
Zucker fatty 랫드
OLETF 랫드
KK 마우스
BB 랫드
☞ 사진출처: 중앙실험동물(주)
기능성 평가에 사용되는 동물모델 III
 체중관련
* 식이 유도 비만 모델
ICR, C57BL/6 마우스 또는 SD rat에 고지방 식이 섭취
사람의 비만과 유사
 간기능 관련
* 급성 간장애 모델
CCl4 급성 간장애 모델
D-galactosamine 간염 모델
* 지방간 모델
Ethionine 지방간 모델
Ethanol 지방간 모델
* 만성 간장애 모델
CCl4 만성 간장애모델
기능성 평가에 사용되는 동물모델 IV
 지질개선관련
* 식이 유도 고지혈 모델
고지혈 유도 식이로 고지혈 유도
주로 AIN-76 식이에 1% 콜레스테롤 첨가 식이 사용
 혈당관련
* I형 당뇨 모델
Streptozotocin 투여모델
NOD 마우스
BB 랫드
Lew 랫드
KDP 랫드
* II형 당뇨 모델
ob/ob 마우스
db/db 마우스
SDT 랫드
GK 랫드
OLEFT 랫드
다양한 I형 당뇨 모델의 특징
NOD mouse
BB Rat
KDP rat
Lew rat
발생시기
90일 이후
60일 이후
60일 이후
58일 이후
성별차이
♂>> ♀
-
-
-
림프구의 감소
-
+
-
-
다양한 II형 당뇨 모델의 특징
GK rat
SDT rat
OLETF rat
혈당치
+
+
+
비만
-
-
+
+
+
고지혈증
인슐린분비장해
+
+
+
성별차이
-
♂>> ♀
♂
췌장변화
변형
섬유화
비대, 섬유화
기능성 평가에 사용되는 주요 바이오마커
 체중관련
측정항목
바이오마커
식이섭취 및 체중 증가량
총식이섭취 칼로리
식이효율 및 에너지 효율
전체 체중 증가량
체지방량
총 체지방량
복부지방 분포도
복부 및 내장지방 무게
지방 및 간조직의 성상
지방세포 수
크기
간조직의 지질 침착도 및 침착양상
< J Nutr 132: 1977-1982, 2002 >
 체중관련
측정항목
혈중 및 간조직 중의 지질,
지단백질 및 호르몬
복부 및 간조직 중의 효소 및
유전자
바이오마커
Triglyceride
Total lipid
Total cholesterol
LDL-cholesterol
HDL-cholestero
Leptin 함량
Lipogenesis와 adipogenesis 관련 효소
- 효소활성
- 유전자 발현
- GPDH
Lipolysis와 fatty acid oxidation 관련효소 및 유전자
- HSL(hormone sensitive lipase)
- CPT-1(carnitine palmitoyl transferase-1)
- UCPs(uncoupling proteins)유전자
 콜레스테롤 조절
측정항목
바이오마커
혈장 콜레스테롤
대사 조절
Total cholesterol
LDL- cholesterol
HDL-cholesterol
Apo A-1
Apo B
간의 콜레스테롤
생합성 조절
HMG-CoA reductase 활성도
LCAT 활성도
Cholesterol
장내 콜레스테롤
흡수 조절
콜레스테롤 섭취량
pCEH 활성도
ACAT 활성도
콜레스테롤과
담즙산 배설 조절
분변 중성스테롤 배설량
분변 산성스테롤 배설량
< Korean J Nutrition 36(9): 889-897, 2003 >
 혈당
바이오마커
공복혈당
내당능
식후혈당
당화혈색소
< Korean J Food & Nutr 22(2): 159-165, 2009 >
 혈행개선
바이오마커
Serotonin 농도
Thromboxane A₂
혈소판 응집 억제 평가
혈액 응고 억제 평가
적혈구에서 procoagulant 활성
혈관 수축 이완 기능 평가
< Yakhak Hoeji 53(5), 298-302, 2009 >
혈전용해능 평가
Plasmine
Sample1
Sample2
 혈압관련
바이오마커
안지오텐신 전환효소
혈압
호모시스테인
Hs-CRP(hormone sensitive C-Reactive Protein)
< J Korean Soc. Food Sci Nutr 32(6): 899-9 05, 2003 >
 항산화 관련
측정항목
적혈구 및 간조직의
항산화 효소활성
바이오마커
SOD (Superoxide Dismutase) 활성도
글구타티온 퍼옥시다아제
(GSH-Px: Glutathione Peroxidase) 활성도
카탈라아제(Catalase) 활성도
항산화능
혈장 FRAP(Ferric Reducing Ability of
plasma)
혈장 TAS(Randox-total Antioxidant Status)
글루타티온 수준
(GSH/GSSG)
글루타티온 수준(GSH/GSSG)
< J Korean Soc. Food Sci Nutr 39(3): 343-349, 2010 >
 간기능 개선
바이오마커
혈청효소시험-AP, 5´-NT, γ-GT, AST, ALT, LDH, OCT, SDH
간배설시험
간의 화학적 구성성분의 변화
간기능개선의 조직학적 분석
< J Korean Soc. Food Sci Nutr 38(5): 561-568, 2009 >
 장건강
측정항목
장 기능 조절
배변활동능
< 한국잠사학회지, 41: 29-35 >
바이오마커
장내 세균 동정 및 세균수 측정법
MPO(Myeloperoxidase) activity
Histopathologic change test
변의 중량과 수분량
소화관 운동 능(장관 통과시간)
 면역 관련
측정항목
바이오마커
면역관련
장기무게 및
세포수
비장, 흉선 임파절의 무게
비장세포수, 흉선세포수, 복강세포수
세포성 면역반응
T임파구 증식능
혼합 임파구 반응에 의한 증식능
비장세포의 싸이토카인 생성능
체액성 면역반응
B임파구 증식능
항체 용혈반 생성 세포수
혈청내의 항원 특이항체
대식세포의
활성화
복강대식세포의 nitric oxide와 TNF-α 생성능
혈중 대식세포의 탐식능
자연살해 세포의
활성능
자연살해세포의 활성능
감사합니다