WESTERN BLOT

Test de confirmation d’infection HIV Séminaire : Méthodes de séparation analytique, EPFL, semestre d’hiver 2004-2005

Table des matières

Introduction VIH Explication de la méthode • • • • Électrophorèse sur gel Incubation Révélation Interprétation Étude de cas Conclusion

Introduction

Le dépistage HIV se fait de la façon suivante: Test ELISA effectué en premier lieu Si test positif, deuxième test ELISA Si toujours positif, Western Blot comme confirmation car ELISA peut donner des ‘faux positifs’ Western Blot : recherche spécifique des anticorps anti-HIV du patient.

VIH-composition

Glycoprotéines de la membrane: GP160, GP110/120, GP 41 Protéines membranaires: p24/25 Protéines de la capsule interne: p18 Protéines internes: p55, p40 Transcriptase inverse: p68, p52 Endonucléase (=intégrase): p34

Explication de la méthode

Le principe est de détecter les anticorps anti HIV du patient par immuno-empreinte.

Permet de caractériser les anticorps dirigés contre chacune des protéines virales très spécifiquement

Électrophorèse sur gel

La première étape est la dénaturation du virus par un détergent ou autre agent (S-dodécyl sulfate) Les protéines virales (antigènes) sont séparés selon des critères de masse par électrophorèse sur gel de polyacrylamide.

La dernière étape consiste au transfert des protéines sur un buvard (blot) de nitrocellulose.

SDS-PAGE

L’agent SDS est une molécule portant une forte charge négative. Lorsqu’elle se lie à une protéine, elle cache totalement la charge propre à cette dernière.

Pendant l’électrophorèse, les molécules vont donc migrer à une vitesse limitée uniquement par leur masse.

Incubation

La bandelette de nitrocellulose est incubée avec le sérum du patient contenant (ou non!) les anticorps anti-HIV Les anticorps spécifiques se lient aux antigènes du blot.

La bandelette est rincée pour faire partir les anticorps non complexés.

Révélation

Les complexes antigène anticorps sont révélés par un deuxième anticorps couplé à une enzyme.

Le nouvel anticorps se lie au complexe lors de l’incubation.

Les anticorps non liés sont rincés.

Au contact du substrat de l’enzyme, une couleur apparaît

Bandes témoins

Deux bandes témoins sont utilisées : Contrôle positif : synthétisée en mettant en contact les antigène du blot avec tous les anticorps complexant. Cela révèle l’emplacement sur le blot de chaque complexe.

Contrôle négatif : sans présence des anticorps.

Une bande de contrôle interne : elle contient des immunoglobulines à la place des antigènes de départ. Ceci permet la vérification du bon déroulement de la réaction enzymatique

Interprétation

Protéine virale G160 GP110/120 P68 P55 P52 GP41 P40 P34 P24/25 P18 Positif Indéterminé Négatif Gène

ENV ENV POL GAG POL ENV GAG POL GAG GAG

Aspect de l'immunoempreinte

Bande nette Bande à bords diffus Bande nette Doublet Bande nette Bande diffuse Bande nette Bande nette Bande nette Parfois doublet Le test est considéré positif si la présence de deux glycoprotéines membranaires, d’une tierce protéine membranaire ou interne du virus ainsi qu’une enzyme sont détectés Le résultat (indéterminé) peut faire suspecter une séroconversion ou éventuellement une réaction croisée avec d’autres rétrovirus

Profil

2 ENV ± GAG ± POL 1 ENV ± GAG ± POL ou GAG + POL ou GAG ou POL Aucune bande ou bandes non répertoriées

Étude de cas

Cas n°1 : patient récemment infecté Premier examen : Western Blot négatif, c’est la primo-infection Ensuite, augmentation dans le temps des anticorps anti-VIH, la séroconversion

Etude de cas

Cas n°2 : patient malade Dans ce cas, la dispartition des anticorps anti-HIV en fin de SIDA témoigne de l’effondrement du système immunitaire du sujet.

Conclusion

Le test Western Blot permet de confirmer la présence du HIV Utilisation de l’électrophorèse Il permet de suivre l’évolution dans le temps de la concentration des anticorps du patient Technique très sélective mais moins sensible que la technique ELISA