Transcript Określenie roli polimorfizmów genów uczestniczących w metabolizmie MTX

J Świerkot, R Ślęzak, P Karpiński, J Pawłowska, L Noga
Określenie roli polimorfizmów genów
uczestniczących w metabolizmie MTX
na skuteczność terapii i działania
niepożądane u chorych na RZS
Akademia Medyczna we Wrocławiu
Klinika Reumatologii i Chorób Wewnętrznych
Zakład Genetyki
Mechanizm działania MTX w leczeniu RZS
Hamowanie
DHFR
in vitro indukuje apoptoze
aktywowanych limfocytów T
cytostatyczne
apoptoza
Immunosupresyjne
cytokiny
przeciwzapalne
 stężenie IgG, IgA, IgM, przeciwciał
anty CCP
 poziom RF klasy IgM, IgA in vivo
 aktywność IL-1
 stężenie IL6, IL-8
 in vitro ekspresję genu dla
IL-4 i IL-10
 tworzenie IL-1ra i sTNFr
 AICAR  adenozyny
 in vitro uwalnianie prostaglandyny E2
i produkcję nadtlenków
 chemotaksję neutrofili
 tworzenie się naczyń krwionośnych
 stężenie metaloproteinaz
Polimorfizm genetyczny
 Ford – 1940 rok
 występowanie więcej aniżeli jednego prawidłowego
allelu dla określonego locus genowego, z częstością
większą niż 1%
 polimorfizm może występować na wielu poziomach
i dotyczyć różnorodności:
 sekwencji DNA,
 sekwencji aminokwasowych,
 struktur chromosomalnych.
Polimorfizm pojedynczego nukleotydu
 99,9% sekwencji DNA jest u ludzi identyczna
 różnice pojedynczego nukleotydu w danej pozycji =
SNP
 single nucleotid polimorphism.
 1 na 300 nukleotydów wykazuje zmienność
międzyosobniczą
 większość znajduje się w tzw. obszarach niekodujących
The Human Genome Diversity Project
 Od kilkunastu lat realizowany jest międzynarodowy
Projekt Poznania Różnorodności Genomu
Ludzkiego
 w 2003 roku w bazie tej zarejestrowano ok. 6 mln SNP
 w styczniu 2005 było już 21 mln SNP
 Zmiany sekwencji DNA w regionie kodującym
lub regulatorowych genów mogą zmieniać:
 strukturę białka
 modyfikować aktywność enzymów
 wpływać na ekspresję informacji genetycznej
 oddziaływać na mechanizmy kontrolne
biorące udział w podziale i rozwoju komórki
Wpływ genów na efektywność terapii
gen
lek
Absorbcja
Dystrybucja
Metabolizm
Wydzielanie
stężenie
lek
gen
Działania niepożądane
komórka
G-proteina
> lub < skuteczności
receptor
gen
gen
Cel pracy
 Określenie roli wybranych markerów klinicznych i
biomarkerów ze szczególnym uwzględnieniem wpływu
polimorfizmów genów:
 MTHFR C677T i A1298C, (reduktaza metylenotetrahydroflianowa)
 RFC1 A80G, (przenośnik zredukowanych folianów)
 TYMS 2R/3R i 6bp ins/del, (syntaza tymidylanowa)
 GGH C401T, (hydrolaza foliowielogammaglutaminianowa)
 TC P259R, TC I219L, TC L376S i TC M198T
na skuteczność i działania niepożądane w trakcie terapii
metotreksatem u chorych na RZS.
RFC - przenośnik zredukowanych folianów
GGH- hydrolaza foliowielogammaglutaminianowa
TYMS- syntaza tymidylanowa
MTHFR- reduktaza metylenotetrahydroflianowa
ATIC - transformylaza rybonukleotydowa 5-amino-4karboksyamidu
DHFR-reduktaza dihydrofolianowa
RFC - przenośnik zredukowanych folianów
GGH- hydrolaza foliowielogammaglutaminianowa
TYMS- syntaza tymidylanowa
MTHFR- reduktaza metylenotetrahydroflianowa
TC - transkobalamina
Materiał i metody
 270 chorych na RZS spełniających kryteria ARA
z 1987 roku
 aktywna postać choroby: OB > 30 mm/h i/lub
CRP > 1,5 mg/dl, minimum 4 bolesne i 3
obrzęknięte stawy, DAS 28 > 3,2
Zasady dawkowania leków
 MTX - doustnie w początkowej dawce 10-15 mg/tydz
 Następnie do 8-12 tygodnia chorzy byli leczeni MTX
w dawce 15 mg jeden raz w tygodniu
 jeśli nie uzyskano, co najmniej umiarkowanej
poprawy i jednocześnie nie było istotnych działań
niepożądanych dawkę zwiększano do maksymalnie
25 mg, nie szybciej jednak niż o 5 mg co 2 tygodnie.
Ocena kliniczna i laboratoryjna
 Kontrole 0, 2, 4, 6 miesiącu
 Ocena kliniczna
 liczba bolesnych i obrzękniętych stawów
 oceny nasilenia bólu dokonywanej przez chorego (VAS)
 oceny aktywności choroby wg chorego i lekarza
 DAS28
 ogólna ocena sprawności fizycznej chorego
 Kwestionariusz Oceny Stanu Zdrowia - HAQ)
 badania laboratoryjne (OB, CRP)
 ocena występowania działań niepożądanych.
MTHFR - reduktaza metyleno tetrahydrofolianowa 1298 A/Celektroforetyczny obraz produktów otrzymanych w wyniku reakcji PCR-RELP
Homozygota typu dzikiego 1298 AA (produkt: 56bp); heterozygota 1298AC
(produkty: 84bp i 56bp); homozygota typu 1298CC (produkt: 84bp).
Syntetaza tymidylowa (2R/3R) elektroforetyczny obraz produktów otrzymanych w wyniku reakcji
PCR-RELP Homozygota typu dzikiego- allel zawierający 2 powtórzenia
2R ; heterozygota 2R/3R powtórzenia; homozygota allel zawierający 3
powtórzenia 3R
Gen
MTHFR
MTHFR
TYMS
TYMS
RFC1
GGH
TC
TC
TC
C677T
Częstość
XX
48
Częstość
XZ
42
Częstość
ZZ
10
A1298C
57,5
42
0,5
2R/3R
16
57
27
6bp ins/del
55
38
7
G80A
31,5
50
18,5
T401C
52
42,5
5,5
L376S
7
92
1
I219L
75,5
24
0,5
P259R
20
59
21
Polimorfizm
Rodzaj działania
Łącznie
niepożądanego
Żołądkowo-jelitowe
Zmuszający do
odstawienia MTX
80 (33%)
23 (9,5%)
18 (7,5%)
5 (2%)
Hematologiczne
8 (3,3%)
4(1,6%)
Pulmonologiczne
7 (2,9%)
6 (2,5%)
Łysienie
28 (12%)
0
Osłabienie, ból głowy
34 (14%)
0
Zakażenia
9 (3,8%)
1 (0,4%)
Skóra i błony śluzowe
2 (0,8%)
1 (0,4%)
Guzki pometotreksatowe
2 (0,8%)
0
aktywności transaminaz
Wiek
MTX
czas RZS
przed
MTX
Aktywność
choroby
Skuteczność
Dz. N. –
łącznie
Dz.N. –
Dz.N. –
gastroentero- neurolologiczne
giczne
Dz. N. –
hepatologgiczne
P=0,01
P=0,98
P=0,15
P=0,26
P=0,12
P=0,14
P<0,01
P=0,14
P=0,18
P=0,12
Dz.N. łysienie
P=0,045;
OR=2,46
P=0,004
OR=2,46
P=0,0001
P=0,002;
OR=6,96
P=0,04;
OR=4,28
P=0,18
P=0,95
P=0,039
P=0,46
P=0,47
P=0,60
P=0,50
P=0,56
P=0,21
P=0,0001
P=0,01
P=0,043
P=0,88
P=0,48
Glikokorty
kosteroidy
P=0,65
P=0,36
P=0,46
P=0,36
P=0,74
P=0,02;
OR=0,27
P=0,25
Papierosy
P=0,87
P=0,13
P=0,15
P=0,80
P=0,43
P=0,19
Stopień
RZS
MTX 1/2
Wyniki – wpływ polimorfizmów na skuteczność
 Bez IS różnic: MTHFR C677T i A1298C, RFC-1 A80G, TYMS
2R/3R i 6bp ins/del, GGH C401T, TC P259R i TC I219L i TC L376S
 Genotyp MTHFR 677CC - 1,8 x > skuteczność
(p=0,051)
 > skuteczność gdy kombinacja genotypów
MTHFR 677 CC +RFC 80AA +MTHFR 1298AA
(18/100%:163 /74%) p=0,039
 Homozygoty MTHFR 677CC - szybsza dobra odpowiedź
na leczenie MTX (OR=3,4; p=0,001)
Polimorfizmy w których stwierdzono istotne statystycznie różnice
w częstości występowanie wszystkich działań niepożądanych
80
70
OR=2,0
60
OR=2,0
OR=3,7
50
1)TT+CT
2)2R/3R+3R
3)CC
1)CC
2)2R
3)CT+TT
40
30
20
10
0
MTHFR
677
TYMS
2R/3R
GGH 401
Polimorfizmy związane z istotnie statystycznymi różnicami
w częstości występowanie wzrostu aktywności aminotransferaz
16
14
12
OR=3,6
OR=3,4
10
1) TT+CT
2) AA
1) CC
2) GA+GG
8
6
4
2
0
MTHFR 677
RFC 1 80
Skuteczność
Genotyp
MTHFR 677 CC +RFC80GG
+MTHFR1298AA /pozostałych
Brak
(n, %)
0
56(26)
Umiarkowana
+ dobra (n, %)
18 (100)
163 (74)
OR
p
0.039
Działania niepożądane - łącznie
Pozostałe polimorfizmy /
MTHFR 677CC + TC198TT
Pozostałe polimorfizmy /
MTHFR677CC+
TC198TT+GGH401TT+TYMS 2R
pozostałe polimorfizmy/
MTHFR 677CC+GGH401TT
pozostałe /
MTHFR677CC+GGH401TT + RFC80GG
Brak
obecne
OR
p
74 (41)
37 (64)
84 (42)
27 (71)
107 (59)
21 (36)
117 (58)
11 (29)
2.54 0.004
3.41 0.002
51 (38)
83 (62)
2.16 0.005
60(57)
45 (43)
Działania niepożądane - hepatologiczne
133(88)
89 (99)
17 (12)
1 (1)
11.37 0.008
wywiad
badanie fizykalne
rozpoznanie
badania genetyczne
ocena aktywności
badania laboratoryjne
i obrazowe
„Dla każdego coś dobrego”
U.S. News and World Report, January 24, 2003
Czy to tylko marzenia?
Amplichip CYP450 Array
 Możliwość identyfikacji
polimorfizmu genów
odpowiedzialnych za
metabolizm leków
 Różnice w genach u
poszczególnych osób
dotyczące klirensu leku i
skutecznej dawki
 Potrzebna kropla krwi
 Czas oczekiwania 8 godzin
Różnice w „odpowiedzi” na leki
„Gdyby nie było różnic
między ludźmi medycyna
byłaby tylko nauką,
a nie sztuką”
Sir William Osler
(1849-1919)
CZY badania te są opłacalne?
Badana cecha – wyniki wyjściowe
Odpowiadający nieodpowiadający
p
v
Liczba chorych
185
55
54±10
50±11 *
80
83
4,2±0.8
4,7±0.6 *
60
67
NS
15 (12,5 -25)
15 (12,5-25)
NS
MTX jako pierwszy LMPCH/MTX kolejny
81
68 *
p<0.01
Suplementacja kwasem foliowym %
100
100
NS
Jednocześnie glikokortykosteroidy %
66
63
NS
Jednocześnie NSLPZ %
76
74
NS
46/54
50/50
NS
39
35
NS
Wiek (lata) średnia ± SD zakres
Płeć, kobiety %
DAS 28
Liczba pacjentów seropozytywnych (RF) %
Średnia dawka MTX (min/max)
Okres RZS wg Steinbrockera I+II/II+IV %
Palenie papierosów %
p<0.01
NS
p<0.01
RFC1-zredukowany nośnik folianów ;
FPGS-syntetaza folylpoliglutaminianowa;
TS- syntetaza tymidylowa ;
DHFR-reduktaza dihydrofolianów;
5,10 MTHFR, -reduktaza metyleno-tetrahydrofolianowa
AICAR - transformylaza 5-aminoimidazol0-4-karboxamido-rybonukleotydowa
JA Wessels. Rheumatology 2008;47:249–255
MTHFR C677T.
Wzór prążków badanego polimorfizmu
uzyskanego metodą PCR-RFLP.
linia 8. homozygota typu 677TT (175bp)
linia 9. homozygota typu dzikiego (198bp),
linia 10. heterozygota (obecność dwóch produktów175bp +198bp)
Jakie marzenia na przyszłość
 Testy SNP będą wystandaryzowane dla
populacji pacjentów
 Wyniki testu będą dostępne w codziennej
praktyce i umożliwi to indywidualizację terapii
 Zmapowanie SNP całego genomu będzie miało
istotne znaczenie w doświadczeniach nad
nowymi lekami
Polimorfizm pojedynczego nukleotydu
 analizy SNP może pomóc w prognozowaniu
występowania i w określeniu obrazu klinicznego
takich chorób jak astma, cukrzyca, migrena, choroby
serca, rzs.
 Choroby te dziedziczy się wieloczynnikowo, a ich występowanie w
dużym stopniu jest uzależnione od czynników środowiskowych.
 W przyszłości wynik analizy SNP stanie się
prawdopodobnie również podstawą tworzenia
genetycznych „wizytówek” człowieka.
Działania
niepożądane
677CC <tox
efektywność
praca
10-20
Czas
obs.
3
0
żółta
15
6
0
0
93
biała
10-15
12
0
0
C677 T
113
biała
15-25
6
0
??
Schmeling
2005
Kumaqgai
2003
Berkun
2004
Van Ede
2002
C677T
236
biała
10-25
3
TT i TC > tox.
hepatotox
0
Van Ede Art
2001
C677T
106
żółta
rózna
24
677T >tox
677C >??
Raczej 0
Urano
Pharmacog.
C677T
236
biała
15
6
677TT i CT >
tox > AlAT
0
Evans 2001
C677T
105
żółta
10-20
3
?
0
Haagsma
1999
Polimor Liczba
fizm
chorych
C677T
58
Rasa
Dawka
biała
C677T
93
C677T
Polimor Liczba Rasa Dawka Czas
Działania
fizm
chorych
obserwacji niepożądane
efektywność praca
A1298C
58
biała
10-15
6
0
1298AA <
Schmeling
2005
A1298C
93
żółta
10-20
12
0
0
Kumaqgai
Int j mol
A1298C
93
biała
15-25
3
1298CC < AA
AA to 5,24 x >
0
Berkun 2004
A1298C
106
biała
różny
12
0
1298C >
Urano
Pharmaco.
A1298C
308
biała
10-20
6
1298 A >
0
Hughes 2006
A1298C
205
biała
15
3
1298C >
1298 AA >
wczesny rzs
Wessels 2006
A1298C
83
biała
10-15
24
0
0
James
1. Blokery TNF alfa – polimorfizm TNF-308 A/G
 1055 chorych na RZS
 455 – etanercept,
450 - infliksimab
 Czas badania – 6 msc.
 Ocena skuteczności – DAS28 , HAQ
 TNF 308AA – gorsza odpowiedź na etanetcept
(n=6; p=0,007), ale nie na infliksimab (n=17)
 TNF 238 GA – gorsza odpowiedź na infliksimab
(n=40; p=0,028) ale nie na etanercept (n=33)
 Maxwell JR. Hum Mol Genet. 2008 Nov 15;17(22):3532-8.
Cechy idealnego leku
 Lek który działa
 Lek który jest bezpieczny
 Dawki które są właściwe dla konkretnego chorego
3. Blokery TNF alfa – polimorfizm TNF-308 A/G
 81 chorych na RZS
 Adalimumab 24 tygodnie
 Ocena skuteczności terapii: - DAS28
 88% z 308GG i 68% z 308 GA dobrze
odpowiadało na leczenie adalimumabem (p=0,05)
Tworzenia nowych standardów bezpieczeństwa
i skuteczności terapii
 Prowadzenie badań klinicznych ze znanymi
fenotypowo pacjentami dla określenia
polimorfizmów SNP odpowiedzialnych za
skuteczność terapii
 Prowadzenie obserwacji post-marketingowych
dla zidentyfikowania profilu SNP
charakterystycznego dla działań niepożądanych
Informacje podstawowe, definicje
 Gen – czynnik genetyczny zawierający pojedynczą
jednostkę dziedziczenia.
 Oznacza odcinek DNA kodujący syntezę pojedynczego
łańcucha polipeptydowego
 Allel – jedna z kilku alternatywnych form genu
leżącego w danym locus
 Locus genu – pozycja zajmowana przez gen w
chromosomie
4. Blokery TNF alfa – polimorfizm TNF-308 A/G
 388 chorych z Francji uczestniczących w
badaniu ReAct (adalimumab lub adalimumab + MTX lub
adalimumab + inny LMPCH)
 12 tygodni
 40% chorych uzyskało minimum poprawę ACR50%
 Pojedynczo TNF 238A/G, 308A/G, 857 C/T nie
miały wpływu na skuteczność i działania
niepożądane
 TNF 238G+308G+857C - to mniejszy odsetek
dobrze odpowiadających (34/50%)
 Miceli-Richard C. Ann Rheum Dis. 2008 Apr;67(4):478-84.
Polimorfizm pojedynczego nukleotydu
 Najczęściej jest spotykany polimorfizm
dwualleliczny rzadziej trójalleliczny
 SNP występujące w genach i obszarach
regulatorowych decydują o indywidualnej
charakterystyce danego osobnika
 Gęstość i nasycenie SNP nie są jednak identyczne
dla całego genomu.
 największe zagęszczenie jest locus HLA na chromosomie 6.
 na chromosomie
X zidentyfikowano „pustynie SNP”.
Indywidualizacja terapii
 Pojedynczy SNP jest obecny w 5% całej populacji,
ale w 95% chorych z działaniami niepożądanymi
 Częstość działań niepożądanych min. 5%
 SNP test może zmniejszyć częstość działań
niepożądanych do 0.25%
 Korzyści
 zwiększenie bezpieczeństwa,
 zmniejszenie konieczności wykonywania badań
kontrolnych,
 zwiększenie skuteczności terapii
Korzyści wynikające z wykonania testu
fenotypowania/genotypowania
1. Możliwość szybkiego podjęcia decyzji dotyczącej
dawki leku (optymalizacja skuteczności i tolerancji)
2. Osoby „słabo metabolizujące”:
 uniknięcie odstawienia leku z powodu braku jego
tolerancji (pozorna idiosynkrazja)
3. Osoby ultraszybko metabolizujące:
 uniknięcie odstawienia prawidłowo wybranego leku
wskutek braku efektu terapeutycznego spowodowanego
zbyt małym jego stężeniem
Korzyści wynikające z wykonania testu
fenotypowania/genotypowania c.d.
4. Fenotypowanie może w dużym stopniu zastąpić
monitorowanie stężenia leku w klinice
5. Wykonanie jednego z powyższych testów ułatwia
prawidłowe wprowadzenie nowego leku do terapii
przez zastosowanie bezpiecznej dawki
6. Test taki wystarczy wykonać raz w życiu, czas i
koszty są usprawiedliwione zwłaszcza w przypadku
leczenia długotrwałego
.
RFC1G80A. Wzór prążków badanego polimorfizmu uzyskanego
metodą PCR-RFLP. Homozygota typu dzikiego 80AA (2 produkty);
heterozygota 80GA (4 produkty); homozygota 80GG (3 produkty).
AA
GG
GA