Transcript Identifikasi Bakteri Indigenous Pereduksi Logam Berat Cr (VI)
Slide 1
IDENTIFIKASI BAKTERI INDIGENOUS PEREDUKSI
LOGAM BERAT CR (VI) DENGAN METODE
MOLEKULER DI SUNGAI CIKIJING RANCAEKEK
JAWA BARAT
SEMINAR KOLOKIUM
SYAFRUDIN LEWARU
230110080114
PROGRAM STUDI PERIKANAN
FA K U LTA S P E R I K A N A N D A N I L M U K E L A U TA N
U N I V E R S I TA S PA D J A DJ A R A N
2 01 2
Slide 2
• Pencemaran sungai akibat pembangunan
• Pencemaran di sungai Cikijing telah terjadi akibat dari
pembuangan limbah yang pada umumnya berasal dari
industri tekstil yang berupa Cr, Cu, dan Zn (Andarani dan
Roosmini, 2010).
• metode biologi atau biodegradasi oleh mikroorganisme
merupakan salah satu cara yang tepat (Feliatra (1996) dalam
Dharmawibawa (2004))
• Badan sungai dengan nilai pH > 5, kromium yang terbentuk
berupa kromium Cr (VI) (Effendi, 2003 dalam Agustinus,
2010).
• Identifikasi Bakteri dengan Metode Molekuler lebih cepat
dan akurat (Suryanto, 2003).
Slide 3
Identifikasi Masalah
Seberapa besar potensi
bakteri indigenous sebagai
pereduksi logam berat Cr (VI)
yang diisolasi dari Sungai
Cikijing Rancaekek Kabupaten
Bandung.
Slide 4
Tujuan Penelitian
Untuk mencari bakteri-bakteri potensial
yang bisa menjadi kandidat agen
bioremediasi logam Cr (VI) di sungai
Cikijing Rancaekek.
Slide 5
Manfaat Penelitian
untuk mengetahui jenis bakteri pereduksi
logam berat Cr (VI) di Sungai Cikijing
Rancaekek Kabupaten Bandung, sehingga
kedepannya dapat menjadi referensi
sebagai pengurang beban pencemaran
akibat logam berat Cr di sungai tersebut
atau wilayah lain.
Slide 6
Pendekatan Masalah
Pencemaran
sungai
Sungai Cikijing
Tercemar logam
dari Tekstil
Cr, Cu, dan Zn
Identifikasi
Molekuler
Bakteri sebagai
agen biodegradasi
Bakteri
Indigenous
Pereduksi
Logam Cr (VI)
Slide 7
1. Lokasi Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium
Bioteknologi Perikanan dan Kelautan
Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan
Universitas Padjadjaran. Sampel bakteri
diperoleh dari Sungai Cikijing Rancaekek
Kabupaten Bandung Jawa Barat.
2. Waktu Penelitian
Waktu penelitian adalah 5 bulan, dimulai dari
bulan Maret sampai dengan bulan Juli 2012.
Slide 8
3. Alat dan Bahan
ALAT
Proses isolasi Bakteri dan Uji Resistensi
Erlenmeyer, Thermometer, Indikator universa,
Kamera digital, Tabung reaksi , Rak tabung
reaksi,Pipet, Mikropipet, Bunsen , Cawan petri,
Jarum ose, L glass, Plastik wrap, Laminar,
Inkubator , Timbangan digital, Alumunium foil ,
Autoklaf , Gelas, Plastic, Kertas Oven, Labu
Erlenmeyer, Hot plate, Stearer , Kertas label
Slide 9
Identifikasi Bakteri dengan 16S rRNA
Ekstraksi DNA:
Rak micro tube, Micro pipet, Centrifuge,Timer, Micro
Tube,Timbangan analitik, , Vortex
PCR (Amplifikasi)
Thermal cycler, Microtube, Micropipet,
Elektroforesis gel agarose:
Gelas ukur,Timbangan analitik, Cetakan gel agarose , Hot
Plate/Magnetic Stirrer, Alat elektroforesis, Power supply,
Ultraviolet Transilluminator, Sendok pipih, Kamera,
Komputer.
Slide 10
BAHAN
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini
meliputi :
Isolat Bakteri dan Uji Resistensi
1. Sampel Air dan sedimen
2. Nutrien Agar (NA)
3. Nutrien Broth (NB)
4. NaCl fisiologis
5. Akuades
6. Alkohol 70%
7. Spirtus
8. Cr Powder (K2CrO4)
9. DPC
10. Asam Sulfat (H2SO4)
Slide 11
Identifikasi Bakteri
Isolasi DNA Bakteri
• Nuclease free water (NFW)
• Solution I : 50 mM Glucos, 25 mM Tris.Cl (pH 8),
10 mM EDTA (pH 8)
• Solution II : 0,2 N NaOH, 1 % SDS
• Solution III : 5 M Potasium Asetat 60 mL, Asam
Asetat Glasial 11,5 mL, H2O 28,5 mL.
• Es curai
• Ethanol Absolute dan ethanol 70%
• TE 1/10
Slide 12
Amplifikasi
• DNA template
• PCR Master Mix (KAPA 2G FAST)
• Primer Forward F 16S rRNA
• Primer Reverse R 16S rRNA
• Nuclease Free Water
Elektroforesis
• Gel agarose
• Larutan pemberat dan pewarna (Loading dye)
• Larutan Tris glacial acetate acid EDTA (TAE)
• Ethidium Bromide (EtBr)
• PCR marker (Ikb Ladder)
• Aquades
Slide 13
PROSEDUR
PENELITIAN
Kultivasi/Isolasi
Bakteri
Sterelisasi Alat
Uji Tantang Bakteri
Pengambilan Sampel
Air dan Sedimen
Uji Reduksi Bakteri
Identifikasi
Molekuler
Sequencing
Analisis
Bioinformatik
Slide 14
2.Kultivasi Bakteri
1. Sampel diencerkan dengan NaCl fisiologis di dalam
tabung reaksi. Sampel air sungai sebanyak 1 mL dan
sedimen sebanyak 1 g, lalu masukkan masing-masing
sampel ke dalam tabung pengencer yang masingmasing berisi 9 mL akuades secara aseptis.
2. Membuat pengenceran sampel pada tabung yang lain
sampai 10-4, 10-5, dan 10-6
3. Memindahkan 1 ml biakan dari tabung pengencer ke
atas media Nutrien Agar yang telah disiapkan di dalam
cawan petri, kemudian ratakan dengan batang L
4. Diinkubasikan pada suhu 30oC selama 2-3 hari
Slide 15
5.
6.
7.
Setelah terlihat ada partumbuhan bakteri,
diambil single koloni secepatnya dan goreskan
atau pindahkan ke media NA yang baru.
Setelah terlihat tumbuh kembali pada media
baru, lalu dilanjuti pemurnian isolate hingga
benar-benar tidak ada isolate lain yang
tumbuh
Setelah murni, isolat dikultur dalam medium
NA yang telah diperkaya K2CrO4 0,2 mg/L
Isolat diperbanyak dalam media agar miring
dan cawan petri untuk dilakukan uji
karakteristik isolat
Slide 16
3. Uji Tantang
1. Setelah didapatkan beberapa isolat murni bakteri, lalu
bakteri diinokulasikan ke dalam medium cair Nutrien
Broth (NB) yang telah diperkaya K2CrO4 dengan
konsentrasi masing-masing 50, 150, 500, 1000, dan
1500 ppm.
2. Kemudian diinkubasikan kedalam incubator shaker
selama 18 jam pada suhu 37oC dengan kecepatan 220
rpm, untuk melihat ketahanan bakteri terhadap logam
berat.
3. Kemudian masing-masing bakteri setiap perlakuan
diukur nilai Optical Density (OD) dengan panjang
gelombang 600 nm untuk mengetahui tingkat
kepadatan bakteri pada spektrofotometer
Slide 17
4. Setelah diketahui beberapa isolate yang
bertahan terhadap logam berat berdasarkan
tingkat kepadatan, diambil yang tertinggi
untuk dilanjutkan ke tahap uji reduksi
5. Setelah diamati, dan diperoleh beberapa
isolate yang dapat mereduksi logam Cr (VI),
lalu diteruskan identifikasi bakteri dengan
metode PCR dengan 16S rRNA
Slide 18
4. Uji Reduksi Bakteri
1. Setelah didapatkan bakteri tahan Cr (VI), lalu
bakteri diinokulasikan ke dalam medium cair
Nutrien Broth (NB) yang telah diperkaya K2CrO4
dengan konsentrasi masing-masing 300, 700,
dan 1000 ppm.
2. Kemudian diinkubasikan kedalam incubator
shaker selama ±24 jam pada suhu 37oC dengan
kecepatan 220 rpm
3. Sentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm
selama 5 menit, masing-masing konsentrasi
untuk mendapatkan supernatan cairan Cr (VI)
Slide 19
4. Buat kompleks Cr dalam tabung reaksi dari
supernatan dengan komposisi : 12,5 mL
Aquades pH 3, 250 µL Larutan Diphenil
Charbazida 1g/400 mL aseton, sampel yang
sesuai dengan faktor pengenceran
5. Diukur absorbansinya di dalam
spektrofotometer dengan panjang gelombang
540 nm.
6. Plotkan pada nilai kurva standar yang telah
dibuat (y = 0,1057x + 0,0025)
Slide 20
4. METODE MOLEKULER
Isolasi DNA genom bakteri
Metode isolasi DNA genom bakteri yang digunakan adalah metode
Alkaline Lysis. Dijelaskan sebagai berikut:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Setiap kultur dipindahkan ke dalam tabung eppendorf 1,5 mL
dan disentrifugasi selama 30 detik pada kecepatan 1200 rpm
Kemudian supernatan dibuang
Lalu sebanyak 100 μL larutan I (resuspension solution)
ditambahkan ke dalam tiap tabung lalu diresuspensi dengan divortex.
Selanjutnya ke dalam tiap tabung ditambahkan 200 μL larutan
II (lysis solution) lalu dicampur dengan membolak-balikkan
tabung beberapa kali dan biarkan lysis terjadi selama 2-3 menit
di dalam es
Setelah itu, sebanyak 150 μL larutan III (neutralizing solution)
ditambahkan (on ice) lalu di-vortex
Lalu didiamkan selama 3-5 menit di dalam es.
Slide 21
7.
8.
9.
10.
11.
Kemudian tabung disentrifugasi dengan kecepatan
12000 rpm selama 5 menit dalam microcentrifuge.
Supernatan yang diperoleh dipindahkan ke dalam tube
baru, ditambah ethanol absolute 2x volume larutan
alkalin lysis (±900µL), lalu di-vortex
Lalu disentrifugasi pada 12000 rpm selama 5 menit.
Kemudian supernatannya dibuang.
Lalu sebanyak 1 mL etanol (EtOH) 70% ditambahkan
dan disentrifugasi kembali selama 5 menit. Kemudian
supernatannya dibuang dengan cara dibalikkan
sampai kering ±10 menit . Akan terlihat pelet DNA
Pelet DNA dikeringkan, lalu diresuspensi dalam 30 μL
buffer TE dan di-flick kemudian disimpan pada suhu 20°C.
Slide 22
Amplifikasi DNA dengan PCR (Sadi, 2009)
• Amplifikasi ini menggunakan primer 16S rRNA
Primer
Urutan Nukleotida
9F
5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG
1492R
5’-GGCTACCTTGTTACGACTT
Komponen PCR
Deionized water
Konsentrasi Akhir
-
50 μL GoTaq Green Master Mix
1x
Primer forward
2 μL
Primer reverse
2 μL
DNA template
-
Slide 23
Pengaturan Program PCR
Siklus
Suhu
Waktu
Jumlah Siklus
Inisialisasi
95 oC
2 menit
1
-
Denaturasi
95 oC
30 detik
-
Annealing
55 oC
30 detik
-
Elongasi
75 oC
1 menit
Final elongasi
75 oC
5 menit
1
Final hold
4 oC
-
1
30
Slide 24
Elektroforesis
Proses pembuatan gel agaros 1 % dengan
mencampurkan bubuk agarosa sebanyak 0,4 g dalam
TBE 40 ml (Thris-Borate EDTA). Gel agarose
direndam secara sub marine atau terendam
seluruhnya dalam running buffer yaitu TBE. 10 uL
DNA hasil PCR dan penanda berat molekul
dimasukkan ke dalam sumur-sumur gel. Voltase yang
digunakan ntuk proses elektroforesis adalah 75 volt,
dengan kuat arus 100 mA selama 60 menit.
Slide 25
5. Analisis Bioinformatik
Hasil purifikasi produk PCR 16S rRNA
kemudian dilakukan sequencing dan
selanjutnya dianalisis menggunakan
perangkat bioinformatik (bioedit) dan
dicocokan dengan data di
www.ncbi.nih.nlm.gov melalui program
BLAST untuk menentukan jenis dari 4
isolat tersebut dari database yang ada.
Slide 26
HASIL PENELITIAN
ISOLASI BAKTERII
Uji Tantang Bakteri
POTENSI BAKTERI
Uji Reduksi Bakteri
Sequencing
Analisis Bioinformatika
Identifikasi Molekuler
Slide 27
1. ISOLASI BAKTERI
• medium padat NA tetapi diperkaya oleh
K2CrO4 sebesar 0,2 mg/L.
• Pada tahap ini didapat 13 isolat bakteri murni
yang dapat bertahan pada medium. Setelah
itu. Dari 13 isolat bakteri yang telah diisolasi
hanya 10 isolat bakteri yang benar-benar
murni
Slide 28
Slide 29
2. Uji Tantang Bakteri Terhadap Cr (VI)
Nutrien Broth (NB) yang diperkaya dengan
K2CrO4 konsentrasi 50, 150, 500, 1000, dan
1500 ppm.
Slide 30
Isolat Bakteri dengan Nilai OD 600 nm
Tertinggi pada 1500 ppm
Kode Bakteri
Optical Density
(OD)
S.3.14
1,125
A.3.3
0,366
A.2.1
0,348.
Slide 31
3. Uji Reduksi Bakteri terhadap Cr (VI)
• Uji ini dilakukan pada konsentrasi K2CrO4
yaitu 300, 700, dan 1000 ppm didalam
medium cair Nutrien Broth (NB).
• Perhitungan jumlah reduksi bakteri terhadap
Cr (VI) dilakukan dengan Diphenyl Carbazida
(DPC) sebagai indikator Cr (VI)
• Kurva Standar y = 0,1057x + 0,0025
• Absorbansi Reduksi
Slide 32
Penurunan Jumlah Konsentrasi Cr (VI)
Selama ±24 jam
Bakteri
A.3.3
A.2.1
S.3.14
Konsentrasi Awal
Konsentrasi Akhir
Total Reduksi
(ppm)
(ppm)
(ppm)
314,56
210,50
104,06
799,4
80,42
718,98
1083,25
468,30
614,95
314,56
295,65
18,91
799,4
298,013
501,387
1083,25
553,40
529,85
314,56
224,69
89,87
799,4
250,709
548,69
1083,25
856,20
227,05
Slide 33
A.3.3
A.2.1
S.3.14
1000 Blank
Uji Reduksi pada 1000 ppm
Slide 34
4. IDENTIFIKASI MOLEKULER 16S RRNA
Primer yang digunakan adalah primer 16S rRNA
dengan urutan basa primer
9F (5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG) dan
1492R (5’-GGCTACCTTGTTACGACTT)
(Sadi, 2009).
proses isolasi DNA dengan metode Alkalyne
Lysis dari Sambrook (1989).
Slide 35
Hasil Elektroforesis Amplikon
Keterangan :
M = Marker
1500 bp = Panjang pita DNA
A.3.3 = Isolat DNA bakteri
S.3.14 = Isolat DNA bakteri
Slide 36
Hasil Purifikasi
Sumber : 1st BASE
Ket :
DNA 1 yaitu isolat bakteri A.3.3
DNA 2 yaitu isolat bakteri S.3.14
Slide 37
Sequencing A.3.3
Forward :
Sumber : 1st BASE
NGGCGGTGGGGGGGGCTTATAATGCAAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAA
GTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCG
GGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCT
TCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCA
AGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCC
CAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGC
AACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAG
TGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGC
CAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGC
GCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAA
CTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAG
AGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGC
GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTG
CTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGG
GAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGG
AGCATGTGGGTTTAATTCTAAGCCACCGCGAAAAAACCTTACCATGGTCTTGGACATCCTCTG
GAAAAACCCTAAAGGAAATGGGCTTCCTCTTTTCGGGAGCAAAGTTGACCAGGTGGTGCCTT
GGTTTGTCCCCCCCCTCCTTGCCTTTT
Slide 38
•
Reverse :
ACCCTTGTTTCACCTTTAGGCGGCTGGCTCAAAAAGGTTACCCCACCGACTTCGGGTGTTAC
AAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATG
CTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACT
GAGAACGGTTTTATGAGATTAGCTCCACCTCGCGGTCTTGCAGCTCTTTGTACCGTCCATTGT
AGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCC
GGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTTAATGATGGCAACTAAGATCAAGGGT
TGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACC
ACCTGTCACTCTGCTCCCGAAGGAGAAGCCCTATCTCTAGGGTTTTCAGAGGATGTCAAGAC
CTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCC
CGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTT
AACTTCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGAC
TACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGTGTCAGTTACAGACCA
GAAAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCATATCTCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAA
TTCCACTTTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGCCGT
GGGCTTTCACATCAGACTTAGGAAACCACCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGATA
ACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTA
GGTACCGTCAAGGTGCCAGCTTATTCGACTAGCACTGGTTCTTCCCTAACAACAGAGTTTTA
CGACCCGAAAGCTTCGTCACTAAGGCGGCGTTGCTCGTCAGACTTTCGTCAATGCGGGAGA
TTCCTGCTGCTGCCGCCGTAAGAAGCTGGGACGTGGTTCAGTCCCAGGTGGCCAATCACCT
TTCAGGGGGCTAAGCATGGTGCCTTGGGAGGCGTAACGCCCCAATAGCTAAGGGACGGGG
GTCTT
Slide 39
Sequencing S.3.14
Sumber : 1st BASE
• Forward :
AGGCCCTTGCGGCGTGCTATACATGCAGTCGAGCGAACAGATAAGGAGCTTGCTCCTTTGACGTTAG
CGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTACCTATAAGACTGGAATAACTCCGGGAAACCGGG
GCTAATGCCGGATAACATTTAGAACCGCATGGTTCTAAAGTGAAAGATGGTTTTGCTATCACTTATAGA
TGGACCCGCGCCGTATTAGCTAGTTGGTAAGGTAATGGCTTACCAAGGCAACGATACGTAGCCGACCT
GAGAGGGTGATCGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGG
GAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGGTTTCGGCTC
GTAAAACTCTGTTATTAGGGAAGAACAAACGTGTAAGTAACTGTGCACGTCTTGACGGTACCTAATCA
GAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATT
ATTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGA
GGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAA
ATGCGCAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACGCTGATGT
GCGAAAGCGTGGGGATCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAA
GTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGA
CCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATT
CGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAAATCTTGACATCCTTTGACCACTCTAGAGATAGAGTTTTCCCC
TTCGGGGGACAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGAGAGATGTTGGGTTAA
GTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTAAACTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCAATCTAGGTTGACTGCC
GGGTGACAAACCGGAAGGAAGGCTGGGGATGACGTCCAATCATCATGGCCCCTTATGATTTGGGCTA
CCACCGTGCTTAAATGGAAAAAACAAAGGGCAGCTAAACCGGCGAGGCATGGCAAATCCCATAAAGT
TGTTTCCCAGNCCGGAAA
Slide 40
•
Reverse :
CCCCTTTGTTCCCCTTCGACGGCTAGCTCCATAAATGGTTACTCCACCGGCTTCGGGTGTTAC
AAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAACGTATTCACCGTAGCATG
CTGATCTACGATTACTAGCGATTCCAGCTTCATGTAGTCGAGTTGCAGACTACAATCCGAACT
GAGAACAACTTTATGGGATTTGCATGACCTCGCGGTTTAGCTGCCCTTTGTATTGTCCATTGT
AGCACGTGTGTAGCCCAAATCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCG
GTTTGTCACCGGCAGTCAACCTAGAGTGCCCAACTAAATGCTGGCAACTAAGTTTAAGGGTT
GCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCA
CCTGTCACTTTGTCCCCCGAAGGGGAAAACTCTATCTCTAGAGTGGTCAAAGGATGTCAAGA
TTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGTCC
CCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGT
TAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGG
ACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGATCCCCACGCTTTCGCACATCAGCGTCAGTTACAGAC
CAGAAAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCATATCTCTGCGCATTTCACCGCTACACATGG
AATTCCACTTTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGCC
GTGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTACGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGA
TAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAATTAGCCCGTGGCTTTCGGAT
TAGGTACCGTCAAGACGTGCACAGTTACTTACACGGTTTGTTCTTCCCTAAATAACAGAGTTT
TACGAAGCCGAAACCCCTTCATCACTCCCGCCGGCGTTTGCTCCCGTCAGGCTTTTCGTCCA
TTTGGGGAAAAATTCCCTAACTGGCTGCCTCCCCGGAAGGAATCTGGGACCGGGGTCTCAG
GTTCCCA
Slide 41
5. Analisis Bioinformatika
www.ncbi.nih.nlm.gov
Kode
Bakteri
A.3.3
S.3.14
Description
Bacillus
thuringiensis
strain IAM 12077
Staphylococcus
Arlettae
strain ATCC 43957
Max score
Total
score
Query
Max ident
coverage
2338
2338
98%
95%
2438
2438
99%
96%
Slide 42
Bacillus Thuringiensis
mendegradasi minyak diesel (Kebria et al. 2009)
mereduksi Cr (VI) dari 100 mg/L menjadi 20
mg/L selama 115 jam (Meli, 2009)
dijadikan sebagai agen biologi pemberantasan
hama pada tanaman (Kumar, 2008)
mendegradasi PCB (polychlorinated bifenyls)
sebesar 75% dalam konsentrasi PCB tinggi
(Rojas-(Avelizapa et al. 1999 dalam Erdogan et
al. 2011)
dapat mereduksi Cr (VI) 1083,25 ppm menjadi
468,30 ppm selama ±24 jam.
Slide 43
Slide 44
Staphylococcus Arlettae
menghilangkan cemaran warna pada limbah
tekstil (Elisangela et al. 2008)
Dapat resisten dan mereduksi Cr (VI)(Bopp
and Ehlich (1988), Kouadjo dan Zeze (2010),
Zolfaghary (2012) )
mereduksi Cr (VI) dari 1083,25 ppm menjadi
856,20 ppm selama ±24 jam.
Slide 45
Slide 46
7. KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Dari kesepuluh isolat bakteri yang diperoleh, isolat bakteri dengan
kode A.3.3 dan S.3.14 yang memiliki daya reduksi dalam medium NB
yang diperkaya K2CrO4 paling tinggi yaitu dengan total reduksi
614,95 ppm dan 227,05 ppm dari konsentrasi awal 1083,25 ppm.
Bakteri S.3.14 adalah Staphylococcus Arlettae strain ATCC 43957
dengan nilai Query Coverage 99 % dan keidentikan maksimum
sebesar 96 %
Saran
1. dilanjutkan penelitian potensi isolat bakteri yang diperoleh
selain mereduksi logam Cr (VI).
2. penelitian bioremediasi dengan memanfaatkan bakteri dalam
skala lapangan (in vivo)
Slide 47
LOKASI PENGAMBILAN SAMPEL
UTARA
Sumber : googlemaps.com
Slide 48
ISOLAT BAKTERI
Slide 49
Slide 50
Konsentrasi
Absorbansi
0
0
0,2
0,024
0,4
0,045
0,6
0,072
0,8
0,085
1
0,106
Slide 51
Slide 52
IDENTIFIKASI BAKTERI INDIGENOUS PEREDUKSI
LOGAM BERAT CR (VI) DENGAN METODE
MOLEKULER DI SUNGAI CIKIJING RANCAEKEK
JAWA BARAT
SEMINAR KOLOKIUM
SYAFRUDIN LEWARU
230110080114
PROGRAM STUDI PERIKANAN
FA K U LTA S P E R I K A N A N D A N I L M U K E L A U TA N
U N I V E R S I TA S PA D J A DJ A R A N
2 01 2
Slide 2
• Pencemaran sungai akibat pembangunan
• Pencemaran di sungai Cikijing telah terjadi akibat dari
pembuangan limbah yang pada umumnya berasal dari
industri tekstil yang berupa Cr, Cu, dan Zn (Andarani dan
Roosmini, 2010).
• metode biologi atau biodegradasi oleh mikroorganisme
merupakan salah satu cara yang tepat (Feliatra (1996) dalam
Dharmawibawa (2004))
• Badan sungai dengan nilai pH > 5, kromium yang terbentuk
berupa kromium Cr (VI) (Effendi, 2003 dalam Agustinus,
2010).
• Identifikasi Bakteri dengan Metode Molekuler lebih cepat
dan akurat (Suryanto, 2003).
Slide 3
Identifikasi Masalah
Seberapa besar potensi
bakteri indigenous sebagai
pereduksi logam berat Cr (VI)
yang diisolasi dari Sungai
Cikijing Rancaekek Kabupaten
Bandung.
Slide 4
Tujuan Penelitian
Untuk mencari bakteri-bakteri potensial
yang bisa menjadi kandidat agen
bioremediasi logam Cr (VI) di sungai
Cikijing Rancaekek.
Slide 5
Manfaat Penelitian
untuk mengetahui jenis bakteri pereduksi
logam berat Cr (VI) di Sungai Cikijing
Rancaekek Kabupaten Bandung, sehingga
kedepannya dapat menjadi referensi
sebagai pengurang beban pencemaran
akibat logam berat Cr di sungai tersebut
atau wilayah lain.
Slide 6
Pendekatan Masalah
Pencemaran
sungai
Sungai Cikijing
Tercemar logam
dari Tekstil
Cr, Cu, dan Zn
Identifikasi
Molekuler
Bakteri sebagai
agen biodegradasi
Bakteri
Indigenous
Pereduksi
Logam Cr (VI)
Slide 7
1. Lokasi Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium
Bioteknologi Perikanan dan Kelautan
Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan
Universitas Padjadjaran. Sampel bakteri
diperoleh dari Sungai Cikijing Rancaekek
Kabupaten Bandung Jawa Barat.
2. Waktu Penelitian
Waktu penelitian adalah 5 bulan, dimulai dari
bulan Maret sampai dengan bulan Juli 2012.
Slide 8
3. Alat dan Bahan
ALAT
Proses isolasi Bakteri dan Uji Resistensi
Erlenmeyer, Thermometer, Indikator universa,
Kamera digital, Tabung reaksi , Rak tabung
reaksi,Pipet, Mikropipet, Bunsen , Cawan petri,
Jarum ose, L glass, Plastik wrap, Laminar,
Inkubator , Timbangan digital, Alumunium foil ,
Autoklaf , Gelas, Plastic, Kertas Oven, Labu
Erlenmeyer, Hot plate, Stearer , Kertas label
Slide 9
Identifikasi Bakteri dengan 16S rRNA
Ekstraksi DNA:
Rak micro tube, Micro pipet, Centrifuge,Timer, Micro
Tube,Timbangan analitik, , Vortex
PCR (Amplifikasi)
Thermal cycler, Microtube, Micropipet,
Elektroforesis gel agarose:
Gelas ukur,Timbangan analitik, Cetakan gel agarose , Hot
Plate/Magnetic Stirrer, Alat elektroforesis, Power supply,
Ultraviolet Transilluminator, Sendok pipih, Kamera,
Komputer.
Slide 10
BAHAN
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini
meliputi :
Isolat Bakteri dan Uji Resistensi
1. Sampel Air dan sedimen
2. Nutrien Agar (NA)
3. Nutrien Broth (NB)
4. NaCl fisiologis
5. Akuades
6. Alkohol 70%
7. Spirtus
8. Cr Powder (K2CrO4)
9. DPC
10. Asam Sulfat (H2SO4)
Slide 11
Identifikasi Bakteri
Isolasi DNA Bakteri
• Nuclease free water (NFW)
• Solution I : 50 mM Glucos, 25 mM Tris.Cl (pH 8),
10 mM EDTA (pH 8)
• Solution II : 0,2 N NaOH, 1 % SDS
• Solution III : 5 M Potasium Asetat 60 mL, Asam
Asetat Glasial 11,5 mL, H2O 28,5 mL.
• Es curai
• Ethanol Absolute dan ethanol 70%
• TE 1/10
Slide 12
Amplifikasi
• DNA template
• PCR Master Mix (KAPA 2G FAST)
• Primer Forward F 16S rRNA
• Primer Reverse R 16S rRNA
• Nuclease Free Water
Elektroforesis
• Gel agarose
• Larutan pemberat dan pewarna (Loading dye)
• Larutan Tris glacial acetate acid EDTA (TAE)
• Ethidium Bromide (EtBr)
• PCR marker (Ikb Ladder)
• Aquades
Slide 13
PROSEDUR
PENELITIAN
Kultivasi/Isolasi
Bakteri
Sterelisasi Alat
Uji Tantang Bakteri
Pengambilan Sampel
Air dan Sedimen
Uji Reduksi Bakteri
Identifikasi
Molekuler
Sequencing
Analisis
Bioinformatik
Slide 14
2.Kultivasi Bakteri
1. Sampel diencerkan dengan NaCl fisiologis di dalam
tabung reaksi. Sampel air sungai sebanyak 1 mL dan
sedimen sebanyak 1 g, lalu masukkan masing-masing
sampel ke dalam tabung pengencer yang masingmasing berisi 9 mL akuades secara aseptis.
2. Membuat pengenceran sampel pada tabung yang lain
sampai 10-4, 10-5, dan 10-6
3. Memindahkan 1 ml biakan dari tabung pengencer ke
atas media Nutrien Agar yang telah disiapkan di dalam
cawan petri, kemudian ratakan dengan batang L
4. Diinkubasikan pada suhu 30oC selama 2-3 hari
Slide 15
5.
6.
7.
Setelah terlihat ada partumbuhan bakteri,
diambil single koloni secepatnya dan goreskan
atau pindahkan ke media NA yang baru.
Setelah terlihat tumbuh kembali pada media
baru, lalu dilanjuti pemurnian isolate hingga
benar-benar tidak ada isolate lain yang
tumbuh
Setelah murni, isolat dikultur dalam medium
NA yang telah diperkaya K2CrO4 0,2 mg/L
Isolat diperbanyak dalam media agar miring
dan cawan petri untuk dilakukan uji
karakteristik isolat
Slide 16
3. Uji Tantang
1. Setelah didapatkan beberapa isolat murni bakteri, lalu
bakteri diinokulasikan ke dalam medium cair Nutrien
Broth (NB) yang telah diperkaya K2CrO4 dengan
konsentrasi masing-masing 50, 150, 500, 1000, dan
1500 ppm.
2. Kemudian diinkubasikan kedalam incubator shaker
selama 18 jam pada suhu 37oC dengan kecepatan 220
rpm, untuk melihat ketahanan bakteri terhadap logam
berat.
3. Kemudian masing-masing bakteri setiap perlakuan
diukur nilai Optical Density (OD) dengan panjang
gelombang 600 nm untuk mengetahui tingkat
kepadatan bakteri pada spektrofotometer
Slide 17
4. Setelah diketahui beberapa isolate yang
bertahan terhadap logam berat berdasarkan
tingkat kepadatan, diambil yang tertinggi
untuk dilanjutkan ke tahap uji reduksi
5. Setelah diamati, dan diperoleh beberapa
isolate yang dapat mereduksi logam Cr (VI),
lalu diteruskan identifikasi bakteri dengan
metode PCR dengan 16S rRNA
Slide 18
4. Uji Reduksi Bakteri
1. Setelah didapatkan bakteri tahan Cr (VI), lalu
bakteri diinokulasikan ke dalam medium cair
Nutrien Broth (NB) yang telah diperkaya K2CrO4
dengan konsentrasi masing-masing 300, 700,
dan 1000 ppm.
2. Kemudian diinkubasikan kedalam incubator
shaker selama ±24 jam pada suhu 37oC dengan
kecepatan 220 rpm
3. Sentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm
selama 5 menit, masing-masing konsentrasi
untuk mendapatkan supernatan cairan Cr (VI)
Slide 19
4. Buat kompleks Cr dalam tabung reaksi dari
supernatan dengan komposisi : 12,5 mL
Aquades pH 3, 250 µL Larutan Diphenil
Charbazida 1g/400 mL aseton, sampel yang
sesuai dengan faktor pengenceran
5. Diukur absorbansinya di dalam
spektrofotometer dengan panjang gelombang
540 nm.
6. Plotkan pada nilai kurva standar yang telah
dibuat (y = 0,1057x + 0,0025)
Slide 20
4. METODE MOLEKULER
Isolasi DNA genom bakteri
Metode isolasi DNA genom bakteri yang digunakan adalah metode
Alkaline Lysis. Dijelaskan sebagai berikut:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Setiap kultur dipindahkan ke dalam tabung eppendorf 1,5 mL
dan disentrifugasi selama 30 detik pada kecepatan 1200 rpm
Kemudian supernatan dibuang
Lalu sebanyak 100 μL larutan I (resuspension solution)
ditambahkan ke dalam tiap tabung lalu diresuspensi dengan divortex.
Selanjutnya ke dalam tiap tabung ditambahkan 200 μL larutan
II (lysis solution) lalu dicampur dengan membolak-balikkan
tabung beberapa kali dan biarkan lysis terjadi selama 2-3 menit
di dalam es
Setelah itu, sebanyak 150 μL larutan III (neutralizing solution)
ditambahkan (on ice) lalu di-vortex
Lalu didiamkan selama 3-5 menit di dalam es.
Slide 21
7.
8.
9.
10.
11.
Kemudian tabung disentrifugasi dengan kecepatan
12000 rpm selama 5 menit dalam microcentrifuge.
Supernatan yang diperoleh dipindahkan ke dalam tube
baru, ditambah ethanol absolute 2x volume larutan
alkalin lysis (±900µL), lalu di-vortex
Lalu disentrifugasi pada 12000 rpm selama 5 menit.
Kemudian supernatannya dibuang.
Lalu sebanyak 1 mL etanol (EtOH) 70% ditambahkan
dan disentrifugasi kembali selama 5 menit. Kemudian
supernatannya dibuang dengan cara dibalikkan
sampai kering ±10 menit . Akan terlihat pelet DNA
Pelet DNA dikeringkan, lalu diresuspensi dalam 30 μL
buffer TE dan di-flick kemudian disimpan pada suhu 20°C.
Slide 22
Amplifikasi DNA dengan PCR (Sadi, 2009)
• Amplifikasi ini menggunakan primer 16S rRNA
Primer
Urutan Nukleotida
9F
5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG
1492R
5’-GGCTACCTTGTTACGACTT
Komponen PCR
Deionized water
Konsentrasi Akhir
-
50 μL GoTaq Green Master Mix
1x
Primer forward
2 μL
Primer reverse
2 μL
DNA template
-
Slide 23
Pengaturan Program PCR
Siklus
Suhu
Waktu
Jumlah Siklus
Inisialisasi
95 oC
2 menit
1
-
Denaturasi
95 oC
30 detik
-
Annealing
55 oC
30 detik
-
Elongasi
75 oC
1 menit
Final elongasi
75 oC
5 menit
1
Final hold
4 oC
-
1
30
Slide 24
Elektroforesis
Proses pembuatan gel agaros 1 % dengan
mencampurkan bubuk agarosa sebanyak 0,4 g dalam
TBE 40 ml (Thris-Borate EDTA). Gel agarose
direndam secara sub marine atau terendam
seluruhnya dalam running buffer yaitu TBE. 10 uL
DNA hasil PCR dan penanda berat molekul
dimasukkan ke dalam sumur-sumur gel. Voltase yang
digunakan ntuk proses elektroforesis adalah 75 volt,
dengan kuat arus 100 mA selama 60 menit.
Slide 25
5. Analisis Bioinformatik
Hasil purifikasi produk PCR 16S rRNA
kemudian dilakukan sequencing dan
selanjutnya dianalisis menggunakan
perangkat bioinformatik (bioedit) dan
dicocokan dengan data di
www.ncbi.nih.nlm.gov melalui program
BLAST untuk menentukan jenis dari 4
isolat tersebut dari database yang ada.
Slide 26
HASIL PENELITIAN
ISOLASI BAKTERII
Uji Tantang Bakteri
POTENSI BAKTERI
Uji Reduksi Bakteri
Sequencing
Analisis Bioinformatika
Identifikasi Molekuler
Slide 27
1. ISOLASI BAKTERI
• medium padat NA tetapi diperkaya oleh
K2CrO4 sebesar 0,2 mg/L.
• Pada tahap ini didapat 13 isolat bakteri murni
yang dapat bertahan pada medium. Setelah
itu. Dari 13 isolat bakteri yang telah diisolasi
hanya 10 isolat bakteri yang benar-benar
murni
Slide 28
Slide 29
2. Uji Tantang Bakteri Terhadap Cr (VI)
Nutrien Broth (NB) yang diperkaya dengan
K2CrO4 konsentrasi 50, 150, 500, 1000, dan
1500 ppm.
Slide 30
Isolat Bakteri dengan Nilai OD 600 nm
Tertinggi pada 1500 ppm
Kode Bakteri
Optical Density
(OD)
S.3.14
1,125
A.3.3
0,366
A.2.1
0,348.
Slide 31
3. Uji Reduksi Bakteri terhadap Cr (VI)
• Uji ini dilakukan pada konsentrasi K2CrO4
yaitu 300, 700, dan 1000 ppm didalam
medium cair Nutrien Broth (NB).
• Perhitungan jumlah reduksi bakteri terhadap
Cr (VI) dilakukan dengan Diphenyl Carbazida
(DPC) sebagai indikator Cr (VI)
• Kurva Standar y = 0,1057x + 0,0025
• Absorbansi Reduksi
Slide 32
Penurunan Jumlah Konsentrasi Cr (VI)
Selama ±24 jam
Bakteri
A.3.3
A.2.1
S.3.14
Konsentrasi Awal
Konsentrasi Akhir
Total Reduksi
(ppm)
(ppm)
(ppm)
314,56
210,50
104,06
799,4
80,42
718,98
1083,25
468,30
614,95
314,56
295,65
18,91
799,4
298,013
501,387
1083,25
553,40
529,85
314,56
224,69
89,87
799,4
250,709
548,69
1083,25
856,20
227,05
Slide 33
A.3.3
A.2.1
S.3.14
1000 Blank
Uji Reduksi pada 1000 ppm
Slide 34
4. IDENTIFIKASI MOLEKULER 16S RRNA
Primer yang digunakan adalah primer 16S rRNA
dengan urutan basa primer
9F (5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG) dan
1492R (5’-GGCTACCTTGTTACGACTT)
(Sadi, 2009).
proses isolasi DNA dengan metode Alkalyne
Lysis dari Sambrook (1989).
Slide 35
Hasil Elektroforesis Amplikon
Keterangan :
M = Marker
1500 bp = Panjang pita DNA
A.3.3 = Isolat DNA bakteri
S.3.14 = Isolat DNA bakteri
Slide 36
Hasil Purifikasi
Sumber : 1st BASE
Ket :
DNA 1 yaitu isolat bakteri A.3.3
DNA 2 yaitu isolat bakteri S.3.14
Slide 37
Sequencing A.3.3
Forward :
Sumber : 1st BASE
NGGCGGTGGGGGGGGCTTATAATGCAAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAA
GTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCG
GGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCT
TCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCA
AGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCC
CAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGC
AACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAG
TGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGC
CAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGC
GCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAA
CTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAG
AGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGC
GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTG
CTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGG
GAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGG
AGCATGTGGGTTTAATTCTAAGCCACCGCGAAAAAACCTTACCATGGTCTTGGACATCCTCTG
GAAAAACCCTAAAGGAAATGGGCTTCCTCTTTTCGGGAGCAAAGTTGACCAGGTGGTGCCTT
GGTTTGTCCCCCCCCTCCTTGCCTTTT
Slide 38
•
Reverse :
ACCCTTGTTTCACCTTTAGGCGGCTGGCTCAAAAAGGTTACCCCACCGACTTCGGGTGTTAC
AAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATG
CTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCATGTAGGCGAGTTGCAGCCTACAATCCGAACT
GAGAACGGTTTTATGAGATTAGCTCCACCTCGCGGTCTTGCAGCTCTTTGTACCGTCCATTGT
AGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCC
GGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTTAATGATGGCAACTAAGATCAAGGGT
TGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACC
ACCTGTCACTCTGCTCCCGAAGGAGAAGCCCTATCTCTAGGGTTTTCAGAGGATGTCAAGAC
CTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCC
CGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTT
AACTTCAGCACTAAAGGGCGGAAACCCTCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGAC
TACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGTGTCAGTTACAGACCA
GAAAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCATATCTCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAA
TTCCACTTTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGCCGT
GGGCTTTCACATCAGACTTAGGAAACCACCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGATA
ACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTA
GGTACCGTCAAGGTGCCAGCTTATTCGACTAGCACTGGTTCTTCCCTAACAACAGAGTTTTA
CGACCCGAAAGCTTCGTCACTAAGGCGGCGTTGCTCGTCAGACTTTCGTCAATGCGGGAGA
TTCCTGCTGCTGCCGCCGTAAGAAGCTGGGACGTGGTTCAGTCCCAGGTGGCCAATCACCT
TTCAGGGGGCTAAGCATGGTGCCTTGGGAGGCGTAACGCCCCAATAGCTAAGGGACGGGG
GTCTT
Slide 39
Sequencing S.3.14
Sumber : 1st BASE
• Forward :
AGGCCCTTGCGGCGTGCTATACATGCAGTCGAGCGAACAGATAAGGAGCTTGCTCCTTTGACGTTAG
CGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTACCTATAAGACTGGAATAACTCCGGGAAACCGGG
GCTAATGCCGGATAACATTTAGAACCGCATGGTTCTAAAGTGAAAGATGGTTTTGCTATCACTTATAGA
TGGACCCGCGCCGTATTAGCTAGTTGGTAAGGTAATGGCTTACCAAGGCAACGATACGTAGCCGACCT
GAGAGGGTGATCGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGG
GAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGGTTTCGGCTC
GTAAAACTCTGTTATTAGGGAAGAACAAACGTGTAAGTAACTGTGCACGTCTTGACGGTACCTAATCA
GAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATT
ATTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGA
GGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAA
ATGCGCAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACGCTGATGT
GCGAAAGCGTGGGGATCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAA
GTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGA
CCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATT
CGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAAATCTTGACATCCTTTGACCACTCTAGAGATAGAGTTTTCCCC
TTCGGGGGACAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGAGAGATGTTGGGTTAA
GTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTAAACTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCAATCTAGGTTGACTGCC
GGGTGACAAACCGGAAGGAAGGCTGGGGATGACGTCCAATCATCATGGCCCCTTATGATTTGGGCTA
CCACCGTGCTTAAATGGAAAAAACAAAGGGCAGCTAAACCGGCGAGGCATGGCAAATCCCATAAAGT
TGTTTCCCAGNCCGGAAA
Slide 40
•
Reverse :
CCCCTTTGTTCCCCTTCGACGGCTAGCTCCATAAATGGTTACTCCACCGGCTTCGGGTGTTAC
AAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAACGTATTCACCGTAGCATG
CTGATCTACGATTACTAGCGATTCCAGCTTCATGTAGTCGAGTTGCAGACTACAATCCGAACT
GAGAACAACTTTATGGGATTTGCATGACCTCGCGGTTTAGCTGCCCTTTGTATTGTCCATTGT
AGCACGTGTGTAGCCCAAATCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCG
GTTTGTCACCGGCAGTCAACCTAGAGTGCCCAACTAAATGCTGGCAACTAAGTTTAAGGGTT
GCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCA
CCTGTCACTTTGTCCCCCGAAGGGGAAAACTCTATCTCTAGAGTGGTCAAAGGATGTCAAGA
TTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGTCC
CCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGT
TAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGG
ACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGATCCCCACGCTTTCGCACATCAGCGTCAGTTACAGAC
CAGAAAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCATATCTCTGCGCATTTCACCGCTACACATGG
AATTCCACTTTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCCAGTTTCCAATGACCCTCCACGGTTGAGCC
GTGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTACGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGA
TAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAATTAGCCCGTGGCTTTCGGAT
TAGGTACCGTCAAGACGTGCACAGTTACTTACACGGTTTGTTCTTCCCTAAATAACAGAGTTT
TACGAAGCCGAAACCCCTTCATCACTCCCGCCGGCGTTTGCTCCCGTCAGGCTTTTCGTCCA
TTTGGGGAAAAATTCCCTAACTGGCTGCCTCCCCGGAAGGAATCTGGGACCGGGGTCTCAG
GTTCCCA
Slide 41
5. Analisis Bioinformatika
www.ncbi.nih.nlm.gov
Kode
Bakteri
A.3.3
S.3.14
Description
Bacillus
thuringiensis
strain IAM 12077
Staphylococcus
Arlettae
strain ATCC 43957
Max score
Total
score
Query
Max ident
coverage
2338
2338
98%
95%
2438
2438
99%
96%
Slide 42
Bacillus Thuringiensis
mendegradasi minyak diesel (Kebria et al. 2009)
mereduksi Cr (VI) dari 100 mg/L menjadi 20
mg/L selama 115 jam (Meli, 2009)
dijadikan sebagai agen biologi pemberantasan
hama pada tanaman (Kumar, 2008)
mendegradasi PCB (polychlorinated bifenyls)
sebesar 75% dalam konsentrasi PCB tinggi
(Rojas-(Avelizapa et al. 1999 dalam Erdogan et
al. 2011)
dapat mereduksi Cr (VI) 1083,25 ppm menjadi
468,30 ppm selama ±24 jam.
Slide 43
Slide 44
Staphylococcus Arlettae
menghilangkan cemaran warna pada limbah
tekstil (Elisangela et al. 2008)
Dapat resisten dan mereduksi Cr (VI)(Bopp
and Ehlich (1988), Kouadjo dan Zeze (2010),
Zolfaghary (2012) )
mereduksi Cr (VI) dari 1083,25 ppm menjadi
856,20 ppm selama ±24 jam.
Slide 45
Slide 46
7. KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Dari kesepuluh isolat bakteri yang diperoleh, isolat bakteri dengan
kode A.3.3 dan S.3.14 yang memiliki daya reduksi dalam medium NB
yang diperkaya K2CrO4 paling tinggi yaitu dengan total reduksi
614,95 ppm dan 227,05 ppm dari konsentrasi awal 1083,25 ppm.
Bakteri S.3.14 adalah Staphylococcus Arlettae strain ATCC 43957
dengan nilai Query Coverage 99 % dan keidentikan maksimum
sebesar 96 %
Saran
1. dilanjutkan penelitian potensi isolat bakteri yang diperoleh
selain mereduksi logam Cr (VI).
2. penelitian bioremediasi dengan memanfaatkan bakteri dalam
skala lapangan (in vivo)
Slide 47
LOKASI PENGAMBILAN SAMPEL
UTARA
Sumber : googlemaps.com
Slide 48
ISOLAT BAKTERI
Slide 49
Slide 50
Konsentrasi
Absorbansi
0
0
0,2
0,024
0,4
0,045
0,6
0,072
0,8
0,085
1
0,106
Slide 51
Slide 52