المجهر األلكتروني الماسح اشواق العيد وحدة المجهر االلكتروني المختبر المركزي كان العلماء في نهاية القرن التاسع عشريستخدمون المجهر الضوئي في المجاالت العلمية المختلفة ... مع انة كان.
Download ReportTranscript المجهر األلكتروني الماسح اشواق العيد وحدة المجهر االلكتروني المختبر المركزي كان العلماء في نهاية القرن التاسع عشريستخدمون المجهر الضوئي في المجاالت العلمية المختلفة ... مع انة كان.
Slide 1
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 2
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 3
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 4
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 5
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 6
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 7
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 8
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 9
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 10
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 11
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 12
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 13
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 14
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 15
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 16
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 17
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 18
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 19
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 20
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 21
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 22
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 23
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 24
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 25
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 26
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 27
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 28
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 29
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 30
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 31
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 32
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 33
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 34
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 35
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 36
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 2
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 3
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 4
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 5
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 6
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 7
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 8
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 9
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 10
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 11
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 12
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 13
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 14
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 15
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 16
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 17
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 18
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 19
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 20
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 21
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 22
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 23
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 24
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 25
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 26
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 27
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 28
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 29
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 30
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 31
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 32
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 33
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 34
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 35
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Slide 36
المجهر األلكتروني الماسح
اشواق العيد
وحدة المجهر االلكتروني
المختبر المركزي
كان العلماء في نهاية القرن التاسع
عشريستخدمون المجهر الضوئي في
المجاالت العلمية المختلفة ...
مع انة كان في حدود قوة تكبير قليلة
لحين اتى العالم لويس دي بروجلي لم
يستطيع رؤية بعض التراكيب حسب
وجودها طبيعيآ في الخلية النباتية....
إذن كان عدم رؤية هذة التراكيب بداية
لمحاوالت للحصول علي بديل للمجهر
الضوئي ليمكن بواسطته رؤية هذة
التراكيب
2
فكر هذا العالم بأن قوة التكبير في المجهر الضوئي تتراوح عادة مابين
25xو 1500 x
وقدرة المجهر على كشف النقاب عن التفاصيل الدقيقة جداً للجسم المفحوص
هى التي تعرف بقدرة التبيين ,
وتعرف بأنها أصغر مسافة بين جسمين متقاربين يمكن أن تراهما مفصولين
عن بعضهما البعض .
وقدرة التبيين هذه التحدها انواع العدسات التي تلعب دوراً في التكبير .ولكن
الذي يلعب الدور الرئيسي فيها هو طول موجة الضوء المستخدم مصدراً
لإلضاءة وبما ان الطول الموجي للضوء ثابت ...هذا يعني ان المجهر
الضوئي اليميز لنا أي جسمين البعد بين قطريهما يصل إلى أقل من
()250nm
وألول مرة بدأ التفكير باستخدام االلكترونات بدل مصدر الضوء لفحص التراكيب الخلوية
ومشاهدة األجسام .حيث أن االلكترونات ذات طول موجي متغير يعتمد علي قوة الفولتات
المستخدمة في ارسال االلكترونات عادة يستخدم تيار يتراوح بين( )60 k.vإلى(
(180 k.vوهناك بعض المجاهر تستخدم تيار شدتة مليون فولت )(1000 k.v
وهذا ما جعل العالم (لويس دي بروجلي) يفكر بااللكترونات ليرى األجسام
الدقيقة
بعد ذلك اتي العالم ( هانس بوش) األلماني حاول استخدام شعاع من االلكترونات للحصول على عدسات
كهرومغناطيسية – ليس عدسات زجاجية ملموسة
1930
أول محاولة لصنع المجهر االلكتروني بألمانيا حيث قام كل من
نول ) (knollو ورسكا ) )ruskaبذلك
1932
وجد العلماء (هانس بوش ونول ورسكا ) أنه يمكن شعاع من االلكترونات أن يركز في موجة رفيعة ( تبئير
الشعاع االلكتروني) وتكبير الصور باستخدام العدسات الكهرومغناطيسية ) (Electromagneticوأنها
صالحة لالستعمال في المجاهر االلكترونية ،ويمكن الحصول على صور ورؤيتها إذا مرت في وسط مفرغ جيداً
من الهواء يصل الضغط أقل من ( 1ملم.زئبقي ) حيث أن الشعاع االلكتروني يتشتت إذا اصطدم بالكترونات
وجزيئات غاز وغيرها...
1939
أول مجهر الكتروني قامت بتصنيعه الشركة األلمانية
سيمنس )(siemens
1950
من هنا جاءت فكرة توصيل عامود المجهر االلكتروني بجهاز تفريغ من الهواء
(خلخلة) عالي الفعالية )(high vacuum pump
ومع ذلك لم يتم استخدامه في الدراسات البيولوجية واألنسجة الخلوية
ألسباب تقنية في تحضير القطاعات النسيجية الدقيقة جداً
كانت فترة االهتمام في تطوير طرق التحضيرات للمجهر النفاذ واستمر العمل والتطوير حتى نهاية الستينات
على المجهر االلكتروني النفاذ
وكان في أول السبعينات بداية استخدام المجهر االلكتروني
وتطوير هذا الجهاز وطرق تحضيراتة كشفت لنا النقاب عن أشياء عظيمة تعجز العين المجردة عن رؤيتها ,
ومما نتج عنة إحداث تغيرات كبيرة في تاريخ العلوم الحيوية .
6
•
صورة توضح ق.ط تخطيطي في عمود مجهر إإلكتروني
7
نظام تكوين الصورةImaging system. -:
العدسات -:
Lenses
يتكون اجملهر االلكرتوين من أربع عدسات إلكرتونية
تعمل على تكوين الصورة املكربة
والعدسات هي:
-1العدسة املكثفة
-2العدسة الشيئية
) lens ( O.L.
Objective
) lens ( P.L.
Projector
-3العدسة املتوسطة
) Intermediate lens ( I.L.
-4العدسة العارضة
) lens (C.L.
Condenser
8
THE VACUUM SYSTEM
•
•
•
•
إن تفريغ اهلواء لعامود سري الشعاع االلكرتوين أمر يعترب من أساسيات تشغيل اجملهر
األلكرتوين لذلك البد من التفريغ الكامل من اهلواء حيث يصل الضغط الداخلي لعامود
اجملهر
) 10 10ــــ(PASCAL
تعمل علي ازالة اكثر اهلواء يف فرتة قصرية
هذة املضخة دائما موجودة خارج اجملهر االلكرتوين ومرتبطة معها بأنابيب بالستيكية
ذات مرونة داخلة باجملهر بعيدة عنة للوقاية من األرجتاج الذي يؤثر على اجملهر
هذه املضخة تعمل بنوع من الزيت اخلاص يضاف هلا
نظــــام التبريد
*)... (chillerعبارة عن
كمربوسر عادي وخزان ماء من ستيل فية ماء مقطر
يقوم الكمربوسر بتربيد املاء املوجود باخلزان مث يضخها عرب
انابيب إىل داخل اجملهر ليقضي على احلرارة املنبعثة
10
الفرق بين المجهر الضوئي والمجهر االلكتروني
- جهاز المجهر اإللكتروني الماسح
(Scanning electron microscope (SEM
ويستخدم لفحص أسطح العينات من خالل صورة مجسمة ثالثية
األبعاد ,مع إمكانية فحص العينات دون تغطيتها بالعناصر الموصلة
للكهربية للعينات الغير بيولوجية .والجهاز من النوع صنع شركة
JEOLاليابانية ,وهو مزود بكمبيوتر وذلك لضبط ودرجة التباين
واالستضاءة ,وتبلغ قوة التكبير حتى
× ,300.000والجهاز
يستخدم لفحص العينات البيولوجية( الحيوانية -النباتية -أحياء دقيقة
وكذلك العينات غير البيولوجية
12
تحضير العينات للمجهر اإللكتروني الماسح
13
14
خطوات معالجة العينة كيميائيآ لتحضيرها
للفحص بواسطة المجهر االلكتروني
15
التثبيت
• الهدف من عملية التثبيت -:
.1الحفاظ على العينة من التفتت والتفسخ والتحلل الذاتي بفعل
األنزيمات
.2بقاء النسيج على طبيعتة وحالتة في مصدرة
.3يعطي العينة شئ من الصالبة والقسوة
.4يحمي النسيج من عيوب األنكماش
16
• التثبيت يكون على مرحلتين-:
الجلوترالدهيد
.1المثبت األولي
األوزميوم
.2المثبت الثانوي
17
الجلوترالدهيد
• مهم في تثبيت مادة البروتين والجليكوجين في النسيج
والخاليا
• يحضر بتركيز 2-3 %
• تترك العينة فية من 6-4ساعات في حرارة الغرفة أو ليلة
كاملة في الثالجة
18
غسيل العينة
• غسيل العينات بين المثبتات وبعدها امر هام النة قد تتفاعل
مكونات المثبت مع المادة التي تليها فينتج عن هذا التفاعل
تغيرات في مكونات النسيج والخلية
• يستخدم المحلول المنظم الفوسفاتي phosphate bufferd
• تغسل العينة 3مرات
.1تترك العينة في المحلول 15دقيقة ثم نتخلص منة
.2نضيف محلول آخر نظيف وتترك فية لمدة 15دقيقة
.3نتخلص من المحلول ونضيف آخر لمدة 30دقيقة
19
األوزميوم
• مهم في تثبيت المادة الدهنية ويعمل كصبغة اولية لعينات
المجهر وتزيد من عملية التوصيل الكهربائي بين العينة
وشعاع االلكترون
• يحضر بتركيز 1 %
1ml osmium tetroxid &99ml bufferd
• تترك العينة فية من 2-1ساعه عند درجة حرارة الغرفة
20
غسيل العينة
• 15دقيقة
1
• 15دقيقة
2
• 30دقيقة
3
21
نزع الماء
• هي عملية التخلص من جزيئات الماء من النسيج والخاليا
• يتم بواسطة احد الكحوالت ويفضل اإليثانول
• التدرج بالتركيز من األقل لألعلى
22
جدول يبين خطوات عملية النزع
تركيز الكحول المستخدم
عدد المرات
حلول الفترة
30% ETHANOL
1X
15 MIN
50% ETHANOL
1X
15 MIN
60% ETHANOL
1X
15 MIN
70% ETHANOL
1X
15 MIN
80% ETHANOL
1X
15 MIN
90% ETHANOL
1X
15 MIN
100% ETHANOL
3X
15 MIN
23
التجفيف بالنقطة الحرجة
Critical Point drying
لمدة 30MIN
توضع العينة في المـــــادة المجففة
ثم تترك حتي تجف تمامآ وبعد ذلك توضع علي الحامل الخاص للجهاز
24
عينات هذا المجهر االلكتروني تغطى بطبقة رقيقة من الذهب بواسطة ماكينة تدعى
“sputter coaterالطالء البخاخ”
25
26
العينة جاهزة للفحص بواسطة المجهر
االلكتروني الماسح
27
28
29
30
31
32
33
34
35