Détection des Anticorps Anti-ADNnatif pour le Diagnostic du Lupus Erythémateux Systémique Étude Comparative de 7 Trousses de Dosage Immuno-enzymatique et d'un Test de Farr.

15/06/2001

Historique et épidémiologie de la maladie lupique

 Lupus signifie « latin 

loup

» en formes cutanées Éruption en ailes de papillon (Hebra 1845) Mais présence aussi de complications viscérales…  Prévalence de

15 à 200

pour 100 000 habitants ;  Fréquence plus élevée chez les sujets non caucasiens ; 

Prédominance féminine :

8 à 9 femmes pour un homme ;  Pic de fréquence entre

20 et 30 ans

;  Étiologies : facteurs génétiques, endocriniens, immunitaires environnementaux…

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Diagnostic clinique de la maladie lupique

 Définition de Dubois : « Syndrome clinique de

cause inconnue

, avec

atteinte systémique touchant

un ou plusieurs

appareils

évoluant par

poussées

, entrecoupé de

rémissions multiples

».

 Critères de gravité de la maladie :

atteinte rénale

, cardiaque, neurologique, hématologique (AHAI, purpura thrombopénique);

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Diagnostic biologique de la maladie lupique

 Anomalies biologiques diverses:

1) Signes hématologiques :

anémie, leucopénie, thrombopénie

2) Signes inflammatoires :

- Hyper  globulinémie polyclonale - Dissociation VS, CRP ;

3) Cryoglobulinémie (III)

;

4) Activation du complément

: CH50, C3, C4 (C1q).

 Grande diversité d’auto-Ac:

- Ac antinucléaires

les plus spécifiques :

- anti-ADNnatif (40 à 90%) - anti-Sm (5 à 30%) - anti-PCNA (3 à 5%),

- Ac anti-phospholipides (20 à 40% des lupus)

,

- Ac anti-cellules sanguines - Facteur rhumatoïde (30%)

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Critères de classification de l’ACR

1 Éruption malaire en ailes de papillon 2 Lupus discoïde 3 Photosensibilité 4 Ulcérations buccales et nasopharyngées 5 Polyarthrite non érosive 6 Pleurésie ou péricardite 7 Atteinte rénale :

protéinurie  0.5 g/24 h, cylindres urinaires

8 Atteinte neurologique

: convulsions, psychose (sans médicaments inducteurs)

9 Atteinte hématologique

: Anémie hémolytique avec hyper-réticulocytose ou leucopénie  4 000/mm3 constatée au moins à 2 reprises ou lymphopénie  1 500/mm3 constatée au moins à 2 reprises ou thrombopénie  100 000/mm3 en l'absence de cause médicamenteuse 10 Désordre immunologique : anticorps anti-ADN natif, anticorps anti-Sm, anticorps anti-

phospholipides

(soit anti-cardiolipine de type IgG ou IgM à taux élevés, ou anticoagulant circulant lupique, ou sérologie syphilitique dissociée)

11 Présence d'un titre anormal d'anticorps anti-nucléaires.

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Les Anticorps anti-ADN natif

 Ac anti-ADN natif =

Anticorps anti-nucléaires

dirigés contre l’ADN du

nucléosome.

Il existe 3 types d’Ac anti-ADN :

Ac anti-ADN natif

dirigés contre l’ADNdb seul ou l’ADNdb et l’ADNsb ;

Ac anti-ADN dénaturé

dirigés uniquement contre l’ADNsb.

Seuls les Ac anti-ADN natif sont spécifiques du LES :



Rôle dans la pathogénie :

IgG et de haute avidité Atteintes rénales IgM et de faible avidité 

Intérêt dans le diagnostic :

Faible activité de la maladie - Taux élevés = Forte valeur prédictive (94%) mais attention!! - Diagnostic différentiel de lupus induit (Ac anti-ADNn <5%) 

Intérêt dans le suivi :

- Évolutivité : Taux élevés = Indice pronostic péjoratif 8 à 35% de lupus quiescents avec Ac anti-ADNn à taux élevés; - Prise en charge thérapeutique.

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Les méthodes de détection des Ac anti-ADN natif

 Recherche des anticorps anti nucléaires par : Immunofluorescence indirecte sur cellules HEp-2.

 Confirmation de la spécificité « anti-ADNn » et dosage par 3 méthodes distinctes :  Test de Farr  Immunofluorescence sur Crithidia luciliae  Technique ELISA Aspect nucléaire homogène sur cellules HEp-2

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Les méthodes de détection des Ac anti-ADN natif

Sensibilité Spécificité Avantages Inconvénients Interférences Test de Farr (RIA) IFCL

+++ +++ -Technique quantitative -Méthode en phase liquide Test de référence -Présence possible d'ADN dénaturé en solution Utilisation de radioisotopes Héparines,Dextrans, Polyanions ++ ++ -Spécifique de l'ADN natif, Simple à mettre en oeuvre -Technique semi quantitative, Lecture subjective -Phénomène de zone Ac anti-histones

ELISA

++++ +/ -Technique quantitative, -Facilité d'emploi, -Faible coût Présence possible d'ADN dénaturé contaminant Viroses, Syndrome des anti-phospholipides

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Objectifs de ce travail



Enquête rétrospective :

Évaluation des performances de

7 coffrets

de dosage

immuno enzymatique

des Ac anti-ADN natif

par rapport au test de Farr

utilisé en routine dans le laboratoire d’Immunologie du CHRU de Lille.

Sérums et patients

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Critères biologiques de sélection des 80 sérums 76

sérums avec un titre en anticorps anti-nucléaires  1/320 e en IFI :

43

sérums

: 33

sérums Farr + Farr –

4

sérums avec taux d’alpha foeto protéine (AFP)  4000  g/L (seuil à 10  g/L) 

Répartition clinique :

•

70

pathologies auto-immunes : 53 lupiques :

N

=44

Sex ratio

(F/H)=93%

Age

=15-78 ans (moyenne 42ans)

Sévérité :

Forme bénigne 18% (8/44) Forme modérée 48% (21/44) Forme grave 34% (15/44)

Traitement

: 43/44 (97%)

Association à d’autres MAI

: 45.5% (20/44) • 17 non lupiques = autres maladies auto-immunes (SAPL, GS, myasthénie)

10

autres pathologies (Raynaud, pneumopathie, hépatopathie)

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Matériel et méthodes

 Les

7

coffrets ELISA :

- Test 1 :

société Bio Advance,

- Test 2 :

société Sanofi Pasteur Diagnostics (Biorad),

- Test 3 et 4 :

société BMD,

- Test 5 :

société The binding site,

- Test 6 :

société Menarini Diagnostics,

- Test 7 :

société Pharmacia & Upjohn.

 Test de Farr : Société Ortho Clinical Diagnostic  Méthodologie identique : 1) Incubation des sérums dans les puits coatés d’ADNbicaténaire, 2) Lavage, 3) Incubation en présence du conjugué, 4) Lavage, 5) Incubation en présence du substrat, 6) Révélation (lecture de DO).

Mais différences entre les trousses : - Nature de l’

antigène

, de l

’anticorps

; - Autres : temps d’incubation, dilution des sérums, nombre de calibrants, DO de référence et

la valeur seuil

…

Calcul d’un seuil arbitraire

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Dosages des Ac anti-ADN natifs obtenus par le test de Farr et différents coffrets ELISA chez les

patients lupiques

220 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Seuil arbitraire

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Dosage des Ac anti-ADN natifs obtenus par le test de Farr et différents coffrets ELISA chez les

patients non-lupiques

220 110 100 90 80 30 20 10 0 70 60 50 40 Seuil arbitraire

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Indices informationnels

100 Sensibilité (%) Spécificité (%) 80 Performances du test de Farr :

Sensibilité=71% Spécificité=78%

Ac de haute affinité =Maladie lupique évolutive  89% des lupus avec Farr positif = formes modérées ou graves

Corrélation Titres/ Clinique

: seulement entre formes

bénignes et graves

60 40  Discordances clinico-biologiques : -

28% lupus avec Farr négatif

: 20 0 -supérieur à la littérature (8 à 22%) -rarement formes bénignes -découverte récente -souvent atteinte articulaire -lupus traité Contre performance?

Phase pré-sérologique?

Lupus éteints ou stabilisé sous traitement?

-

18% non-lupiques avec Farr positif :

-SAPL le plus souvent Phase pré-clinique de lupus biologique?

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Indices informationnels

100 80 60 40 20 0 Sensibilité (%) Spécificité (%)

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Comparaison Méthodes ELISA / Test de Farr



Concordance des résultats

:

MODESTE

- Dans la population lupique - Dans la population non lupique de 43 à 73%, de 34 à 82%, - Meilleure concordance globale avec les tests

2

(68%) et

7

(67%).



Corrélation des titres d’Ac anti-ADNn dans la population lupique

:

ACCEPTABLE -

Coefficient de corrélation de 0.24 à 0.67, - Meilleure avec les

tests 2 et 6

, - Meilleure pour les titres élevés en Ac anti-ADN natif.

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Comparaison des méthodes ELISA



Grande hétérogénéité des résultats obtenus

: Variation des sensibilités de 15 à 100% Variation des spécificités de 15 à 94% 

Concordance des résultats

:

MAUVAISE

- Dans la population lupique seulement pour 6 sérums (11%)

Meilleure avec les 4 coffrets les plus sensibles : 82%

- Dans la population non lupique seulement pour 1 sérum (3.7%)!!

Médiocre avec les 5 coffrets les plus spécifiques : 22%



Corrélation des titres avec la clinique

:

MAUVAISE

Seule UNE trousse (test 2)  titres formes graves/ bénignes

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Comparaison des méthodes ELISA



Manque de standardisation

global entre les 7 coffrets même si étalonnés par rapport au même standard international :

W0 80

  Diagnostic biologique

incohérent

entre la majorité des trousses

Suivi évolutif

des patients lupiques

non adapté

par méthode ELISA  Origines des discordances :

Facteurs extérieurs?

Défaut intrinsèque?

- Phase solide=manque de spécificité, - Imperfections des microplaques, - Ac anti-plastique.

Différences entre les trousses?

- Nombre d’étalons pour la calibration, - Nature du réactif conjugué (antiglobuline), - Origine de l’Ag.

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Interférences



Ac anti-Histones/ Ac anti-ADN dénaturé :

Résultats faux positifs avec 6 coffrets (Farr négatif et patients non lupiques).



AFP :

Interférences avec 4 coffrets (tests 3, 4, 5 et 7) 

Ac anti-phospholipides :

Résultats positifs avec 5 coffrets (sauf tests 5 et 6 ) Phase solide favorise les réactions croisées entre Ac anti-phospholipides et ADN, Or test de Farr positif pour 4 de ces sérums : présence probable d’Ac anti-ADNn Phase pré-clinique de lupus? 

Facteur rhumatoïde et cryoglobuline:

Non représentatif dans notre enquête.

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Intérêt d’une démarche biologique hiérarchisée



Recherche d’anticorps anti-nucléaires par IFI

: Présents dans 99 à 100% des lupus mais non spécifiques de la maladie =Test de 1 ère intention (connectivites, affections inflammatoires, sujet âgé) Aspect homogène en IFI avec titre  1/320 e Recherche d’Ac anti-ADNn Détection par +

Méthodes ELISA

-

IF-CL Confirmation par test de Farr Adapter selon dialogue clinico-biologique

 Suivi évolutif : Test de Farr détecte une augmentation des Ac anti-ADNn dans 85% des cas de rechutes contre 75% pour ELISA et 63% pour l’IF-CL Associer d’autres paramètres biologiques : CH50 et fractions…

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Conclusion

 Aucun coffret commercial ELISA n’atteint les performances du test de Farr car : - Problèmes techniques - Encore trop de discordances et d'interférences - Absence de corrélation entre titre et sévérité clinique Choisir un coffret fiable Confirmation par test plus spécifique Importance du dialogue clinico-biologique…