Transcript 05: Esterilización y Nutrición

CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO
ANTISEPSIA: eliminación de microorganismos patógenos de tejidos
vivos.
DESINFECCION: eliminación de microorganismos patógenos de
objetos inanimados
ESTERILIZACIÓN: eliminación por separación o muerte de todo
microorganismo viable de un objeto.
Bacteriostático
Bactericida
Bacteriolítico
Curva de muerte
Factores que afectan el control de los
microorganismos
• El número de microorganismos
• El tiempo de exposición
• La concentración del agente de control
• El tipo de microorganismos
• El estado físico de el microorganismo
• Condiciones ambientales locales
• La temperatura
Efecto de la concentración del agente de
control
Tiempo (minutos)
Efecto de diferentes concentraciones de fenol
sobre una población de E.coli
ESTERILIZACION POR CALOR
Cinética de esterilización por calor (K): Nº de microorganismos viables/tiempo
Tiempo de reducción decimal: D
Valor Z: Mide el cambio en la tasa de destrucción térmica en relación
con
el cambio en la temperatura.
Valores D y z para microorganismos patógenos asociados a alimentos
Microorganismo
Substrato
Clostridium botulinum
buffer fosfato
Clostridium perfringens Medio de cultivo
(cepa resistente al calor)
D (°C) Minutos
D121 = 0.204
D90 = 3–5
z (°C)
10
6–8
Salmonella
Pollo
D60 = 0.39–0.40
4.9–5.1
Staphylococcus aureus
Pollo
Pavo
0.5% NaCl
D60 = 5.17–5.37
D60 = 15.4
D60 = 2.0–2.5
5.2–5.8
6.8
5.6
La naturaleza del microorganismo
Desinfección por UV
http://www.cepis.ops-oms.org/eswww/fulltext/aguabas/ultravio/ultravio.html
Condiciones Ambientales
• El calor es más eficaz en un medio ácido
que en uno alcalino.
• La consistencia del material, acuoso o
viscoso, influye marcadamente en la
penetración del agente.
• Las concentraciones altas de carbohidratos
aumentan, por lo general, la resistencia
térmica de los organismos.
La presencia de materia orgánica extraña reduce
notablemente la eficacia de los agentes antimicrobianos
• No permite que el agente llegue a los
microorganismos
• Se combina con el desinfectante y lo precipita
• Se combina con el desinfectante y lo inactiva
dejando libres concentraciones tan bajas que no
logran el efecto deseado sobre la población
microbiana
La temperatura
Tiempo
Efecto de la temperatura en el control de E.coli
con fenol a una concentración de 4,62 g/l
Métodos de esterilización
•
•
•
•
Calor
Agentes químicos
Radiaciones
Filtración
CALOR
• Esterilización por calor húmedo:
– Sobrepresión
– Tindalización
• Esterilización por calor seco:
– Horno
– Incineración
Las esporas de Clostridium botulinum son destruidas:
• En 4 a 20 minutos a 120° C en calor húmedo
• En 2 horas de exposición al calor seco.
Calor Húmedo
Autoclave
• La esterilización comienza cuando se ha alcanzado la
temperatura óptima en el interior del aparato (autoclave o
estufa)
• Según el contenido, un autoclave puede requerir tiempos
más largos para alcanzar la temperatura de esterilización.
No se deben esterilizar en el autoclave:
• Sustancias que no se mezclan con el agua porque no pueden
ser alcanzadas por el vapor sobreviviendo los microorganismos
que contengan.
• Sustancias que se alteran o son destruidas por tratamientos
prolongados de calor.
Pasteurización:
reducción de la población microbiana
(eliminación de microorganismos patógenos). Alimentos
Tipos de pasteurización:
- BAJA:
62 - 68ºC
30 minutos
Proceso discontinuo, volúmenes pequeños, envasados.
- ALTA o H.T.S.T. (high temperature, short time):
72 - 90ºC
15 - 30 segundos
- RELÁMPAGO (“flash”): 88 - 97 ºC
1 - 12 segundos
Sistemas de flujo continuo con intercambiadores de calor
Tindalización
• Calentamiento del material de 80 a 100° C hasta 1 hora durante
3 días con sucesivos períodos de incubación.
• Se utiliza cuando las sustancias químicas no pueden calentarse
por encima de 100° C sin que resulten dañadas.
• Las esporas resistentes germinarán durante los períodos de
incubación y en la siguiente exposición al calor las células
vegetativas son destruidas.
Calor Seco
Horno
• La esterilización seca se logra a 160-170 °C por 2-3 hrs.
• El calor seco se utiliza principalmente para esterilizar material de
vidrio y otros materiales sólidos estables al calor.
• Para el material de vidrio de laboratorio se consideran suficientes
dos horas de exposición a 160° C.
Incineración
• La destrucción de los microorganismos por combustión o
cremación.
• En los laboratorios, las ansas de siembra se calientan a la llama
de mecheros Bunsen.
• La incineración también se utiliza en la eliminación de residuos
hospitalarios.
Radiaciones
• Radiaciones ionizantes
– Rayos gamma
– Rayos catódicos
• Radiaciones no ionizantes
– Luz ultravioleta
Rayos gamma
• Las radiaciones gamma tienen mucha energía y son
emitidas por ciertos isótopos radiactivos como es el Co60.
• Son difíciles de controlar porque este isótopo emite
constantemente los rayos en todas direcciones.
• Estos rayos pueden penetrar materiales, por lo que un
producto se puede empaquetar primero y después esterilizar.
Rayos catódicos
• Radiación con haz de electrones
• Se usan para esterilizar material quirúrgico, medicamentos y otros
materiales.
• Ventaja: el material se puede esterilizar después de empacado (ya
que éstas radiaciones penetran las envolturas) y a la temperatura
ambiente.
Dosis de radiación absorbida:
Especie biológica
1rad = 100erg/g
100 rad = 1Gray (Gy)
D (Gy)
Clostridium botulinum
(G+, esp., anaerob.)
3300
Bacillus subtilis
(G+, esp., aerob.)
600
Salmonella
(G-)
200
Lactobacillus
(G+)
1200
Deinoccocus
radiodurans
(G+)
2200
Aspergillus
(hongo)
500
Saccharomyces
(levadura)
500
Fig. 1. Fracción de supervivencia celular (%) de la cepa D7 de S.
cerevisiae frente a radiación gamma.
Dosis letal para humanos: 10 Gy
Luz ultravioleta
• Radiaciones con longitudes de onda alrededor de 265 nm
son las que tienen mayor eficacia como bactericidas (200 295 nm).
• La luz UV tiene poca capacidad para penetrar la materia
por lo que sólo los microorganismos que se encuentran en
la superficie de los objetos que se exponen directamente a
la acción de la luz UV son susceptibles de ser destruídos.
Se usan para reducir la población
microbiana en:
Quirófanos
Cuartos de llenado asépticos en la
industria farmacéutica
Superficies contaminadas en la industria
de alimentos y leche.
Bodegas de carne refrigeradas
Eliminación de microorganismos por separación: FILTRACION
La filtración se utiliza para
• Emulsiones oleosas, aceites, algunos tipos de pomadas.
• soluciones termolábiles: líquidos biológicos (suero de
animales), soluciones de enzimas, algunas vitaminas y
antibióticos.
• Esterilizar soluciones oftálmicas, soluciones intravenosas,
drogas diagnósticas, radiofármacos, medios para cultivos
celulares, y soluciones de antibióticos y vitaminas.
H.E.P.A / U.L.P.A.:
Los filtros H.E.P.A (High efficiency Particulate Air) son filtros descartables de medio
filtrante seco y extendido.
Eficiencia mínima de 99,97 %: (penetración máxima del 0,03 %) en aerosoles de
0,3 micrones generados térmicamente (Norma MILSTD-282).
Los filtros U.L.P.A. (Ultra Low Penetration Air) son filtros con características
similares a los filtros H.E.P.A.
Eficiencia mínima de 99,999 % (penetración máxima inferior al 0,001 %) para
partículas de un tamaño entre 0,1 y 0,2 micrones.
Se utilizan en sectores hospitalario, industria
farmacéutica, industria alimenticia, industria
química, industria veterinaria, cabinas de
pintura, etc.
Agentes desinfectantes
Conservación
• En general, el metabolismo de las bacterias se
inhibe a temperaturas por debajo de 0° C.
• No matan a los microorganismos sino que
pueden conservarlos durante largos períodos de
tiempo.
• Circunstancia aprovechada por los
microbiólogos para conservar los
microorganismos indefinidamente.
• Los cultivos de microorganismos se conservan
congelados a -70° C o incluso mejor en tanques
de nitrógeno líquido a -196° C.
Unidad 2: Crecimiento y metabolismo de los
microorganismos
2.1.
Nutrición: fuentes de carbono, nitrógeno y oxígeno. Fuentes de fósforo y azufre. Factores de crecimiento.
Clasificación de microorganismos sobre la base de los requerimientos nutricionales. Mecanismos de absorción de
nutrientes. Medios de cultivo definidos y complejos. Sólidos y líquidos. Inoculación de medios, características de
desarrollo en diferentes medios. Obtención de cultivos puros.
2.2.
Curva de crecimiento: fases de la curva. Métodos de medida del crecimiento bacteriano, medida del
incremento de masa y número. Crecimiento exponencial, aritmético y diauxico. Crecimiento continuo, turbidostato y
quimiostato. Crecimiento sincronizado. Influencia de parámetros extrínsecos e intrínsecos sobre cada etapa del
crecimiento bacteriano, mecanismo molecular de cada uno (pH y ácidos, temperatura, concentración de sustrato,
actividad acuosa, concentración de oxígeno, presión, radiaciones), Clasificación de microorganismos sobre la base
de los requerimientos de factores intrínsecos y extrínsecos.
2.3
Metabolismo microbiano: Conversión de energía: conversión de la glucosa en piruvato, glicólisis, vía de las
pentosas, vía de Entner-Doudoroff. Ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Fosforilación oxidativa. Fermentación y
fosforilación a nivel de sustrato. Respiración anaeróbia. Catabolismo de glúcidos, lípidos y aminoácidos.
Fotosíntesis. Utilización de energía y biosíntesis: fijación fotosintética de carbono, fijación de nitrógeno, azufre y
fósforo. Biosíntesis de aminoácidos, bases nitrogenadas, vitaminas, lípidos y peptidoglicano. Síntesis de ácidos
nucleicos y proteínas: replicación, transducción y traducción. Regulación de transcripción, traducción y actividad
enzimática. Control del ciclo celular.
2.3.
Trabajos experimentales y seminarios:
Preparación y esterilización de medios de cultivo. Siembras.
Curva de crecimiento bacteriano por turbidez a distintas temperaturas y en diferentes medios. Recuento de
bacterias viables (recuento de colonias y NMP).
Métodos de preservación de cepas (congelación y liofilización).
NUTRICIÓN MICROBIANA
microorganismo
Agua 80-90%
Peso seco 10%
Hidrógeno,
Oxígeno,
8%
20%
Carbono,
Nitrógeno,
Fósforo,
Azufre,
50%
14%
3%
1%
K Na Mg Ca Fe *** Mn Co Cu Mo Zn
95%
5%
Requerimientos de Carbono
Energía
Luz
Categoría
Fotoautótrofo
CO2
Compuestos inorgánicos
Quimioautótrofo
H2, H2S, Fe++, NH4+ …
Compuesto orgánico
Compuesto
orgánico
Quimioheterótrofo
C
Luz
Fotoheterótrofo
Requerimientos de N, S y P
NO3-
NH4+, N2
SO4-2
Cys, Met
PO4-3
Requerimientos de K, Mg, Ca - Na
Requerimiento de Fe++
Sideróforos
Micronutrientes o elementos trazas
Factores de Crecimiento: Aminoácidos, Purinas y Pirimidinas, Vitaminas
Complejos: constituidos por sustancias complejas de
Medios de cultivo
origen animal o vegetal,las que son usualmente
complementadas por la adición de minerales y otras
sustancias.
No se conocen todos los componentes ni las cantidades
exactas presentes de cada uno de ellos.
Sintéticos: tienen una composición química
definida cuali y cuantitativamente.
De acuerdo al uso del medio de cultivo, éstos se clasifican en:
Medios de enriquecimiento:
son medios líquidos que favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismo en
particular, permitiendo aumentar su número.
Usualmente contienen una o más sustancias inhibidoras del crecimiento de los
microorganismos con excepción de los que se quieren cultivar.
Medios selectivos: son parecidos a los de enriquecimiento, se diferencian por
ser medios sólidos y están diseñados para el aislamiento de microorganismos
específicos.
Medios diferenciales: son medios sólidos que contienen indicadores de productos
derivados de la actividad microbiana de los microorganismos y/o inhibidores de
crecimiento tal que permiten diferenciar el desarrollo de microorganismos
diferentes.
Requerimientos de O2
Aerobios estrictos
Anaerobios
I- Anaerobios obligados (CO2 5-10%)
A. o. estrictos (0.03% O2)
A. o. moderados (2-8% O2)
II- Anaerobios aerotolerantes
Anaerobios facultativos
Microaerófilos, O2 como aceptor final de e- en concentración < 21%