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Diagnostic des infections à gonocoque par techniques moléculaires
Chlamydia
par techniques moléculaires
mardi 11 septembre 2012 H. Hochard, C. Delamare CHR Metz-Thionville
EPIDEMIOLOGIE
Neisseria gonorrhoeae (NG)
• Plus de déclaration obligatoire depuis 2000 pas de données de prévalence • Estimation de l’incidence grâce aux réseaux :
RENAGO
de laboratoires, dont les patients consultent majoritairement en médecine de ville
RésIST
de cliniciens, dont les patients consultent quasi exclusivement dans des structures spécialisées (CIDDIST et CDAG) Renago, 2008
Réseaux de surveillance
• augmentation des infections gonococciques • population homosexuelle masculine, mais aussi hétérosexuelle masculine et féminine • médiane âge femmes infectées 24 ans vs 27 ans pour les hommes • portage asymptomatique (plus fréquent +++ chez la femme : 50-90 % vs < 1 % chez l’homme), favorise la transmission • augmentation des résistances
Évolution du nombre moyen de gonocoques isolés par laboratoire actif et par an selon le sexe (réseau Rénago) Augmentation de la fréquence de l’infection chez l’homme (+26%) comme chez la femme (+33%) entre 2008 et 2009
Évolution du nombre moyen de gonococcies par site participant et par an selon le sexe (réseau RésIST)
• Absence de recommandations de dépistage en France • Recommandations européennes (IUSTI - OMS, 2001, actualisées 2008)
En présence de symptômes
symptômes ou signes d’écoulements urétraux chez l’homme orchi épididymite chez l’homme de moins de 40 ans écoulement vaginal avec facteurs de risque d’IST cervicite mucopurulente inflammation pelvienne aiguë
En l’absence de symptômes
jeune adulte dépisté pour une IST partenaire sexuel d’une personne ayant une IST ou une atteinte inflammatoire pelvienne nouveaux ou multiples partenaires
Chlamydia trachomatis (CT)
• 1 er agent bactérien responsable d’IST dans les pays industrialisés • Réseau de surveillance :
RENACHLA
(laboratoires) incidence ≈ 4 % infections asymptomatiques chez 75 % des femmes prévalence varie en fonction : et 50 % des hommes ― des populations étudiées (lieu de recrutement) ― de l’âge : maximale chez les femmes de 18 à 24 ans et chez les hommes de 25 à 30 ans
Chlamydia trachomatis (CT)
Réseau Rénachla
HOMMES Augmentation du nombre de diagnostics de 19 % chez l’homme entre 2008 et 2009
Réseau Rénachla
FEMMES Augmentation du nombre de diagnostics de 25 % chez la femme entre 2008 et 2009
Estimation de la prévalence en France des infections à CT dans la population générale
• 2 580 personnes testées • 18 - 44 ans • Auto-prélèvement vaginal (femmes) ou urine (hommes) : à domicile – 18 - 44 ans : • Hommes = 1,4% • Femmes = 1,6% – 18 - 29 ans : • Hommes = 2,5% • Femmes = 3,2%
Prevalence of Chlamydia trachomatis: results from the first national population-based survey in France.
Goulet V, de Barbeyrac B, Raherison S, Prudhomme M, Semaille C, Warszawsk J; CSF group.
Sex Transm Infect. 2010 Aug;86(4):263-70.
• HAS 2003 • personne symptomatique • CIDDIST, CDAG : dépistage systématique chez les femmes de 15 à 25 ans et les hommes < 30 ans • quels que soient l’âge et le sexe si >1 partenaire dans l’année • un ou une partenaire infecté(e) à C.trachomatis
DIAGNOSTIC
Neisseria gonorrhoeae
• Diagnostic direct – détection de Neisseria gonorrhoeae dans les différents milieux accessibles à un prélèvement (urètre, endocol, urines…) • par culture • détection du génome bactérien par biologie
moléculaire
• Diagnostic indirect : sérologique, qui met en évidence les anticorps – inapproprié dans le cadre d’un dépistage et d’un diagnostic
Chlamydia trachomatis
• Détection du génome bactérien par biologie
moléculaire avec amplification génique
– Sensibilité > 95% – Spécificité > 99% • Adaptée dans toute situation clinique et pour tout type
de prélèvement
• Les techniques de détection directe de CT par identification des inclusions intracellulaires sur culture ne sont plus recommandées.
• Il est préconisé de ne plus utiliser la technique de détection directe par méthode immunologique.
• Aucun intérêt de la sérologie dans les infections basses
DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE DE L’INFECTION Á CHLAMYDIA TRACHOMATIS HAS Juillet 2010
• Culture (NG) endocol urètre écoulement urétral anal pharyngé
Les prélèvements
• Tests moléculaires
vagin (auto prélèvement)
endocol urètre
sperme urine
anal pharyngé
Les milieux de transport
• Culture (NG) milieu de transport gélosé
! inhibition PCR
• Tests moléculaires
(1 seul écouvillon pour NG et CT )
matériel de prélèvement avec milieux de transport spécifiques aux différents tests de diagnostic moléculaire non interchangeables
important d’adresser au laboratoire le milieu en adéquation avec la technique de diagnostic
à titre d’exemple : – milieu Abbott contient du thiocyanate de guanidium qui inhibe la PCR Cobas Roche, car la libération des acides nucléiques associée a cette technique est une lyse et non une extraction n’élimine pas le thiocyanate
NG : La microscopie
(coloration de Gram)
• réalisée en systématique pour toute demande de culture • visualisation directe du gonocoque sous la forme de diplocoques à Gram négatif intracellulaires « en grain de café » • sensibilité : – élevée en cas d’urétrite aiguë chez l’homme (sensibilité > 95 %) – mauvaise chez les hommes asymptomatiques (50 à 75 %) et chez la femme à partir des prélèvements endocervicaux et urétraux (respectivement 45 à 65 % et 20 %) • non adaptée aux localisations anorectales et pharyngées – présence de cocci à Gram négatif appartenant à d’autres espèces bactériennes – sensibilité ≤ 40 %
NG : La culture
• Patients symptomatiques : méthode de référence {IUSTI/WHO 2008} • Milieu de culture (gélose chocolat) sélectif contenant des antibiotiques (VCN) // Milieu non sélectif • Avantages : – faible coût – sensibilité : 90% (80 à 96 % selon les études) pour les prélèvements d’urètre, ≈ 80-90 % pour les prélèvements cervicaux – permet la réalisation d’un antibiogramme et d’un typage pour les études épidémiologiques • Inconvénients : – nécessité d’effectuer des prélèvements invasifs – transport rapide vers le laboratoire – délai d’obtention des résultats de 2 à 3 jours – sensibilité faible pour pharynx et anus (respectivement < 50 % et < 60 %)
Les tests de biologie moléculaire
• Détection des acides nucléiques du génome bactérien
(ADN ou ARN)
• Différentes techniques : – ( hybridation moléculaire ) – techniques d’amplification génique • PCR • TMA • SDA
PCR
( Polymerase chain reaction ) • Amplification cyclique d’un
segment d’ADN cible
• 3 températures : – 95°C : dénaturation de l’ADN – entre 50 et 65°C : hybridation des amorces oligonucléotidiques complémentaires à leurs régions cibles – 70°C : élongation dans le sens 5’→ 3’ des amorces par Taq polymérase
40 cycles : 10 6 fois la cible
SDA
( Strand Displacement Amplification ou amplification par déplacement de brin ) • Amplification isothermique d’ADN • 2 enzymes thermorésistantes : – une enzyme de restriction – une ADN polymérase • 2 couples d'amorces • ADN cible possédant ce site de restriction est généré à l'aide de la polymérase
TMA
(Transcription Mediated Amplification) • Amplification isothermique d’ARN (via un intermédiaire ADN) • 2 enzymes : – ARN polymérase – transcriptase inverse (+ RNAse) • synthèse d’un ADN double brin transcriptible en ARN par la transcriptase inverse • amplification par l’ARN polymérase : transcription d’une série d’ARNs (50 à 100 copies) • Les ARNs synthétisés servent à leur tour de matrice pour la synthèse d’un ADNdb.
Sonde d’hybridation
• Hybridation directe à l’aide de sondes ADN – Gen-Probe PACE 2 ® gonocoque) (sonde ADN qui s’hybride à l’ARN ribosomal du • peu utilisée en France pour NG : moins sensible et moins spécifique que la culture pas utilisée pour CT
Roche Cobas Amplicor CT/NG® Automatisation oui Abbott RealTime CT/NG® oui BD ProbeTec CT/NG® oui Technique d’amplification Système de détection Prélèvements acceptés PCR colorimétrie Urine Urétral Endo-cervical PCR fluorescence Urine Urétral Endo-cervical Vaginal SDA fluorescence Urine Urétral Endo-cervical Gen-Probe Aptima Combo 2 CT/NG® oui TMA chemiluminescence Urine Urétral Endo-cervical Vaginal
Sensibilité des techniques
• NG : sensibilité = 96,0 à 97,8 %
spécificité = 98,1 à 98,9 %
• CT : sensibilité = 88,9 à 95,9 % spécificité = 96,6 à 98,9 %
Performance des tests moléculaires
• Sensibilité et spécificité élevées – varient en fonction de la technique d'amplification utilisée et du site de prélèvement • Sensibilité sur les prélèvements cervicaux > urine (Sensibilité sur les prélèvements urétraux légèrement > urine) • Chez les individus asymptomatiques : performance des tests moléculaires supérieure à celle de la culture (NG)
NG : Nécessité de confirmer les résultats du test initial par une autre technique d’amplification ?
• Existence de résultats faux-positifs, quelle que soit la technique d’amplification • Contrôle des positifs par une autre technique, ciblant une séquence différente du génome • CHR Metz-Thionville, laboratoire de Metz : collaboration avec Dr Patricia Franck Responsable Filière Biologie médicale Maternité régionale universitaire de Nancy
Avantages des techniques moléculaires
• détection possible dans des prélèvements inadaptés à la culture (urine, prélèvements vaginaux) • ne requièrent pas la viabilité des bactéries • milieux de transport stables plusieurs jours • délai de rendu des résultats plus court • automatisation adaptation aux grandes séries
Mise en place de la méthode
Abbott RealTime CT/NG
®
au laboratoire de Metz
• Etude réalisée en 2010 (6 mois) • 1085 prélèvements : - 36 reçus (31 patients) pour recherche spécifique de Neisseria gonorrhoeae - 1049 reçus pour recherche de Chlamydia trachomatis • Origine des prélèvements : dont 12% vagin
Résultats
• Recherche spécifique de Neisseria gonorrhoeae : 31 patients CIDDIST (9 femmes et 22 hommes) Age médian : 25 ans Symptomatiques : 3 femmes (33%) et 10 hommes (45%)
Positifs NG
: 3 patients (1 femme, 2 hommes) =
9.7%
Résultats
• Recherche systématique de Neisseria gonorrhoeae : 1049 patients 322 CIDDIST - Age médian : 22 ans - Symptomatiques : 11 (3,4%) - Facteurs de risque : 159 (49%) - Positifs NG : 0 727 Gynécologie-Obstétrique - 164 grossesses asymptomatiques • Positifs NG : 2 (0,19%) - 563 UGO dont 468 symptomatiques • Positifs NG : 0
Conclusion
• Fréquence chez les sujets
asympto = 0,34 %
(2/588) • Fréquence chez les sujets
sympto = 0,61 %
(3/492) Au total : 5/1080 soit
0,46 %
2011 - août 2012
• 6251 prélèvements • recherche de NG sur prescription : 361 – 291 CIDDIST – 45 UGO – 18 extérieurs – 7 prison • Positifs CT : 4,7 % (293) • Positifs NG : 0,66 % (41) (0,46 % en 2010) – recherche sur prescription (18/361) :
4,99 %
– recherche systématique (23/5889) :
0,39 %
CONCLUSION
Neisseria gonorrhoeae
• Patient symptomatique : culture = gold standard – homme : écoulement, urètre – femme : sécrétions endocol SAUF localisations anales et pharyngées : biologie moléculaire (sensibilité >> culture) La culture peut être associée à la biologie moléculaire si les conditions de transport risquent d’affecter la survie de NG (délai d’acheminement, température).
• Personne asymptomatique (dépistage) : biologie moléculaire (tests multiplex NG/CT) performance > culture prélèvements non invasifs (meilleure acceptabilité) – homme : 1 er jet urine – femme : auto-prélèvement vaginal – si positif : • confirmer par 2 ème technique de biologie moléculaire ciblant une séquence différente (taux prévalence population dépistée < 5%) • reprélever pour culture et antibiogramme
Chlamydia trachomatis
• Toutes les recherches s’effectuent par techniques
moléculaires.
– homme sympto/asympto : 1 er jet urine (urètre) – femme symptomatique : endocol (+ urètre ou vagin) asymptomatique : auto-plvt vaginal (1 er jet urine)