Transcript Document 7665720

ภาควิชาเคมี คณะวิทยาศาสตร์
จุฬาลงกรณ์มหาวิทยาลัย
ผศ.ส ุชาดา จูอน ุวัฒนก ุล
Luminescence Spectroscopy
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Luminescence Spectroscopy
Molecular Fluorescence Spectroscopy
Fluorescent Species
Effect of Concentration Fluorescence Intensity
Fluorescence Instruments
Applications of Fluorescence Methods
Molecular Phosphorescence Spectroscopy
Chemiluminescence Methods
Luminescence Spectroscopy
Luminescence แบ่งเป็ น
1. Photoluminescence
เป็ น emission process ทีเ่ กิดจากอะตอมหรือโมเลกุลถูก
กระตุ ้นโดยการดู ด กลืน รั ง ส ีแ ม่ เ หล็ ก ไฟฟ้ า แล ้วกลั บ สู่ ground
state โดยปล่อยพลังงานสว่ นเกินในรูปของโฟตอน ถ ้า emission
้
process เกิดขึน
้ เกือบทันที ใชเวลา
10-5 วินาที หรือน ้อยกว่า
เรีย กว่า การวาวแสง หรือ ฟลูอ อเรสเซนซ ์ (fluorescence)
้
และถ ้า emission process ใชเวลาในการเกิ
ดมาก เป็ นนาทีหรือ
ชั่ ว โ ม ง เ รี ย ก ว่ า ก า ร เ รื อ ง แ ส ง ห รื อ ฟ อ ส ฟ อ เ ร ส เ ซ น ซ ์
(phosphorescence)
้
fluorescence ใชในการวิ
เคราะห์ทางเคมีมากกว่า phosphorescence
Luminescence Spectroscopy
2. Chemiluminescence
เป็ น emission process ทีเ่ กิดจากอะตอมหรือโมเลกุลถูกกระตุ ้น
โดยปฏิกริ ย
ิ าเคมี แล ้วกลับสู่ ground state โดยปล่อยพลังงาน
สว่ นเกินในรูปของโฟตอน
ในบางกรณี อะตอมหรือโมเลกุลทีถ
่ ก
ู กระตุ ้นเป็ นผลิตภัณ ฑ์ของ
ปฏิกริ ย
ิ าระหว่าง analyte
กับรีเอเจนต์ทเี่ หมาะสม (โดยปกติใช ้
่ ozone หรือ peroxide) สเปกตรัมทีไ่ ด ้จึงเกิด
strong oxidant เชน
่ อง analyte เอง
จากการปล่อยพลังงานของผลิตภัณฑ์ ไม่ใชข
นอกจากนี้ analyte
อาจไม่เกีย
่ วข ้องใน chemiluminescent
reaction โดยตรง แต่เร่งหรือยับยัง้ การเกิด chemiluminescence
ในทีน
่ ส
ี้ ว่ นใหญ่จะกล่าวถึง molecular fluorescence
Luminescence Spectroscopy
ข้อดีของ luminescence methods เมือ
่ เทียบก ับ
absorption methods
 sensitivity สูงกว่า 1-3 เท่า (detection limit ตา่ กว่า 1-3 เท่า)
 linear concentration range กว ้างกว่า
 selectivity  absorption methods
อย่างไรก็ด ี luminescence methods ใชกั้ นไม่กว ้างขวางนัก
เพราะ chemical systems ทีใ่ ห ้ luminescence มีจากัด
Molecular Fluorescence Spectroscopy
molecular fluorescence spectroscopy ทาโดยการกระตุ ้น
ตั ว อย่ า งด ว้ ยรั ง ส ี ท ี่ ค วามยาวคลื่ น ที่ เ กิด การดู ด กลื น เรี ย กว่ า
ี เี่ ปล่ง
absorption หรือ excitation wavelength และวัดรังสท
่
ออกมาทีค
่ วามยาวคลืน
่ ซงึ่ เรียกว่า emission wavelength เชน
ี ี่ 350 nm และให ้ฟลูออเรส
ควินน
ิ (quinine) สามารถดูดกลืนรังสท
เซนซโ์ ดยปล่อยพลังงานสูงสุดทีค
่ วามยาวคลืน
่ 460 nm
Molecular Fluorescence Spectroscopy
รูปที่ 1 Excitation และ emission spectrum ของควินน
ิ
vibrational
relaxation internal
(10-13 s) conversion
(10-6 - 10-9 s)
S2
fluorescence
S1
Energy
S0
Intersystem
crossing
absorption
(10-14-10-15s)
2
1
T1
Internal
conversion
external
conversion
Phosphorescence
(10- 4 - 10 s)
3
4
รูปที่ 2 Energy-Level Diagrams for Photoluminescent Molecules
S0
- ground electronic singlet state
S1, S2 - first and second excited electronic singlet state
T1
- first excited electronic triplet state
Molecular Fluorescence Spectroscopy
molecular fluorescence bands สว่ นใหญ่ประกอบด ้วย lines
ที่ม ีค วามยาวคลื่น มากกว่ า ความยาวคลื่ น ของรั ง ส ีท ี่ ถู ก ดู ด กลื น
เพือ
่ ให ้เกิด excitation
เรียกการเลือ
่ นทีข
่ องความยาวคลืน
่ นี้ ว่า
Stokes shift
เนือ
่ งจากผลต่างของพลังงานระหว่าง vibrational states ทัง้ ใน
ground และ excited states มีคา่ ใกล ้เคียงกัน absorption
spectrum
หรือ excitation
spectrum
และ fluorescence
spectrum ของสารประกอบจึงอาจมีลักษณะเป็ น mirror images
้
ของกัน และกัน (ดั ง รูป ที่ 3)
และซ อนกั
น ที่ค วามยาวคลื่น ที่
สอดคล ้องกับการเปลีย
่ นระดับพลังงานระหว่าง vibrational level 0
ของ E1 กับ vibrational level 0 ของ E0
Molecular Fluorescence Spectroscopy
รูปที่ 3 Excitation และ emission spectrum ของสาร
ซงึ่ มีลก
ั ษณะเป็ น mirror images กัน
Fluorescent Species
จากรูปที่ 3 จะเห็นได ้ว่าฟลูออเรสเซนซเ์ ป็ นกระบวนการหนึง่ ใน
หลายกระบวนการ ทีโ่ มเลกุลกลับสู่ ground state หลังจากทีถ
่ ก
ู
กระตุ ้นโดยการดูดกลืนรังส ี โมเลกุลทีด
่ ูดกลืนรังสไี ด ้ทุกชนิดจึงมี
โอกาสที่จ ะให ้ฟลู อ อเรสเซนซ ์ไ ด ้ แต่ โ มเลกุ ล ส่ ว นใหญ่ ไ ม่ ใ ห ้
ฟลูอ อเรสเซนซ ์ เนื่ อ งจากโครงสร ้างของโมเลกุล เหล่า นี้ ท าให ้
radiationless relaxation เกิดขึน
้ ด ้วยอัตราทีส
่ งู กว่า fluorescence
emission
โ ม เ ล กุ ล จ ะ มี ป ร ะ ส ิ ท ธิ ภ า พ เ ช ิ ง ค ว อ น ต ม
ั (quantum
์ ากน ้อยเพียงใด อธิบาย
efficiency) ในการให ้ฟลูออเรสเซนซม
ได ้ด ้วย ผลได้เชงิ ควอนต ัม (quantum yield)
Fluorescent Species
quantum yield ของ molecular fluorescence (F)
จานวนโมเลกุลทีใ่ ห ้ฟลูออเรสเซนซ ์
=
จานวนโมเลกุลทีถ
่ ก
ู กระตุ ้น
จานวนโฟตอนทีถ
่ ก
ู คายออกมา
=
จานวนโฟตอนทีถ
่ ก
ู ดูดกลืน
kF
=
kF + knr
kF = ค่าคงทีอ
่ ต
ั ราเร็วของ fluorescence relaxation
knr = ค่าคงทีอ
่ ต
ั ราเร็วของ nonradiative relaxation
Fluorescent Species
่ ฟลูออเรสซน
ี (fluorescein)
 โมเลกุลทีใ่ ห ้ฟลูออเรสเซนซไ์ ด ้ดี เชน
มี quantum yield ใกล ้เคียง 1
์ ี quantum yield = 0
 สารทีไ่ ม่ให ้ฟลูออเรสเซนซม
Fluorescent Species
Fluorescence and Structure
์ ว่ นใหญ่ม ี aromatic rings
 สารประกอบทีใ่ ห ้ฟลูออเรสเซนซส
 aliphatic และ alicyclic carbonyl compounds บางชนิดโดย
เฉพาะอย่างยิง่ เมือ
่ มี conjugate double-bonds ให ้ฟลูออเรส
เซนซไ์ ด ้
 unsubstituted aromatic hydrocarbons ในสารละลายให ้
ฟลูออเรสเซนซ ์ และ quantum efficiency เพิม
่ ขึน
้ เมือ
่ จานวน
rings และ degree of condensation เพิม
่ ขึน
้
Fluorescent Species
่
 heterocyclic compounds อย่างง่าย ไม่ให ้ฟลูออเรสเซนซ ์ เชน
N
O
pyridine
furan
S
thiophene
H
N
pyrrole
แต่ fused-ring structures ทีม
่ ี rings เหล่านี้ ให ้ฟลูออเรสเซนซ ์
N
quinoline
N
isoquinoline
H
N
indole
Fluorescent Species
 การแทนทีบ
่ น aromatic rings ทาให ้เกิด
การเลือ
่ นทีข
่ องความยาวคลืน
่ ทีม
่ ก
ี ารดูดกลืนสูงสุด
 การเปลีย
่ นแปลงของ fluorescence peaks
 การเปลีย
่ นแปลง fluorescence efficiency
(ดูตารางที่ )
Fluorescent Species
ตารางที่ 1 ผลของการแทนทีบ
่ น benzene rings ต่อฟลูออเรสเซนซ ์
สารประกอบ
สูตร
ความยาวคลืน
่ ของ
fluorescence
Intensity ของ
fluorescence
benzene
C6 H 6
270-310
10
toluene
C6H5CH3
270-320
17
propylbenzene
C6 H 5 C3 H 7
270-320
17
fluorobenzene
C6 H 5 F
270-320
10
chlorobenzene
C6H5Cl
275-345
7
bromobenzene
C6H5Br
290-380
5
iodobenzene
C6 H 5 I
-
0
phenol
C6H5OH
285-365
18
phenolate ion
C6H5O-
310-400
10
Fluorescent Species
Effect of Structural Rigidity
จากการทดลองพบว่า rigid molecule ให ้ฟลูออเรสเซนซไ์ ด ้ดี
โดย rigidity จะลดอัตราการเกิด nonradiative relaxation ลง
่
จนถึงจุดทีเ่ กิด relaxation โดยฟลูออเรสเซนซ ์ เชน
ั บนพืน
 fluorescing dyes ทีถ
่ ก
ู ดูดซบ
้ ผิวของของแข็ง จะให ้
ั ของของแข็งทา
ฟลูออเรสเซนซไ์ ด ้เพิม
่ ขึน
้ เนือ
่ งจากการดูดซบ
ให ้ rigidity เพิม
่ ขึน
้
Fluorescent Species
 fluorene (ซงึ่ โมเลกุล rigid เนือ
่ งจากมี methylene group ยึด
benzene rings ทัง้ สองไว ้) มี quantum efficiency ใกล ้เคียง 1
สว่ น biphenyl (ซงึ่ benzene rings ในโมเลกุลหมุนได ้อย่าง
อิสระ) มี quantum efficiency เท่ากับ 0.2
fluorene
1
biphenyl
 = 0.2
รูปที่ 4 ผลของ rigidity ต่อ quantum yield.
Fluorescent Species
 Zn–(8-hydroxyquinoline) complex (หรือ chelate) ให ้ฟลูออ
์ ม
เรสเซนซท
ี่ ค
ี วามเข ้ม (intensity) สูงกว่า 8-hydroxyquinoline
(ซงึ่ เป็ นสารอินทรียก
์ อ
่ คีเลต) มาก เนือ
่ งจากคีเลตมี rigidity สูง
กว่า 8-hydroxyquinoline
O
OH
N
N
Zn
2
8-hydroxyquinoline
(nonfluorescing)
Zn-8-hydroxyquinoline
complex (fluorescing)
้
รูปที่ 5 ผลของ rigidity ต่อ quantum yield ของสารเชงิ ซอน
Fluorescent Species
Temperature and Solvent Effects
์ ะลดลง เมือ
 Quantum efficiency ของฟลูออเรสเซนซจ
่ อุณหภูม ิ
เพิม
่ ขึน
้ เนื่องจากทีอ
่ ณ
ุ หภูม ิ ความถีข
่ องการชนกันของโมเลกุล
จะเพิม
่ ขึน
้ ทาให ้เกิด nonradiative relaxation ได ้มากขึน
้
์ ะลดลง เมือ
 Quantum efficiency ของฟลูออเรสเซนซจ
่ ความ
หนืด (viscosity) ของตัวทาละลายลดลง ทาให ้ความถีข
่ องการ
ชนกันของโมเลกุลเพิม
่ ขึน
้ และเกิด nonradiative relaxation
ได ้มากขึน
้
Effect of Concentration of
Fluorescence Intensity
ั สว่ นกับกาลังการ
กาลังของ fluorescence radiation (F) เป็ นสด
แผ่รังส ี (radiant power) ของ excitation beam ทีถ
่ ก
ู ดูดกลืน
F = K (P0 - P)
(1)
P0 = กาลังของลาแสงทีต
่ กกระทบสารละลาย
K  = ค่าคงที่ ซงึ่ ขึน
้ กับ quantum efficiency ของ fluorescence
ั พันธ์ของ F กับความเข ้มข ้น c ของ fluorescing
เพือ
่ แสดงความสม
species เขียน Beer’s law ในรูป P/P0 = 10-bc
หรือ
P = P0 x 10-bc
 = molar absorptivity of fluorescing species
bc = absorbance (A)
(2)
Effect of Concentration of
Fluorescence Intensity
แทนค่า P จากสมการ (2) ลงในสมการ (1)
F = K  P0 (1 - 10-bc)
(–2.3bc)2
(–2.3bc)3
F = K  P0 2.3bc –
–
–…
2
3
(3)
(4)
เมือ
่ bc (A) < 0.05; 2.3bc จะมีคา่ มากกว่าเทอมอืน
่ ๆในวงเล็บมาก
ดังนัน
้
F = 2.3K bc P0
(5)
ี กกระทบมีคา่ คงที่ จะได ้
เมือ
่ กาลังของรังสต
F = Kc
ดังนัน
้ ถ ้า plot fluorescence power ของสารละลาย กับ ความ
้
เข ้มข ้นของสารละลาย จะได ้เสนตรงที
ค
่ วามเข ้มข ้นตา่
(6)
Effect of Concentration of
Fluorescence Intensity
เมือ
่ c มีคา่ มากขึน
้ จน A มากกว่า 0.05 (หรือ T น ้อยกว่า 0.9)
้
ความสัมพันธ์ระหว่าง F และ c ดังสมการ (6) จะไม่เป็ นเสนตรง
้
และ F อยู่ต่ า กว่า แนวเส นตรงที
่ล ากต่อ ออกมา ซ งึ่ เป็ นผลของ
ี กกระทบถูกดูดกลืนได ้มากจนให ้
primary absorption ซงึ่ รังสต
ั สว่ นกับความเข ้มข ้น ดังสมการ (4)
ฟลูออเรสเซนซไ์ ม่เป็ นสด
ทีค
่ วามเข ้มข ้นสูงมาก F จะมีค่าสูงสุดและเริม
่ ลดลงเมื่อเพิม
่
ความเข ้มข ้นเนือ
่ งจาก secondary absorption ซงึ่ ฟลูออเรส
์ เี่ ปล่งออกมาถูกดูดกลืนโดยโมเลกุลของ analyte โมเลกุล
เซนซท
อืน
่ ๆ
Effect of Concentration of
Fluorescence Intensity
Relative fluorescence
power, F
100
0
ความเข ้มข ้น , M x 107
รูปที่ 4
Calibration curve สาหรับการหาปริมาณ tryptophan
์ องตามนุษย์
ในโปรตีนทีล
่ ะลายน้ าได ้จากเลนสข
Effect of Concentration of
Fluorescence Intensity
นอกจากนี้ primary และ secondary absorption effects ซงึ่
บางครัง้ เรียกว่า inner-filter effects นี้ อาจเกิดจากการดูดกลืน
โดยโมเลกุลใน sample matrix
Fluorescence Instruments
Fluorescence Instruments
Source
primary
excitation filter/
monochromator
Sample
secondary
emission filter/
monochromator
Beam
attenuator
Sample
PMT
Reference
PMT
Difference Amplifier
Readout
รูปที่ 5 สว่ นประกอบของ fluorometer/spectrofluorometer.
Fluorescence Instruments
รู ป ที่ 5 แสดงส่ ว นประกอบของ fluorometers
และ
spectrofluorometers
สว่ นประกอบเหล่านีเ้ หมือนสว่ นประกอบ
ในเครือ
่ งมือสาหรับใน UV/visible spectroscopy
fluorescence instrument
โดยทั่วไปเป็ น double-beam
optics เพือ
่ หักล ้างการเปลีย
่ นแปลง power ของ source
เมือ
่
ี ะผ่าน primary
ผ่านรังสไี ปยังตัวอย่าง เริม
่ แรกรังสจ
excitation
ี จ
filter/monochromator ซงึ่ สง่ ผ่านรังสท
ี่ ะทาให ้เกิด excitation
แต่แยก emitted radiation ซงึ่ มีความยาวคลืน
่ เท่ากับฟลูออเรส
์ อกไป fluorescence radiation จะเปล่งออกจากตัวอย่าง
เซนซอ
ทุ ก ทิ ศ ทาง แต่ ก ารวั ด ท าได ส
้ ะดวกที่ สุ ด ในแนวตั ้ง ฉากกั บ
excitation beam ทีม
่ ม
ุ อืน
่ ๆ การกระเจิงแสงทีเ่ กิดจากสารละลาย
Fluorescence Instruments
และผนั งเซลล์อาจเพิม
่ ขึน
้ ทาให ้เกิดความคลาดเคลือ
่ นในการวัด
intensity มากกว่า emitted radiation จะเข ้าสู่ photoelectric
detector
หลังจากผ่าน secondary
emission
filter/
monochromator ซงึ่ แยก fluorescence peak สาหรับการวัด
Fluorescence Instruments
fluorescence instrument โดยทั่วไปเป็ น double-beam
optics เพือ
่ หักล ้างการเปลีย
่ นแปลง power ของ source
เมือ
่
ี ะผ่าน primary
ผ่านรังสไี ปยังตัวอย่าง เริม
่ แรกรังสจ
excitation
ี จ
filter/monochromator ซงึ่ สง่ ผ่านรังสท
ี่ ะทาให ้เกิด excitation
แต่แยก emitted radiation ซงึ่ มีความยาวคลืน
่ เท่ากับฟลูออเรส
์ อกไป fluorescence radiation จะเปล่งออกจากตัวอย่าง
เซนซอ
ทุ ก ทิ ศ ทาง แต่ ก ารวั ด ท าได ส
้ ะดวกที่ สุ ด ในแนวตั ้ง ฉากกั บ
excitation beam ทีม
่ ม
ุ อืน
่ ๆ การกระเจิงแสงทีเ่ กิดจากสารละลาย
และผนั งเซลล์อาจเพิม
่ ขึน
้ ทาให ้เกิดความคลาดเคลือ
่ นในการวัด
intensity มากกว่า emitted radiation จะเข ้าสู่ photoelectric
detector
หลังจากผ่าน secondary
emission
filter/
monochromator ซงึ่ แยก fluorescence peak สาหรับการวัด
Fluorescence Instruments
Radiation Sources
fluorescence ต ้องใช ้ source ทีม
่ ี intensity สูงกว่า tungsten
หรือ hydrogen lamp ทีใ่ ชวั้ ด absorption เนือ
่ งจาก F = 2.303K 
P0bc นั่นคือ emitted radiation power (และ sensitivity) เป็ น
ั สว่ นโดยตรงกับ source power (P0) ในขณะที่ absorbance
สด
คือ log P0/P จึงไม่ขน
ึ้ กับ source power
fluorescence source ทีใ่ ชกั้ นทัว่ ไปได ้แก่
 mercury arc lamps
 xenon arc lamps
 xenon-mercury arc lamps
 lasers
Fluorescence Instruments
Wavelength Selectors
เครือ
่ งมือที่ wavelength selectors ทัง้ สองเป็ น filters เรียกว่า
fluorometer
ถ ้า wavelength selectors ทัง้ สองเป็ น monochromators
เรียกว่า spectrofluorometer
Fluorescence filter
spectrofluorometer บางชนิดใช ้ filter สาหรับเลือกความยาว
คลืน
่ ของ excitation radiation และใช ้ grating monochromator
สาหรับกระจาย fluorescence radiation
Fluorescence Instruments
Cells and Cell Compartments
การวัดฟลูออเรสเซนซใ์ ช ้ cylindrical และ rectangular cells ที่
ิ ก
ทาด ้วยแก ้วหรือซล
ิ า
การออกแบบ cell compartment
scattered radiation ทีเ่ ข ้าสู่ detector
compartment
ต ้องระวังเพือ
่ ลดปริมาณ
จึงมักมี baffles ใน cell
Fluorescence Instruments
Detectors
สว่ นใหญ่ใช ้ photomultiplier (PMT)
โดยทั่วไป fluorescene signal มี intensity ต่า จึงต ้องการ
amplification factors สูง
detectors ทีใ่ ชกั้ นมากคือ photomultiplier (PMT) และมี
การใช ้ diode array detectors ใน spectrofluorometer
Fluorescence Instruments
fluorometers
และ spectrofluorometers ต่า งกั น อย่า ง
ั ซอน
้ สมรรถนะ และราคา เชน
่ เดียวกับ
กว ้างขวางในแง่ของความซบ
absorption spectrophotometers
โดยทั่วไป fluorescence instruments จะมีราคาแพงกว่า
absorption instruments ทีม
่ ค
ี ณ
ุ ภาพในระดับเดียวกัน
Fluorescence Instruments
รูปที่ 6
Optical diagram ของ
spectrofluorometer
Applications of Fluorescence Methods
fluorescence spectroscopy ไม่คอ
่ ยใชส้ าหรับการวิเคราะห์
โครงสร ้างของสาร (structural analysis) หรือการวิเคราะห์คณ
ุ ภาพ
(qualitative analysis) เพราะโมเลกุลทีม
่ โี ครงสร ้างต่างกันอาจให ้
fluorescence spectra คล ้ายกัน นอกจากนี้ fluorescence bands
ของสารละลายจะค่อนข ้างกว ้าง (board) ทีอ
่ ณ
ุ หภูมห
ิ ้อง
fluorescence methods สามารถประยุกต์กับสารละลายทีม
่ ี
ความเข ้มข ้นต่ากว่า absorption
methods
จึงเป็ นวิธท
ี ม
ี่ ี
ั พันธ์
sensitivity สูง เนือ
่ งจาก power ของ fluorescence (F) สม
กับความเข ้มข ้นและ power ของ source (F = 2.3K bc P0)
การเพิม
่ sensitivity ของ fluorescence methods ทาได ้โดยการ
เพิม
่ P0 หรือการขยาย fluorescence signal
Applications of Fluorescence Methods
สาหรับ absorption methods ค่า absorbance ซงึ่ แปรผัน
โดยตรงกับความเข ้มข ้น เท่ากับ log P0/P ถ ้าเพิม
่ P0 จะทาให ้ P
เพิม
่ ขึน
้ ในอัตราสว่ นเดียวกัน จึงไม่มผ
ี ลต่อ absorbance และไม่เพิม
่
ั ญาณจาก detector
sensitivity
ในทานองเดียวกันการขยายสญ
จะทาให ้ทัง้ P และ P0 เพิม
่ ขึน
้ เท่ากัน absorbance จึงไม่เพิม
่ ขึน
้
โดยทั่วไป fluorescence methods
absorption methods 1-3 เท่า
มี sensitivity
สูงกว่า
Applications of Fluorescence Methods
ความแม่น (accuracy)
และความเทีย
่ ง (precision)
ของ
fluorescence methods มักตา่ กว่า absorption methods ด ้วย
แฟกเตอร์ 2-5 และ phosphorescence methods มี precision ตา่
กว่า fluorescence methods
้
fluorescence methods ใชหาปริ
มาณ inorganic, organic
ึ ษาสมดุลเคมีและจลนพลศาสตร์ได ้
และ biochemical species ศก
่ เดียวกับ absorption methods โดยสามารถใชกั้ บปฏิกริ ย
เชน
ิ าเคมี
ทีค
่ วามเข ้มข ้นต่ากว่า เพราะมี sensitivity
สูงกว่า absorption
methods
Applications of Fluorescence Methods
Methods for Inorganic Species
มี 2 วิธ ี คือ
1. Direct Methods ให ้ analyte ทาปฏิกริ ย
ิ ากับ complexing
agent เพือ
่ ให ้เกิด fluorescent complex แล ้ววัด fluorescence
2. Indirect Methods วัดการลดลงของ fluorescence ที่
เรียกว่า quenching ซงึ่ เกิดขึน
้ เมือ
่ analyte ทาปฏิกริ ย
ิ ากับ
fluorescent reagent
สว่ นใหญ่ quenching ใชส้ าหรับการหา
ปริม าณของไอออนลบ (anions) และ ออกซ ิเ จนที่ ล ะลายอยู่
(dissolved oxygen)
Applications of Fluorescence Methods
การหาปริมาณ metal ions
transition metals สว่ นใหญ่ดด
ู กลืนรังสใี นชว่ ง UV/visible แต่
transition-metals chelates มักไม่ให ้ fluorescence เนือ
่ งจาก
เกิด nonradiative relaxation ได ้ดี
nontransition-metal ions ไม่ดด
ู กลืนรังสใี นชว่ ง UV/visible
แต่ nontransition-metal chelates ให ้ fluorescence
ดังนั น
้ ในการหาปริมาณ metal ions
methods เสริมกับ absorption methods
จึงใช ้ fluorescence
Applications of Fluorescence Methods
fluorometric reagents สาหรับการวิเคราะห์แคตไอออน ที่
้ ้ผลดีทส
ใชได
ี่ ด
ุ คือรีเอเจนต์ทม
ี่ ี aromatic structures และมีอะตอม
ทีใ่ ห ้คูอ
่ เิ ล็กตรอน 2 อะตอมขึน
้ ไป ซงึ่ ทาให ้เกิด chelate กับ
่
metal ions เชน
8-hydroxyquinoline (รีเอเจนต์สาหรับ Al, Be, และ metal

ions อืน
่ ๆ)

flavanol (รีเอเจนต์สาหรับ Zr and Sn)

alizarin garnet R (รีเอเจนต์สาหรับ Al, F-)

benzoin (รีเอเจนต์สาหรับ B, Zn, Ge, และ Si)
Applications of Fluorescence Methods
ตารางที่ 2 Selected Fluorescence Methods for Inorganic Species
Ion
Reagent
Wavelength, nm
Absorption
Fluorescence
Sensitivity
g/mL
Al3+
alizarin garnet R
470
500
10.007
F-
Al complex ของ alizarin
garnet R (quenching)
470
500
0.001
B4O72-
Benzoin
370
450
0.04
Cd2+
2-(o-Hydroxyphenyl)benzoxazole
365
Blue
2
Li+
8-hydroxyquinoline
370
580
0.2
Sn4+
Flavanol
400
470
0.1
Zn2+
Benzoin
--
Green
10
Applications of Fluorescence Methods
Methods for Organic and Biochemical Species
fluorescence
methods
สามารถใชกั้ บ organic
และ
biochemical substance จานวนมาก ได ้แก่ amino acids,
proteins, coenzymes, vitamins, nucleic acids, alkaloids,
porphyrins, steroids, flavanoids และ metabolites สว่ นใหญ่
้
ใชในการวิ
เคราะห์อาหาร ยา ตัว อย่า งทางคลินิก และผลิต ภัณ ฑ์
ธรรมชาติ
้
เนือ
่ งจาก fluorescence methods มี sensitivity สูง จึงใชใน
การตรวจวัดสาหรับ liquid chromatographic methods, flow
analysis methods และ electrophoresis
Molecular Phosphorescence
Spectroscopy
โมเลกุลจานวนมากสามารถเกิด delayed emission หรือ
ี ใี่ ช ้
phosphorescence ได ้ emission นีว้ ัดได ้ทีม
่ ม
ุ ฉากกับลารังสท
่ เดียวกับ fluorescence
กระตุ ้นเชน
ชว่ งเวลาสาหรับการเปล่ง
phosphorescence จากโมเลกุลคือ 10-4 - 104 s ดังนัน
้ จะเกิด
phosphorescence ได ้เฉพาะใน rigid solvent structures ซงึ่ จะ
เกิด collisional
deactivation
น ้อยทีส
่ ด
ุ
โดยทั่วไปจะพบ
phosphorescence ได ้ทีอ
่ ณ
ุ หภูมข
ิ อง liquid nitrogen
Molecular Phosphorescence
Spectroscopy
Electron Spins
แต่ ล ะอะตอมในโมเลกุ ล มี ส นามแม่ เ หล็ ก ซ ึ่ง เกิด จากการ
หมุนรอบแกนของอิเล็กตรอน โดยถือว่ามี 2 quantized spin state
เ ท่ า นั ้ น ที่ เ ป็ น ไ ป ไ ด ้ ทิ ศ ท า ง ก า ร ห มุ น แ ล ะ ทิ ศ ท า ง ข อ ง
สนามแม่เหล็กทีเ่ กิดขึน
้ ในแต่ละ spin state มีทศ
ิ ทางตรงกันข ้าม
2 quantized spin state of electron
Molecular Phosphorescence
Spectroscopy
ใน molecular orbital ทีม
่ ี 2 อิเล็กตรอน spin ของอิเล็กตรอนทัง้
สองจะตรงกันข ้ามตาม Pauli Exclusion Principle หรือ spin pairing
เรียกว่าอิเล็กตรอนอยู่ใน ground
singlet
state โมเลกุลที่
อิเล็กตรอนทุกตัวมี spin pairing จะไม่มส
ี นามแม่เหล็กสุทธิ จึงเป็ น
diamagnetic ซงึ่ จะผลักกับสนามแม่เหล็กถาวร
เมือ
่ อิเล็กตรอนถูกกระตุ ้นไปยังระดับพลังงานสูงขึน
้ ถ ้า spin ของ
excited-state electron ตรงกันข ้ามกับ ground-state electron (spin
pairing) เรียกว่าอิเล็กตรอนอยูใ่ น excited singlet state แต่ถ ้า
spin ของ excited-state electron เหมือนกับ ground-state electron
เรียกว่าอิเล็กตรอนอยูใ่ น excited triplet state โดย excited
triplet state มีพล ังงานน้อยกว่า excited singlet state
ื่ singlet, doublet และ triplet มาจาก spectroscopic
ชอ
multiplicity consideration ซงึ่ จะไม่พจ
ิ ารณาถึงในทีน
่ ี้
Molecular Phosphorescence
Spectroscopy
ground
singlet state
diamagnetic
excited
singlet state
diamagnetic
excited
triplet state
paramagnetic
Molecular Phosphorescence
Spectroscopy
Molecular
fluorescence
เกิดขึน
้ เมือ
่ มี electronic
transition จาก excited singlet state ไปยัง ground singlet
state
transition นี้มค
ี วามเป็ นไปได ้สูง ดังนัน
้ lifetime ของ
ั ้ มาก (10-5 s หรือน ้อยกว่า)
excited singlet state สน
Molecular phosphorescence เกิดขึน
้ เมือ
่ มี electronic
transition จาก excited triplet state ไปยัง ground singlet
state เนือ
่ งจาก transition นีม
้ ก
ี ารเปลีย
่ น electron spin จึงมี
ความเป็ นไปได ้น ้อยกว่า lifetime ของ excited triplet state จึง
ยาวกว่า (10-4 - 104 s)
Molecular Phosphorescence
Spectroscopy
เนื่องจาก phosphorescence
มี lifetime ยาว โมเลกุล ใน
excited state บางสว่ นจึงอาจเกิด nonradiative relaxation ทา
ให ้ประส ิท ธิภ าพของ phosphorescence
process และ
phosphorescence
intensity
ค่อนข ้างต่า โดยทั่วไปจึงวัด
่ แก ้ว เพือ
phosphorescence ทีอ
่ ณ
ุ หภูมต
ิ า่ ในตัวกลางที่ rigid เชน
่
ิ ธิภ าพ เมื่อ ไม่น านมานี้ phosphorescence
เพิม
่ ประส ท
ที่
อุณหภูมห
ิ ้องได ้รับความนิยมมากขึน
้ ในเทคนิคนี้โมเลกุล จะถูกดูด
ั บนพืน
ซบ
้ ผิวของแข็ง หรืออยูใ่ น molecular cavity
Molecular Phosphorescence
Spectroscopy
้
phosphorimetry
ใชในการหาปริ
ม าณ organic
และ
่ nucleic acids,
biochemical species ต่างๆจานวนมาก เชน
amino acids, pyrine, pyrimidine, enzymes, petroleum
hydrocarbons, pesticides
แต่วธิ น
ี ไ
ี้ ม่เป็ นทีน
่ ย
ิ มใชกั้ นอย่าง
กว ้างขวางเหมือน fluorometry เนื่องจากต ้องใชอุ้ ณหภูมต
ิ ่า และ
การวัด phosphorescence มี precision ต่ากว่า ในทางตรงกัน
ข ้าม phosphorescence ให ้ selectivity สูงกว่า
Chemiluminescence Methods
chemiluminescence
เกิด ขึน
้ เมื่อ ปฏิก ริ ย
ิ าเคมีท าให ้เกิด
eletronic excited molecule ซงึ่ จะคายรังสเี มือ
่ กลับสู่ ground
state
chemiluminescence reactions สว่ นหนึง่ พบในระบบ
่
ชวี ภาพ กระบวนการทีเ่ กิดขึน
้ มักเรียกว่า bioluminescence เชน
หิ่ ง ห อ
้ ย แ ม ง ก ร ะ พ รุ น บ า ง ช นิ ด แ บ ค ที เ รี ย โ ป ร โ ต ซั ว แ ล ะ
crustacea
้ อ
chemiluminescence ใชเครื
่ งมือทีง่ ่าย เนื่องจากไม่ต ้องใช ้
external source สาหรับ excitation และไม่ต ้องใช ้ wavelength
selector
เครือ
่ งมือจะประกอบด ้วย reaction vessel และ
photomultiplier tube เท่านัน
้
Chemiluminescence Methods
chemiluminescence ให ้ sensitivity สูง โดยทัว่ ไป detection
limits จะอยูใ่ นชว่ ง parts per million (ppm) ถึง parts per
billion (ppb) หรือตา่ กว่า