Transcript Medios de cultivo

MICROBIOLOGÍA
Medios de cultivo
MEDIOS DE CULTIVO
El material alimenticio en donde crecen los
microorganismos es el medio de cultivo y el
crecimiento de los microorganismos es el
cultivo.
Condiciones de un medio de cultivo
Temperatura.
Grado de humedad.
Presión de oxígeno adecuadas.
Grado correcto de acidez o alcalinidad.
Excento de todo microorganismo
contaminante.
Clasificación en base a su estado físico
Líquidos
Sólidos
Semisólidos
TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO
Medios líquidos.
Medios sólidos: llevan un agente solidificante
(Agar) que es un polisacárido acídico
producido por ciertas algas rojas que gelifica
por debajo de 45° C. Se usa a una
concentración del 1.5%.
Medios semisólidos: agar a una
concentración del 0.7%.
Clasificacion en base a su composición:
• A. Medios sintéticos o químicamente
definidos.
B. Medios complejos o de composición
indefinida.
C. Medios de enriquecimiento.
D. Medios selectivos.
E. Medios diferenciales.
F. Medios de mantenimiento.
A.- Medios sintéticos o químicamente
definidos.
• Llevan fuente de carbono, fuente de
nitrógeno, sales que sustituyan iones (P,
K, Mg, Fe, Ca...), otros elementos como
son estimuladores
del crecimiento
(eritritol para Brucella abortus)
pero
siempre a concentraciones conocidas.
B. Medios complejos o de composición
indefinida.
• Estos medios llevan ingredientes como
extracto de levadura, peptona, infusión de
cerebro, extracto de carne, que contienen
nutrientes en abundancia pero sin saber
con exactitud la composición cualitativa ni
cuantitativa
de
estos
nutrientes.
C. Medios de enriquecimiento.
• Son medios complejos (normalmente) con aditivos
adicionales para favorecer el crecimiento de
determinados
microorganismos
(particularmente
heterótrofos exigentes). Ejemplo: adición de sangre,
suero o extractos de tejidos de animales y plantas.
D. Medios selectivos.
• Son aquellos que favorecen por su diseño el crecimiento
específico de un microorganismo particular (o grupo de
microorganismos). Es de gran utilidad para el aislamiento de
microorganismos a partir de una población microbiana mixta.
Ejemplo: CO2 como fuente de carbono es selectivo para
autótrofos; adicionando cristal violeta se inhibe el crecimiento
de los Gram (+); utilizando maltosa como única fuente de
carbono sólo crecerán los que usen maltosa.
E. Medios diferenciales.
• Son aquellos destinados a facilitar la
discriminación de microorganismos de una
mezcla por sus propiedades diferenciales de
crecimiento en dichos medios. Ejemplo: Agar
sangre diferencia hemolíticos de no hemolíticos;
McConkey diferencia lactosa (+) de lactosa (-).
F. Medios de mantenimiento.
• Suelen ser distintos a los de crecimiento óptimo
ya que el crecimiento rápido y prolífico suele
ocasionar la muerte rápida de las células.
Ejemplo: al añadir glucosa y utilizarla los
microorganismos producen ácidos,
acidificándose el medio por lo que es preferible
no utilizar glucosa en los medios de
mantenimiento.
AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS EN
CULTIVO PURO
• Un cultivo puro es aquel formado por células
provenientes de una sóla inicial y por tanto
pertenecientes a la misma especie y cepa. Es
una situación artificial ya que en la Naturaleza
los microorganismos se encuentran formando
poblaciones mixtas y heterogéneas
1.- Métodos para aislar cultivos puros
• i.- Técnica de siembra por estrías en placa.
ii.- Técnica de vertido en placa.
iii.- Técnica de enriquecimiento del cultivo: consiste en
diseñar condiciones de cultivo que favorezcan
específicamente al microorganismo que queremos aislar y
que se encuentra en pequeñas cantidades.
iv.- Técnica de las diluciones en serie: se utiliza para
microorganismos cuya proporción es mayoritaria dentro de la
población mixta.
v.- Técnica de aislamiento de una sola célula mediante un
micromanipulador.
2. Mantenimiento y preservación de cultivos
puros
• i.- Resiembra periódica en medios frescos.
ii.- Preservación de cultivos con una capa de
aceite mineral.
iii.- Liofilización
iv.- Almacenamiento a temperaturas muy bajas
en presencia de agentes estabilizantes como
glicerol o dimetilsulfóxido. Nitrógeno líquido (196° C).
3. AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS
AEROBIOS
• 1) Siembra por estría en superficie: Con éste
procedimiento se puede conseguir una buena
separación de las colonias y aislarlas
fácilmente. Esto puede realizarse de varias
formas:
• A) Al comienzo se descarga la mayor cantidad
posible de material, luego se continúa con la
estría. Cuando se quiere obtener colonias muy
separadas se puede utilizar dos o tres cajas,
para lo cual se repite la operación sin tomar
con el asa nuevo material
• B) Se puede dividir la caja en cuatro
cuadrantes; una vez depositado el material en
el primero, siguiendo el sentido de las agujas
del reloj, se hace una estría luego en el
segundo, tercero y cuarto cuadrante sin cargar
nuevamente el asa; en el último cuadrante
aparecerán las colonias aisladas
• C) El inóculo se extiende sobre una pequeña
zona de la placa, próxima al borde, se
esteriliza el asa y se traza otra estría a partir
del depósito y así sucesivamente hasta cinco
veces
• 2) Siembra por dilución: Se toman tres tubos de ensayo con
medio agarificado, los cuales se funden y mantienen a baño
María (45ºC) para que no solidifiquen. Se toma el material a
aislar y se siembra en el primer tubo, se agita bien; de este
tubo se toma material y se siembra en el segundo tubo y se
repite lo mismo en el tercer tubo. Luego son volcados en
distintas cajas de Petri, se deja solidificar y se coloca en estufa
a incubar. En la estufa, las cajas de Petri son colocadas en
forma invertida a fin de evitar que el agua de condensación
que se forma en las tapas caiga sobre el cultivo
• 3) Siembra por extensión en superficie: Se
coloca una gota del material a aislar en el
centro de la caja de Petri y de allí se extiende
por toda la superficie con la espátula de
Drigalsky. Se puede repetir esta operación en
otra caja con la misma espátula sin tomar
nuevo material, con lo cual se obtendrán
colonias bien separadas unas de otras
• 4) Siembra en tubos de ensayo: Los tubos de
ensayo son menos empleados que las cajas
debido a que ofrecen poca superficie de
siembra y es difícil aislar las colonias del
interior de los mismos. Se emplean para
microorganismos que pueden ser separados
en medios específicos donde las otras
especies no progresan o lo hacen lentamente.
• a- Por estría: Se utilizan tubos de ensayo con
medio de cultivo solidificado en forma
inclinada (pico de flauta) para así aumentar la
superficie se siembra. Con el asa se toma el
material a sembrar y se lo introduce en el
fondo del mismo, luego se hace la estría desde
el fondo hacia arriba en toda la superficie
• b- Por picadura o punción: Con una aguja se toma el
material que se quiere sembrar y se lo introduce en
el tubo, con medio solidificado en forma vertical. Con
sólo soltar la aguja, ésta se introduce por su propio
peso en el medio de cultivo, formando un canal de
punción. A lo largo del canal se desarrollan los
microorganismos, y según lo hagan en la parte
superior o inferior del tubo, estarán indicando su
comportamiento frente al oxígeno
Tinción Gram
Material
• Microscopio
• Portaobjetos
• Cubreobjetos
• Asa de siembra
• Cultivo bacteriano
• Pinzas
• Mechero
• Cristal violeta
• Lugol
• Alcohol-acetona
• Safranina
• Tinción Gram
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REALIZACIÓN
Preparar los frotis bacterianos.
Teñir con cristal violeta 1min.
Lavar con abundante agua el exceso de colorante.
Cubrir con Lugol 1min.
Lavar con agua el exceso de Lugol.
Decolorar con alcohol-acetona o simplemente con alcohol hasta
que la preparación deje de perder color (30seg)
Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente.
Teñir con safranina 1min.
Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste.
Secar la preparación.
Examinar al microscopio fijándose sobre todo en el color de cada
preparación.
• Los tiempos de exposición a los colorantes son orientativos.
Cada vez que se prepara la batería de colorantes para realizar
la tinción Gram presentan algunas diferencias respecto a los
preparados en otro momento, por lo que puede ser necesario
ajustar los tiempos.
En un laboratorio de Microbiología, cada vez que se preparan
los colorantes, se suelen hacer pruebas con cultivos patrón de
los dos tipos (Gram+ y Gram-) para ajustar así los tiempos y
tener la certeza de que el resultado de todas las tinciones que
se hagan mientras duren esos colorantes son fiables.
Otra posibilidad es adquirir el equipo completo de colorantes
ya preparados, pero es mucho más caro.
Cultivo mixto
Bacterias Gram +
Bacterias Gram -