Transcript 활성소재 선발 - 한국식품면역연구회

천연물로부터
식품알레르기 제어소재 선발
손동화, 류충호
(한국식품연구원, 경상대식공과)
2010.2.26 삼성병원
식품면역연구회
실험배경 및 중요성
 최근 알레르기(아토피피부염, 알레르기성비염, 천식, 식품알레르기 등) 환자증가
심각한 사회문제로 대두, 소아에게 많이 발증되는 식품알레르기 대응방안 필요
알레르기 발증 과정
1) 알레르겐 체내침입
2) Th2 면역반응유도 → IL-4
등 분비 → IgE 항체생산
→ 아토피상태 [제1단계]
3) 재침한 항원이 IgE 항체와 결합 → mast cell 자극
→
탈과립유발 → 혈관확장, 호산구 등 세포이동
및 작용 → 알레르기성 염증반응유발 [제2단계]
각 발증단계 조절하는 활성물질발굴
및 이를 복합적으로 활용하는 종합적 대응방안 필요
 근년, 삶의 질을 현저히 떨어뜨리는 알레르기 (아토피피부염, 알레
르기성
비염, 천식, 식품알레르기 등)는 사회적인 문제가 되고 있음.
 미국에서는 5,000만명이 알레르기 질환을 갖고 있음 (의약품시장
$52억).
 21세기에 주류 치료제는 알레르기와 당뇨에 대한 것임 (닛케이산
쿄신문).
 일본의 알레르기 의약품시장: 1,560억엔, 기능성식품시장: 약 600
억엔임.
 국내의 의약품시장: 500억원의, 기능성식품시장: 150억원으로 추
정됨.
 최근 일본 기능성식품의 특허출원, 1위: “항비만”, 2위: “항알레르
기”임.
 향후 높은 부가가치가 기대됨.
 기존 연구에서는 단일소재의 단일활성에 대한 항알레르기 연구가
주류이나
 선발을 위하여 다양한 소재들의 여러활성을 입체적으로 검토해
야 함.
연구의 필요성
연구목표 및 내용
천연물 및 식품으로부터 식품알레르겐의 소장통과 및 알레
르기 발증을 조절할 수 있는 물질들을 탐색하고, 유용성분을
활용하여 알레르기억제 기능성 식품소재를 개발
연구목표
항알레르기
활성소재 6종
이상 선발
연구내용 및 범위
- 3종 활성시험계 이용한 활성소재 선발
(1) 알레르겐의 소장통과 제어계
In vitro Caco-2 monolayer
(2) IL-4 (Th2 cytokine) 생산 제어계
Ex vivo Murine spleen cell
(3) 염증(탈과립) 억제 시험계
In vitro RBL-2H3 cell
연구방법
○ 시료: 식품 및 천연물 106종 (1g) + 50% EtOH(25ml)  microwave
(90w, 5min)  증발농축  최종 5mL로 조절  막여과후 활성시험
“발증단계별 조절 활성 측정”
알레르겐의 장 상피세포층 통과억제 소재선발
In vitro Caco-2 monolayer 이용
○ 목적: 식품알레르기 발증 전 단계인 알레르겐 체내흡수를 제어하는 활성소재 발굴을 위해 소장
환경과 유사한 실험계를 활용
○ 활성시험: Transwell 상에서 2~3주간 Caco-2 cell 배양
 monolayer 형성 확인
 상층부(0.5mL)에 시료(10uL) 첨가
 1시간 후 알레르겐(OVA)과 bile salt(150ug/mL) 첨가
 3시간 후 TEER측정/ 하층부(1.5mL)의 OVA측정
by ELISA
*TEER: 세포층이 가지는 전기적 저항치/장상피세포 간극의 건전성 지표로 활용
○ [Rel. Reflux < 20%] & [Rel.TEER >100%]  #4, 17, 54, 78, 101, 103 (IC50 < 10ug/mL) /#14, 63, 104
IL-4 생산억제 활성소재선발
감작생쥐 비장세포배양계 이용
○ 목적: 알레르기 발증의 제1단계 (Th2반응에 의한 아토피상태로의 발전)를 제어하는 활성소재 발굴
○ 활성시험: Ex vivo 비장세포배양
BALB/c생쥐, 암컷(5주령)  1주후: OM(50ug)을 alum(2mg)과 함께 2주간격 2차례 복강면역하여
알레르기유발  1주후 비장세포 배양: 항원 존재하에 소재추출물을 첨가  3일후 상징액 중 IL-4
분석(ELISA)
○ IL-4 생산억제 70% 이상  #2, 7, 79, 98 (IC50=~10ug/ml) / #16, 23, 35, 47, 48, 78, 101, 103
탈과립억제 활성소재선발
RBL-2H3 세포배양계 이용
○ 목적: 알레르기 발증의 제2단계 (항원자극에 의한 탈과립으로 유도되는 염증반응) 제어소재의 발굴
○ 활성시험: In vitro RBL-2H3 세포주 배양
○ Histamine 유리억제 활성시험
24well에 seeding  하룻밤후: 소재추출물 처리
회수  Histamine 정량 (by ELISA)
 1시간후: 자극제(A23187+PMA) 처리  8시간후: 배양액
○ β-hexosaminidase 유리억제 활성시험
24well에 seeding, 0.5 ug/ml anti-DNP IgE 첨가  하룻밤 배양  Siraganian 완충액으로 세척  소재추출물
10 ㎕를 첨가  DNP-HSA (1㎍/ml) 20㎕를 첨가  상징액 회수  β-hexosaminidase의 활성 측정 (A405)
Histamine 분비억제 활성
Sample No.
○ Histamine 유리억제 50% 이상  #5, 7, 49 (IC50=~50ug/ml) / #33, 42, 61, 66, 67, 79, 83, 100, 101, 105, 106
○ β-hexosaminidase 유리억제 40% 이상  #5, 83, 101, 106/ #7, 21, 49, 57, 61, 66, 79, 87, 100, 105
○ 결과: 두 활성간에 상관성 높음
알레르기 억제활성 (종합)
○ 입체적인 활성소재의 비활성 파악에 용이
○ 혼합을 위한 기본소재의 선발에 활용
활성소재 선발
○ 우선 선발기준:
- 3종의 활성시험에서 높은 활성을 나타낸 것
- 식품 소재를 중심으로 선발
- 독성의 문제가 있는 것은 제외
 9종 선발
○ 활성 특성비교:
활성시험 결과
알레르겐의 장상피
세포층 통과저해
IL-4생산 저해
탈과립 저해
점수 합계
#4
+++
+
+
5+
#5
+
+
+++
5+
#16
+++
+++
++
8+
#33
++
++
++
6+
#35
++
++
+
5+
#86
++
++
++
6+
#98
++
+++
++
7+
#101
+++
++
++
7+
++
+++
5+
#106
선발소재혼합(1:1)에 의한 상승작용
○ IL-4생산 억제활성에 미치는 영향 (Fig.)
혼합에 의한 상승작용 확인 처리구: (36)  (13개)
상승작용에 관여하는 중요 활성소재: (4개) #33, #86, #98, #106
단독 (9)
1:1혼합 (36)
○ Ex vivo 결과 종합
○ 소재(9종): #4, #5, #16, #33, #35, #86, #98, #101, #106
활성 종류
우수 활성소재
1:1혼합  상승작용 [일부Data 생략]
소장통과 억제활성:
#4, #16, #101
#4, #16, #35
IL-4생산 억제활성:
#16, #98
#86, #106, #98, #33
탈과립 억제활성:
#5, #106
#5, #101, #16, #98
요약 / 결론
106점의 식품 및 천연물로부터 알레르기 제어 관련 3종의 활성시험을 도입하여 활
성을 측정하고 이들 소재가 가지는 활성을 입체적, 상대적으로 비교함으로써 9종의
활성소재를 우선 선발.
(1) 알레르겐의 소장상피세포 통과 억제 활성소재 :
감초 등
(2) Th1/Th2 면역반응 (제1단계 알레르기 발증관련) 제어에 관여하는 IL-4생산억제 활성소재 2종:
녹차 등
(3) 알레르기성 염증반응 (제2단계 알레르기 발증관련) 제어에 관여하는 탈과립억제 활성소재 2종:
강황 등
* 그 외에 여러 활성이 고르게 높은 활성소재:
민들래 등
 선발소재 9종 추출물을 혼합(1:1)시 상승작용을 나타내는 소재 확인.
 혼합물을 항알레르기 소재로 활용가능