Transcript Analyse des lipides par chromatographie en phase gazeuse masse (GC-MS)

Analyse des lipides par
chromatographie en phase gazeuse
couplée à la spectrométrie de
masse (GC-MS)
Par Helena ALVES- REMY
NAMC, équipe communication chimique
CNRS, UMR 8620
Université Paris Sud, bât 446
ORSAY.
Octobre 2004
LIPIDES
Définition : Molécules insolubles dans l’eau,
mais solubles dans les solvants organiques
non polaires comme l’éther, le chloroforme, le
méthanol ou le cyclohexane.
Lipides simples :
•
•
•
•
•
•
•
•
Alcools, aldéhydes, acides, esters gras
Acylglycérols (MG, DG, TG)
Stérols
Hydrocarbures (alcanes, alcènes, ß-carotène,..)
Quinones (vit. K, coenzyme Q)
Céramides
Cires
Lipides aminés (dopamine,…)
Lipides complexes :
• Phospholipides (PE, PI, PC, PS, SM, …)
• Glycolipides (groupes sanguins,…)
Mise en évidence des différentes
classes de lipides
Chromatographie sur Couche Mince (CCM)
ou Thin Layer Chromatography (TLC)
Chromatographie
Définition:
Méthode de séparation des constituants d’un
mélange qui utilise deux phases non miscibles:
• Une phase stationnaire qui établit des liaisons +/fortes avec les molécules à séparer
• Une phase mobile qui entraîne et décroche les
molécules retenues sur la phase stationnaire.
CCM lipides
16 cm
• Phase stationnaire = Gel de silice
• Phase mobile = 4 mélanges de
solvants différents
8 cm
Migration
4 cm
• Visualisation des spots: sous UV
après vaporisation de Primuline.
Rf:
Distance parcourue par le lipide
dépôt
éch
T
Distance parcourue par le front solvant
Lipides totaux transportés par la lipophorine
• Lipophorine: lipoprotéine hémolymphatique
spécialisée dans le transport des lipides chez
les insectes.
• Lipides totaux extraits par un mélange
Méthanol – Chloroforme (1:2, v/v).
Lipides transportés
par la lipophorine
16 cm
Hydrocarbures
CH - (CH )n - CH 3
3
2
8 cm
CH - (CH )n - CH = CH- (CH )n- CH
3
4 cm
dépôt
Lipo T
2
2
3
16 cm
Hydrocarbures
Lipides transportés
par la lipophorine
Triglycérides
CH
O
C R
CH
O
C
8 cm
4 cm
dépôt
Lipo T
O
O
2
R C O CH
2
O
1
R3
Lipides transportés
par la lipophorine
16 cm
Hydrocarbures
Triglycérides
AGL
O
8 cm
4 cm
R
C
OH
dépôt
Lipo T
16 cm
Hydrocarbures
Lipides transportés
par la lipophorine
Triglycérides
AGL
8 cm
DG 1,3
CH
2
HO CH
4 cm
CH
dépôt
Lipo T
2
O
O
C
R
O
O C R
DG 1,3
1
2
Lipides transportés
par la lipophorine
16 cm
Hydrocarbures
Triglycérides
AGL
8 cm
4 cm
dépôt
Lipo T
DG 1,3
DG 1,2
R
2
CH
O
CH
OH
O
2
C O CH
2
O
C
DG 1,2
R
1
Lipides transportés
par la lipophorine
16 cm
Hydrocarbures
Triglycérides
AGL
8 cm
DG 1,3
DG 1,2
Stérols
Sitostérol
4 cm
HO
dépôt
Lipo T
16 cm
Hydrocarbures
Lipides transportés
par la lipophorine
Triglycérides
AGL
8 cm
4 cm
dépôt
Lipo T
DG 1,3
DG 1,2
Stérols
MG
O
CH O C R
2
CHOH
CH OH
2
16 cm
Hydrocarbures
Lipides transportés
par la lipophorine
Triglycérides
AGL
8 cm
4 cm
dépôt
Lipo T
DG 1,3
DG 1,2
Stérols
MG
PE
O
C R
CH O
O
1
2
R C O CH
2
O
CH O P O CH CH NH
2
2
2
2
O-
PE
Lipides transportés
par la lipophorine
16 cm
Hydrocarbures
Triglycérides
AGL
8 cm
4 cm
dépôt
Lipo T
DG 1,3
DG 1,2
Stérols
MG
PE
PC
O
R
2
O
C
CH
O
CH
2
O
C
R
1
CH
O
CH O P O CH CH
2
2
2
O
PC
+
N
3
CH
3
CH
3
Identification individuelle de chaque lipide
Chromatographie en phase gazeuse couplée à
la spectrométrie de masse ou GC-MS
Chromatographie en phase gazeuse ou CPG:
• Phase mobile = éluant gazeux inerte (He, H2,
N2) qui entraîne le mélange à analyser.
• Phase stationnaire, fixée sur un support inerte,
retient +/- les constituants du mélange.
Injection à haute température
CPG s’applique aux gaz et aux composés susceptibles
d’être vaporisés sans décomposition à haute température
échantillon liquide
Septum en méthyl-silicone
Cartouche
chauffante
Gaz vecteur
Zone chauffée - 300°C
Thermocouple
Liner
Colonne
Réactions de dérivation des lipides
Alkylation; Silylation
En masquant les fonctions polaires, elles
permettent d'augmenter:
• la volatilité
• la stabilité
• la détectabilité
Alkylation:
réduit la polarité des lipides en remplaçant
les H actifs par des groupements alkyles
O
R
C
OH
Acide gras
+
CH3 OH
KOH
BF3
O
R
C
O
CH
3
Ester méthylique
Silylation:
réduit la polarité des lipides en remplaçant
les H actifs par des groupements triméthylsilyl ou tertbutyl-diméthyl-silyl (t-BDMS)
O
t-BDMCS
O
R
C
OH
Acide gras
+
MTBSTFA
1H, 60°C
R
CH CH3
3
C
O
Si
C
CH 3
CH3 CH 3
Dérivé t-BDMS
Séparation des lipides dans la colonne capillaire
Colonne
Mélange
à séparer
Gaz vecteur
Phase stationnaire
0 t0
t1
t2
t3
Temps d'analyse
= Temps de rétention
Phase stationnaire
Phase stationnaire apolaire de type BP-X5 = Polymethylphenylsiloxanes
5% diphényl
95% diméthyl polysiloxane
BPX5
CH 3
CH 3
Si
CH 3
CH 3
O
Si
CH 3
CH 3
O
CH 3
Séparation en fonction de:
Si
CH 3
....... O
Si
O
Si
O ......
CH 3
- la polarité (intéractions hydrophobes)
- la masse molaire
- la température
Le détecteur de masse
Source
Signal
ions
ions
Molécules
Système dispersif
Fente d'entrée
Détecteur
Fente de sortie
Source d'ions: ionisation des molécules et fragmentation des ions
Système dispersif: séparation des ions suivant leur rapport masse / charge
Détecteur: mesure l'abondance relative de chaque ion
Spectre
Analyse des lipides par GC-MS
Lipides silylés
Interface
350°C
Pompage du vide
Injecteur splitless
300°C
Four
Source
d'ions
EI +
Helium
15 psi
300 °C
Photo multiplicateur
d'é
m/z 30-800 Da
Detecteur de masse M D-800
GC 8000
Colonne capillaire
BP- X5, L=30m
Analyseur
quadripolaire
100 à 200°C avec 10°/min
200 à 360°C avec 10°/min
30 min à 360°C
identification de x
Spectre de masse du composé x
Chromatogramme
Acquisition et
traitement des
données
(MassLab)
Principe d'une source à impact électronique
70 eV
1 mA
Filament
Lentilles de focalisation
Bloc source
300°C
Introduction
échantillon
eAnalyseur
Ions
Repousseur
Trappe
Electrons cibles de l’impact électronique
• Électron arraché, par ordre de préférence:
• 1) électron des doublets n (O, N, …)
• 2) électron Π (double liaison)
• 3) électron σ
• Réarrangements moléculaires
• Rupture de liaisons
• Les fragments chargés + sont détectés.
Filtre de masse quadripolaire
2 paires de barres
conductrices, isolées
connectées 2 par 2
Ions stables
m/z donné
Source
Ions
Détecteur
Champ électrostatique
qui fait osciller les ions
+U +V cos (wt)
Voltage continu + , Voltage alternatif
-U -V cos (wt)
Voltage continu - , Voltage alternatif
Analyse des lipides par GC-MS
Lipides silylés
Interface
350°C
Pompage du vide
Injecteur splitless
300°C
Four
Source
d'ions
EI +
Helium
15 psi
300 °C
Photo multiplicateur
d'é
m/z 30-800 Da
Detecteur de masse M D-800
GC 8000
Colonne capillaire
BP- X5, L=30m
Analyseur
quadripolaire
100 à 200°C avec 10°/min
200 à 360°C avec 10°/min
30 min à 360°C
identification de x
Spectre de masse du composé x
Chromatogramme
Acquisition et
traitement des
données
(MassLab)
Séparation et identification des lipides transportés par la lipophorine par GC-MS
femelle âgée de 4 jours
100
Tricaprine - SI
Hydrocarbures
MG
AGL
50.69
16:0-16:1
14:0- 16:1- 14:0
14:0 x3
12:0- 14:0 X2
62.76
18:0-18:0
12:0 x3
16:0-16:1
16:0-18:1
16:0-18:0
16:0-18:1
14:0-14:0 1,3
12:0-14:0 1,3
51.27
57.27
12:0 x2- 14:0
12:0-12:0 1,2
7,11-ND
Stérols
47.77
14:0-14:1
33.29
12:0-14:1
29.21
43.37
33.40
Triacyl-sn-glycérols
54.09
12:0-12:0 1,3
C18:0
C18:2
20.30
C25:0
24.49
C23:0
C23:1
15.70
2MC28
C25:1
23.85
C27:1
C14:0
19.45
C27:0
C18:1
19.85
7,11-HD
28.73
14:0-16:1
C26:0-SI
2MC26
P lipides
27.32
C16:0
C16:1
47.18
46.97
%
C12:0
14:0-14:0 1,2
12:0-14:0 1,2
Diacyl-sn-glycérols
rt
0
15.000
20.000
25.000
30.000
35.000
40.000
45.000
50.000
55.000
60.000
65.000
70.000
75.000
Acides gras libres (AGL) avant dérivation :
C14:0
60 73
100
O
41
OH
43
55
%
129
57
185
69
.
M +
83
85 87
228
97
45
39
61
115
98
67
53
65
51
36
74
101
81
79
199
95
109
93
116 125
130
40
50
60
70
80
90
100
110
120
157
140 144 153
0
30
171
143
111
130
140
150
160
166
170
186
172
180
190
208
200
m/z
229
207
192
210
223
220
230
240
250
260
270
280
290
300
Esters méthyliques d’acides gras :
Ester méthylique de C18:0
74
100
H
+
O
87
R
+O
C
C
ML
O CH3
CH3
O
43
74
%
41
55
57
75
69
M
143
59
39
83
88
67
53
32
81
97
101
130
40
50
60
70
80
90
100 110
120
130
298
255
129
111 115
60
199
144 157
171
185
181 186
170
180
0
30
.+
140 150
160
190
200 213
200
210
227
220
230
241
242
240 250
256 267 269
260 270
280
m/z
299
290
300 310
320
330
340
350
360
370 380
390
400
AGL après silylation :
M-57
285
M-57
100
O
Si
O
C
75
131
%
286
129
131
73
117
43
287
57
41
115
55
39
59 69
76
95
93
171
99 105
47
118
143
157 159 172
185 187
207
213
227
288
241 243 255 269
299
0
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
M-15 +
.
M
327
342
325
320
328
m/z
341
340
360
380
400
420
440
460
Standard de distéarine après silylation
B+
C18:0
341
100
C18:0
tBDMS
M-57
681
%
43 5 7
+
+
131
55
73
41
75
69
A
171
455
342
267
129
83 8 5
C
683
117
97
98
147
185
4 15
339 343
231
299
355
416
454 4 5 6
4 69
684
606
676
685
m/z
0
40
60
80
1 0 0 1 2 0 1 4 0 1 6 0 1 8 0 2 0 0 2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0 3 0 0 3 2 0 3 4 0 3 6 0 3 8 0 4 0 0 4 2 0 4 4 0 4 6 0 4 8 0 5 0 0 5 2 0 5 4 0 5 6 0 5 8 0 6 0 0 6 2 0 6 4 0 6 6 0 680 7 0 0 7 2 0 7 4 0 7 6 0 7 8 0 8 0 0
Spectre de la tricaprine
A+
C10:0
155
100
C10:0
+
C
C10:0
383
B+
%
229
57
43
41
39
71
55
69
67
85
84
73
270
227
98
156
11 2
86
116 137
159
283
185
230
196
213
2 4 1 255
272
384
339
171
297 3 1 1
325
369
340 3 5 3
370
385
m/z
424
452
0
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
420
440
460
480
500
520
540
560
TG composé de 3 AG différents
C14:0
C+
523
C16:1
100
C16:0
57
+
C+
A
+ 236 B+ +
A
+
B
A
55
%
69
83
95
98
81
311
85
41
67
109
111
B
135 1 3 7
520
524
157
53
193
171
221
185
309
240
194
549
+
339
151
39
C+
211 239 285 313
71
43
521
423
367
326
354
295
42 1
39 5
365
381
495
424
409
451
551
477
505
525
552
0
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
380
400
420
440
460
480
500
520
540
560
m/z
564 577 592 609
580
600
620
637
640
688
660
680
Mécanismes de fragmentation des acyl-sn-glycérols:
Formation des ions A +
+
+
Formation des ions B et C
.
O
.
H
O
R1
R2 OC
O
O
+.
O
O
R3
.
R2 - COO. (ou tBDMSO )
O
R1
O
+
(R3 - CH2 )
C
M - R 2COO
O H
+
R 3 CO
O
+
R1
O
OH
+
B
R1 COOH +57
1,3-dimyristine
M - 57
C14:0
569
100
C
Si
O
57
C14:0
43
+
A
B
211
285
%
55
41
567
+
71 73
69
75
C+
85
95 97
67
131
109
39
147
44
149
283
359
171
183 191
236
0
40
60
80
100
120
140
160
180
200
286
212
220
287
2 3 9 257
240
260
280
300
320
339
413
360
340
360
C'
399
359
3 1 3 326
570
380
400
420
451
440
460
492
480
494
571
495
500
520
m/z
572
540
560
580
600
620
640
660
680
1,2-dimyristine
B+
C14:0
285
100
C14:0
M-57
M - 57
569
O Si
%
A+
C+
57
43
131
73
41
75
67
211
83 95 115
171
129
283
236
147 149
44
191
212
237
567
287
339
359
311 326
269
395
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
300
320
340
360
421
383
380
m/z
571
400
0
40
570
399
286
400
420
423
440
451
460
477
480
494 495 520
500
520
549
540
565
572
560
580
611 613
600
620
640
660
680
700
C
Hydrocarbures ramifiés:
Formation de carbocations secondaires
M + =338
85
100
57
+
71
+
ions détectés
m/z 168
m/z 196
43
99
%
168
113
97
196
55
111
69
83
140
169
125
96
82
54
58
72
81
95
109
124
60
80
138
100
120
147
140
323
224
154
133
197
155
139
110
86
0
40
M-15
127
166
160
170 183 195
180
211
200
238 239
220
240
253
266
260
294
280
300
309 322
320
324
341
340
m/z
355
360
380
400
420
440
Localisation des doubles liaisons:
dérivation au DMDS
C C
CH3 S S CH3
DMDS
CH3 S
C C
I2
S CH3
Spectre du 7-pentacosène
7-pentacosène
100
299
145
+.
S
CH3
299
CH3 (CH2)5 CH
CH
43
55
61
41
97
83
3
444
146
95
301
147
109 111
47
283
129
157
173
199
213 227
0
40
M+2SCH
300
69
81
32
CH3
+ .S
145
%
(CH2)16
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
302
250 271
260
397
280
300
355
311 325 348
381
320
380
340
360
m/z
445
398
400
420
440
460
480
500
520
540
560
CH3
Phéromones chez Drosophila melanogaster
Femelle
 7,11 Heptacosadiene
1
7
8
11
12
27
CH3-(CH2)5-CH=CH-(CH2)2-CH=CH-(CH2)14-CH3
 5,9 Heptacosadiene
1
5
6
9
10
27
CH3-(CH2)3-CH=CH-(CH2)2-CH=CH-(CH2)16-CH3
Phéromones chez Drosophila melanogaster
Mâle
 7 Tricosene
1
7
8
23
CH3-(CH2)5-CH=CH-(CH2)14-CH3
 7 Pentacosene
1
7
8
25
CH3-(CH2)5-CH=CH-(CH2)16-CH3
Cis-vaccenyl acetate
1
7
8
18
CH3-(CH2)5-CH=CH-(CH2)9-CH2-O-C-CH3
O
Identification des phospholipides
• 1) identification du type de PL par CCM grâce
à la co-migration de standards
• 2) identification des AG estérifiés par GC-MS
Lipides transportés
par la lipophorine
16 cm
Hydrocarbures
Triglycérides
AGL
8 cm
4 cm
dépôt
Lipo T
DG 1,3
DG 1,2
Stérols
MG
PE
PC
O
R
2
O
C
CH
O
CH
2
O
C
R
1
CH
O
CH O P O CH CH
2
2
2
O
PC
+
N
3
CH
3
CH
3
53.403
X30
%
56.790
PL 16:0- 18:0
PC
PL 16:0- 18:1
100
PL 16:0- 16:1
Analyse des spots correspondant à PE et à PC
par GC-MS
56.555
54.516
0
PL 16:0- 18:2
PL 16:0- 18:1
PL 16:0- 18:0
53.765
PE
PL 16:0- 16:1
100
%
56.822
rt
0
48.000
49.000
50.000
51.000
52.000
53.000
54.000
55.000
56.000
57.000
58.000
59.000
L’analyse des lipides par GC-MS permet :
• d’identifier les AG libres
• d’identifier les AG estérifiés dans les MG, DG,
TG et PL
• de distinguer entre DG 1,2 et 1,3
• d’identifier les hydrocarbures
• de localiser la position d’une ramification
• de localiser la position d’une double liaison
• d’identifier les stérols