Document 7167413
Download
Report
Transcript Document 7167413
Column Chromatography
พุทธรักษา วรานุศภุ ากุล
2302244 เคมีวิเคราะห์ 2
Column Chromatography
เป็ นเทคนิคทางโครมาโทกราฟี ที่มีรูปแบบของการบรรจุเฟสคงที่ในท่อปิ ด
เฟสคงที่และเฟสเคลื่อนที่ใน Column Chromatography
เฟสคงที:่ บรรจุอยู่ในท่อหรื อที่เรี ยกว่าคอลัมน์
เฟสเคลื่อนที:่ ไหลผ่านเฟสคงที่ในคอลัมน์ด้วยแรงดันหรื อแรงโน้ มถ่วง (gravity)
เทคนิคทาง Column Chromatography
Gas Chromatography (GC): ใช้ แก๊ สเป็ นเฟสเคลื่อนที่
Liquid Chromatography (LC): ใช้ ของเหลวเป็ นเฟสเคลื่อนที่
เฟสคงที่
column
2
Gas Chromatography
Gas Chromatography (GC)
ในเทคนิคนี ้สารที่ต้องการแยกจะถูกเปลี่ยนให้ อยู่ในสถานะแก๊ ส แล้ วผ่านเข้ า
คอลัมน์เพื่อเกิดการแยกโดยอาศัยการพาไปของเฟสเคลื่อนที่ทเี่ ป็ นแก๊ ส
แก๊ สที่เป็ นเฟสเคลื่อนทีจ่ ะเป็ นแก๊ สเฉื่อยและไม่ทาปฏิกิริยากับสาร ทาหน้ าที่เป็ นตัวพา
สารให้ ผ่านคอลัมน์ไปอย่างเดียว ดังนัน้ ในเทคนิค Gas Chromatography จึงนิยมเรี ยก
แก๊ สที่เป็ นเฟสเคลื่อนทีน่ ี ้ว่าแก๊ สพา (carrier gas)
แก๊ สโครมาโทกราฟี แบ่งออกได้ เป็ น 2 วิธี คือ
Gas-liquid chromatography (GLC)
การกระจายตัว (partitioning) ของสารระหว่างแก๊ สพากับเฟสคงที่ของเหลวที่เคลือบอยูบ
่ นผิวของ
solid support หรื อที่ผนังของแคพพิลลารี คอลัมน์
Gas-solid chromatography (GSC)
เฟสคงที่เป็ นของแข็งที่สามารถดูดซับ (physical adsorption) สารที่เป็ นแก๊ สซึง่ ต้ องการแยกได้ เช่น
molecular sieves, silica gel, alumina, activated carbon เป็ นต้ น
4
องค์ ประกอบของเครื่ อง GC
Injector
Detector
Carrier gas
Column
Recorder
and Data
processing
5
องค์ ประกอบของเครื่อง GC
เครื่ องโครมาโทกราฟ (GC) ประกอบด้ วยส่วนหลักๆ 5 ส่วน คือ
แก๊ สพา (carrier gas) - มีถงั บรรจุแก๊ สพาและส่วนควบคุมการไหลของแก๊ ส
ส่วนฉีดสารตัวอย่าง (injector) - ส่วนที่นาสารเข้ าสูค
่ อลัมน์เพื่อทาการแยก
คอลัมน์ (column) - วางอยูใ่ นตู้อบ (oven) ที่สามารถปรับอุณหภูมิได้ รวดเร็ ว
ส่วนการตรวจวัด (detector) - ทาการตรวจวัดสารแต่ละชนิดที่ถก
ู แยกออกมา
ส่วนการประมวลผล (recorder and data processing)
6
แก๊สพา (Carrier Gas)
แก๊ สที่ใช้ เป็ นแก๊ สพาจะต้ องไม่วอ่ งไวต่อการทาปฏิกิริยา
(chemically inert)
การปรับอัตราเร็ วของแก๊ สพา ทาโดยปรับความดันของ
แก๊ สซึง่ ควบคุมด้ วย pressure regulator
แก๊ สที่นิยมใช้ ได้ แก่ He, N2, H2, และ Air
Inlet pressure: 10-50 psi (above room pressure)
อัตราเร็ วของแก๊ ส (volumetric flow) ที่ใช้ ในเทคนิค GC
Bubble flow meter
สาหรับ packed column: 25-150 mL/min
สาหรับ capillary column: 1-25 mL/min
Two-stage gas
regulator
7
ชนิดของแก๊สพา (carrier gas)
เมื่อทาการเปลี่ยนความเร็วหรื ออัตราเร็ วของ
แก๊ สพาที่ผ่านคอลัมน์ ผลกระทบต่อ
ประสิทธิภาพคอลัมน์ในการใช้ แก๊ สพาแต่ละ
ชนิดจะไม่เท่ากัน
ไนโตรเจนเป็ นแก๊ สพาที่ให้ คา่ H ต่าสุด (ได้
ประสิทธิภาพคอลัมน์มากที่สดุ ) แต่ทาได้ ที่
ความเร็วของแก๊ สพาต่าๆ อีกทังช่
้ วงของค่า
ความเร็วแก๊ สที่ทาให้ ได้ ประสิทธิภาพในการ
แยกที่ดีแคบ
ไฮโดรเจนและฮีเลียมให้ คา่ Hopt ที่ความเร็วของ
แก๊ สที่สงู ทาให้ ทาการแยกสารได้ เร็วขึ ้น
8
Choice of carrier gas
Advantages
Hydrogen
Cheap
Gives the most time efficient
separation
Still very efficient at high gas
velocities ie. 60 cm/ sec
Disadvantages
Helium
Nitrogen
Very inert, will not react with
analytes
Gives a very time efficient
separation
Non flammable
Cheap
Very inert, will not react with
analytes
Non flammable
Can form an explosive mixture with
air
Some industries in some countries
have regulated AGAINST the use
of hydrogen
is a reductive gas
Expensive
A non-replenishable resource
Very slow velocity to achieve
good efficiency
Narrow range for maximum
efficiency
9
ความบริ สุทธิ์ของแก๊ ส
Carrier gas should contain less than
1ppm of oxygen, moisture, or other
trace contaminants
Carrier gas impurities can also
contribute to detector noise
Gas grade/Trap
Longer column lifetime
Less GC maintenance
10
เกรดของแก๊ส
Research grade
Trace analysis
< 1 ppm
Ultra-Pure Carrier grade
99.9999% total purity
Total impurities < 1ppm
Complete analysis of all contaminants
99.9995% total purity
total hydrocarbon < 0.5ppm
H2O, O2 each < 1ppm
1-1000 ppm
UHP/Zero grade
99.999% total purity
total hydrocarbon < 0.5ppm
H2O < 3.5ppm, O2 < 4ppm
> 1%
11
Gas Purity
A. Molecular Sieve Trap B. Hydrocarbon Trap C. Oxygen Trap
12
Traps
Molecular Sieve Trap
(moisture trap)
Hydrocarbon Trap
Oxygen Trap
13
Sample Injection System
Introduced as a plug of vapor with
suitable size
Slow injection or oversized samples
cause band spreading and poor
resolution
Microsyringes
Injection ports
14
Injection port
Carrier
gas
Septum
Septum
purge
Heated
injection port
50º C greater than boiling point of
the least volatile component
Sample size: L
Split mode (1:100)
Split/splitless mode
Autosampler
Vent
Inlet liner
Column
15
Vaporization Injectors
Basic design
a glass liner resides inside the heated,
metal injector body
Sample introduction
rapidly vaporizes as of high
temperature
carried by the movement of carrier
gas into the column
16
Microsyringes/ Autosampler
Gas-tight syringe
Microsyringe
Autosampler
17
Inlet Liners
18
Accessories: Vial, Septa and Caps
19
GC Column
20
Packed vs Capillary
Length: 2-50 m or more
Stainless steel, glass, fused silica, or Teflon
Packed Column
Open-tubular Column
(capillary column)
21
Packed Column
Glass or metals
2-3 m long, 2-4 mm i.d.
Densely packed with packing materials or solid support coated with
thin layer of stationary liquid phase
Diatomaceous earth
Size: 60-80 mesh (250-170 m) or 80-100 mesh (170-149 m)
22
Open Tubular Column
Better resolution – efficient mass transfer between gas and SP
Tubing – fused silica, glass, copper, stainless steel
23
Types of Open Tubular Column
Liquid phase
Solid support coated
with liquid phase
Porous
Adsorbent
Wall-coated Open Tubular Support-coated Open Tubular Porous Layer Open Tubular
(WCOT)
(SCOT)
(PLOT)
FSOT: Fused-silica open tubular column
24
Characteristics
Type of Column
FSOT
WCOT
SCOT
Packed
10-100
10-100
10-100
1-6
0.1-0.3, 0.53*
0.25-0.75
0.5
2-4
2000-4000
1000-4000
600-1200
500-1000
Sample size (ng)
10-75
10-1000
10-1000
10-106
Relative pressure
Low
Low
Low
High
Relative speed
Fast
Fast
Fast
Slow
Flexible
Yes
No
No
No
Chemical inertness
Best
Length (m)
ID (mm)
Efficiency (Plate/m)
*Megabore column
Poor
25
Stationary Phases
Low volatility, thermal stability, chemical inertness
Provide k and within a suitable range
consider the polar characteristics of the analytes and select SP of
similar polarity
‘Like dissolves like’
26
Stationary Phases
Solid phase
Most uses for separation of low MW compounds and gases
Common SP: silica, alumina, molecular sieves such as zeolites, cabosieves,
carbon blacks
Liquid phase
Over 300 different phases are widely available
grouped liquid phases
Non-polar, polar, intermediate and special phases
Polymer liquid phase
27
Stationary Phase Polymers
Siloxane
Arylene
Polyethylene glycol
28
Liquid phases
Non-polar phase
Polar phase
Primarily separated according to their volatilities
Elution order varies as the boiling points of analytes
Common phases: dimethylpolysiloxane, dimethylphenylpolysiloxane
Contain polar functional groups
Separation based on their volatilities and polar-polar interaction
Common phases: polyethyleneglycol
Intermediate phase
29
Bonded and Cross-linked SP
Polymer chains
Cross-linking
Bonding
Fused silica tubing surface
Bonded and cross-linked SP provides long term stability, better reproducibility
and performance.
30
Common stationary phase coating for capillary
column
Composition
Polarity
Applicaitons
Temp limits
100% dimethyl polysiloxane
(Gum)
Nonpolar
Phenols, Hydrocarbons, Amines,
Sulfur compounds, Pesticides,
PCBs
-60oC to
325oC
100% dimethyl polysiloxane
(Fluid)
Nonpolar
Amino acid derivatives, Essential
oils
0oC to 280oC
5% diphenyl 95% dimethyl
polysiloxane
Nonpolar
Fatty acids, Methyl esters,
Alkaloids, Drugs, Halogenated
compounds
-60oC to
325oC
14% cyanopropyl phenyl
polysiloxane
Immediate
Drugs, Steroids, Pesticides
-20oC to
280oC
50% phenyl, 50% methyl
polysiloxane
Immediate
Drugs, Steroids, Pesticides, Glycols
60oC to 240oC
50% cyanopropylmethyl, 50%
phenylmethyl polysiloxane
Immediate
Fatty acids, Methyl esters, Alditol
acetates
60oC to 240oC
50% trifluoropropyl polysiloxane
Immediate
Halogenated compounds,
+Aromatics
45oC to 240oC
Polyethylene glycol – TPA
modified
Polar
Acids, Alcohols, Aldehydes
acrylates, Nitriles, Ketones
60oC to 240oC
Polyethylene glycol
Polar
Free acids, Alcohols, Ethers,
Essential oils, Glycols, Solvents
60oC to 220oC
31
32
Column Dimensions
Column Length: 10 – 60 m
Column Internal Diameter: 0.10 – 0.53 mm
Stationary Phase Film Thickness: 0.10 – 0.25 m
33
Detectors
Purpose of Detector
- Monitor the carrier gas as it emerges from the column
- Generate a signal in response to variation in its composition due
to eluted components.
35
Ideal Detector
Adequate sensitivity 10-8 – 10-15 g solute/s
Good stability and reproducibility
Linear response to analytes
Temperature range from room temperature to at least 400oC
Short response time
High reliability and ease of use
Similarity in response
Nondestructive of sample
Low background noise and ease of operation
36
Classification of Detectors
Concentration vs. Mass flow rate
Selective vs. Universal
Destructive vs. Nondestructive
37
Concentration vs. Mass Flow
Concentration-dependent detectors: TCD, ECD
normally non-destructive
can be used in series
make-up gas lower the response
Mass flow dependent detectors: FID, NPD, FPD
signal related to rate of solute molecules enter the detector
destructive
unaffected by make-up gas
38
Selective vs. Universal
Universal detectors: TCD
Detecting all solutes
Beneficial for qualitative screening
Selective detectors: ECD,NPD,FPD
Responds to particular types of compounds
common chemical or physical property
Enhances sensitivity for trace analysis
39
GC Detector
Type
Applicable samples
Typical detection limit
Flame ionization (FID)
Hydrocarbons
0.2 pg/s
Thermal conductivity (TCD)
Universal detector
500 pg/mL
Electron Capture (ECD)
Halogenated compounds
5 fg/s
Mass Spectometer (MSD)
Tunable for any species
0.25-100 pg
Nitrogen-phosphorous (NPD)
N, P compounds
Electrolytic conductivity (ELCD)
Compounds containing
halogens, S, or N
0.1 pg/s (P)
1 pg/s (N)
0.5 pg Cl/s
2 pg S/s
4 pg N/s
Photoionization (PID)
Compounds ionized by UV
Flame Photometric (FPD)
S, P compounds
Fourier Transform IR (FTIR)
Organic compounds
2 pg/C/s
10-100 pg (S)
1-10 pg (P)
0.2-40 ng
40
Flame Ionization Detector (FID)
Selectivity:
Compounds with C-H bonds
A poor response for some non-hydrogen containing organics (e.g.
hexachlorobenzene)
Fewer ions or none in flame
carbonyl, alcohol, halogen, and amine
Insensitive toward noncombustible gases such as H2O, CO2, SO2
and NOx
41
FID Assembly
42
Mass Spectrometer Detector (MSD)
MS with EI ion source, a quadrupole mass analyzer and a
continuous-dynode electron multiplier.
43
MSD Assembly
44
Hyphenated GC-MS
45
Liquid
Chromatography
Partition liquid chromatography
Adsorption liquid chromatography
Ion or Ion exchange chromatography
Size exclusion chromatography
Affinity chromatography
Chiral chromatography
Liquid Chromatography (LC)
สารที่ต้องการแยกผ่านเข้ าคอลัมน์เพื่อเกิดการแยกโดยอาศัยการพาไปของ
เฟสเคลื่อนที่ที่เป็ นของเหลว
Liquid Chromatography ที่ใช้ ในการวิเคราะห์ในปั จจุบนั มีดงั นี ้
Classical LC หรื อ Column LC
ใช้ อนุภาคที่มีขนาดใหญ่ (โดยทัว่ ไปประมาณ 100-250 m) บรรจุในคอลัมน์ที่มีเส้ นผ่าน
ศูนย์กลาง 1-5 เซนติเมตร
High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
ใช้ อนุภาคที่มีขนาดเล็ก (โดยทัว่ ไปประมาณ 5-50 m) บรรจุในคอลัมน์ที่มีเส้ นผ่าน
ศูนย์กลาง 1-5 มิลลิเมตร
ใช้ high pressure pump ในการช่วยให้ เฟสเคลื่อนที่ไหลผ่านคอลัมน์
47
Liquid Chromatography (LC)
เทคนิค HPLC นิยมจาแนกตามกลไกการแยก ซึง่ มีดงั นี ้
Partition liquid chromatography
Based on a partitioning of solutes between mobile phase and stationary phase (solute diffuses into the
interior of stationary phase)
Adsorption liquid chromatography
Based on an adsorption of solutes onto the surface of solid stationary phase which is called adsorbent.
Ion or Ion exchange chromatography
Based on an exchange between solute ions in mobile phase and ions of like charge associated with the
stationary phase surface
Size exclusion chromatography
Based on a physical sieving process
Affinity chromatography
Based on specificity of analyte-stationary phase interactions
Chiral chromatography
Based on a chiral selector
48
Partition chromatography
Bonded phase packing: organosilane
Normal phase
Highly polar SP, relatively non-polar MP
Least polar component is eluted first; increasing polarity of MP decreases elution time
Reversed phase
Non-polar SP, relative polar MP
Most polar component eluted first; increasing polarity of MP increases elution time
49
Normal phase
50
Reversed Phase
51
องค์ ประกอบของเครื่อง HPLC
52
องค์ ประกอบของเครื่อง HPLC
เครื่ อง HPLC ประกอบด้ วยส่วนหลักๆ 6 ส่วน คือ
ภาชนะบรรจุเฟสเคลื่อนที่ (Reservoir)
ระบบปั๊ มสาร (pumping system) – ควบคุมการไหลของเฟสเคลื่อนที่
ส่วนฉีดสารตัวอย่าง (injector) – นาสารเข้ าสูค
่ อลัมน์เพื่อทาการแยก
คอลัมน์ (column)
ส่วนการตรวจวัด (detector) – ทาการตรวจวัดสารแต่ละชนิดที่ถก
ู แยกออกมา
ส่วนการประมวลผล (recorder and data processing)
53
เฟสเคลื่อนที่
เฟสเคลื่อนที่ก่อนผ่านเข้ าคอลัมน์จะต้ องทาการไล่อากาศที่
ละลายอยู่
เพราะออกซิเจนที่ละลายอยู่อาจทาปฏิกิริยากับเฟสเคลื่อนที่บางชนิดได้
หรื อแม้ กบั เฟสคงที่ที่บรรจุในคอลัมน์
ลดโอกาสที่จะทาให้ เกิดฟองอากาศในระบบ
เทคนิคที่นิยมใช้ ในการไล่อากาศ
การผ่านเครื่ อง degasser ก่อนผ่านเฟสเคลื่อนที่เข้ าปั๊ ม
การ purge ด้ วยแก๊ สเฉื่อย เช่น ฮีเลียม ในภาชนะที่บรรจุเฟสเคลื่อนที่
ระบบของการแยกในเทคนิค HPLC มี 2 mode ตามลักษณะการ
ใช้ เฟสเคลื่อนที่คือ
Isocratic – การแยกโดยใช้ องค์ประกอบของเฟสคงที่แบบเดียวตลอด
การแยก
Gradient elution – การแยกโดยมีการเปลี่ยนองค์ประกอบของเฟสคงที่
ในระหว่างการแยกแบบต่อเนื่องหรื อแบบทีละขัน้ (stepwise)
54
Pumping system
Generate pressure up to 6000 psi
Pulse free output
Flow rates: 0.1-10 mL/min
Flow reproducibility
Resistance to corrosion
Screw-driven syringe pump
Reciprocating pump
Pneumatic pump
55
Pumping System
ปั๊ มที่นิยมใช้ ใน HPLC คือ ปั๊ มแบบชักลูกสูบ
(reciprocating pumps)
หลักการทางานคือ ก้ านสูบ (piston) ของปั๊ ม
จะเคลื่อนที่เข้ าออกตลอดเวลาเมือ่ ลูกสูบ
เคลื่อนที่เข้ าจะเป็ นการดันเฟสเคลื่อนที่ให้ เข้ า
สูคอลัมน์ และเมื่อเคลื่อนออกจะดึงเอาเฟส
เคลื่อนที่จากภาชนะที่บรรจุ (reservoir) เข้ าสู่
ลูกสูบผ่าน check valve
การควบคุมการไหลของเฟสเคลื่อนที่ทาโดย
การปรับอัตราเร็วของการชักลูกสูบ
56
Reciprocating pump
57
Sample Injection System
นิยมใช้ microsampling valve
Sampling loop: 5-500 L
58
Autosampler
59
Columns สาหรับ HPLC
Stainless steel tubing
Micro column
10-30 cm, 2-5 mm i.d., Packing: 3-10 m particle size, 40,000 – 60,000 plates/m
3-7.5 cm, 1-4.6 mm i.d., 3 or 5 m particle size, 100,000 plates/m
Silica particles coated with thin organic films which are chemically or physically
bonded to the surface, alumina particles, porous polymer, ion-exchange resin
60
HPLC Columns
61
Guard Column
Positioned ahead of analytical column
Remove particulate matter and contaminants
Increase the life time of the analytical column
62
Detector
Low dead volume: minimize extra column band broadening
UV-Vis
Fluorescence
Electrochemical
Refractive index
Conductivity
Mass Spectrometry
FT-IR
From column
Light Source
Flow Cell
Detector
To waste
63
UV-Vis Detectors
Diode-Array UV-Vis
UV-Vis
64
Fluorescence Detector
65
Refractive Index
Deflection detector
Reflective detector
66