MÉTODOS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS EN ALIMENTOS

Análisis de alimentos…

• Es fundamental detectar  presencia , tipo y número de microorganismos y / o sus productos.

• No todos los microorganismos se identifican por las mismas técnicas. • Se realizan en un laboratorio  utilizar el menor número de procedimientos y ensayos posibles.

Clasificación de los Métodos de Identificación Microbiana

• Criterios morfológicos • Tinción diferencial • Pruebas bioquímicas • Tipificación con fagos • Pruebas serológicas • Detección molecular

Criterios morfológicos

• Los rasgos morfológicos (estructurales) han ayudado clasificar organismos. • Los microorganismos lucen tan similares que se dificulta su clasificación. • La morfología celular dice poco sobre las relaciones filogenéticas.

Tinción diferencial

• Sacar conclusiones en relación con la morfología de una bacteria, examinando una lámina que fue sometida a un proceso de tinción diferencial. • La mayor parte de las bacterias, teñidas con Gram, las podemos clasificar como gram positivas o gram negativas. • Ácido resistente.

•

Pruebas bioquímicas

Las pruebas bioquímicas han sido ampliamente utilizadas para diferenciar bacterias. • Se fundamentan en demostrar : capacidad de fermentar azúcares, la presencia de enzimas, la degradación de compuestos, la producción de compuestos coloreados, etc. • Bacterias fuertemente relacionadas pueden separarse en especies diferentes . • Catalasa, Citrato, Fenilalanina desaminasa, Indol, Lactosa, Oxidasa, Rojo de Metilo .

Tipificación con fagos

• La interacción entre un virus bacteriano (fago) y su célula bacteriana sensible es sumamente específica, ya que el proceso de adsorción se encuentra mediado por receptores específicos tanto en el virus como en la célula bacteriana. A una placa con medio de cultivo sólido inoculado.

se le añade una alícuota de un fago específico. puede ocasionar la lisis de las bacterias.

Pruebas serológicas

• Implican la utilización de preparaciones de inmunoglobulinas específicas.

• Se basan en la reacción de un antígeno presente en el agente microbiano con su anticuerpo correspondiente.

Detección molecular

• Métodos basados en biología molecular donde se detectan secuencias de ADN propias de un determinado agente microbiano.

• PCR (Polymerase Chain Reaction) identificación de microorganismos que no pueden ser cultivados por métodos convencionales. • Se aumenta la cantidad de ADN hasta niveles detectables mediante electroforesis o mediante sondas de ADN.

Métodos rápidos

• Sistemas miniaturizados y kits de diagnóstico: permiten reducir el volumen de reactivos y medio a emplear en los ensayos. • Tarjetas desechables para la identificación sencilla de colonias sospechosas mediante pruebas bioquímicas rápidas (O.B.I.S., Oxoid). • Tubos de plástico, contienen agar con distintos sustratos y con una aguja interior, posibilita la inoculación del tubo de forma rápida y sencilla a partir de una única colonia (BBL Enterotube y Oxi/Ferm Tube, BD). • Soportes plásticos con pocillos que contienen sustratos cromogénicos y/o fluorogénicos en estado deshidratado que se rehidratan en contacto con la muestra (BBL Crystal, BD; RapID systems y MicroID, Remel;Biochemical ID systems, Microgen).

VITEK (bioMérieux)

• Se basa en cambios de color de los sustratos o en la producción de gas de los cultivos inoculados en los pocillos de una tarjeta plástica que contiene los sustratos bioquímicos en forma deshidratada, puede identificar un cultivo típico de Escherichia coli en un lapso de 2-4 hrs.

Métodos inmunológicos

• Reacción específica entre un antígeno y un anticuerpo.

• En microbiología de los alimentos, es ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).

• Salmonella, E. coli O157:H7, Listeria monocytogenes, Campylobacter spp. y toxinas estafilocócicas.

• ELFA (Enzyme-Linked Fluorescent Assay), en la que el producto final de la reacción es fluorescente en lugar de cromogénico.

Beneficios…

• Representan un área de la microbiología aplicada en continua expansión. • La rapidez de los resultados es esencial en la industria alimentaria para reducir los tiempos de espera en los procesos de producción y liberar más rápidamente los lotes producidos. • La mayoría de las técnicas rápidas se dirigen a la detección de bacterias, es previsible que se desarrollen nuevos métodos para la identificación rápida de virus y parásitos implicados en la transmisión de enfermedades a través de los alimentos.

Bibliografía

• Nickerson, J.T. Sinskey, A. J. Microbiología de los Alimentos, Editorial: Acribia, España 1978.

• http://www.madrimasd.org/blogs/alimentacion/2008/02/08/84070

Gracias

Métodos para el estudio de comunidades microbianas en alimentos fermentados

Gloria Díaz Ruiz, Carmen Wacher Rodarte Revista Latinoamericana de Microbiología, (2003).

•

Introducción…

Recientemente, se ha visto la necesidad de tomar en cuenta el ecosistema completo, ya que el crecimiento, la sobrevivencia y la actividad de cualquier especie, pueden estar determinados por la presencia de otras especies.

• Durante el último siglo se ha dependido del aislamiento y cultivo de los microorganismos para su identificación. Éstos han sido caracterizados tradicionalmente por su fenotipo, el conjunto de propiedades celulares observables, como su morfología, propiedades fisiológicas y por la estructura de sus componentes celulares. • No es posible obtener cultivos puros de ciertos microorganismos porque dependen de las actividades de otros microorganismos o porque no se conocen las condiciones para su cultivo.

• Las relaciones evolutivas entre los organismos (que por lo general no es posible obtener mediante el análisis de las características fenotípicas) constituye una base más natural para clasificarlos.

• Estas relaciones podrían ser establecidas idealmente comparando las secuencias nucleotídicas de sus genomas; sin embargo el análisis a esta escala sería impráctico, pero pueden ser inferidas mediante la comparación de secuencias de genes individuales.

• Se utilizan entonces ciertas macromoléculas que funcionan como cronómetros evolutivos (indicadores de cambios evolutivos). Se puede medir la distancia evolutiva entre dos organismos por diferencias en la secuencia de nucleótidos o de aminoácidos de macromoléculas homólogas aisladas de ellos.

• Esta molécula debe estar distribuida universalmente en el grupo que se desea estudiar y debe ser funcionalmente homóloga en cada organismo.

DETERMINACIÓN DE LA ESTRUCTURA DE COMUNIDADES MICROBIANAS

• Los alimentos fermentados, se obtienen mediante fermentaciones naturales. El uso de los métodos convencionales para la identificación de cada uno de sus miembros resulta insuficiente.

• Una alternativa es aislar microorganismos y tipificarlos; otra es utilizar métodos que no dependen del cultivo, en los que se extraen ácidos nucleicos directamente del alimento.

Limitaciones de las técnicas

• Estos métodos novedosos tienen limitaciones. • Los métodos de extracción de ácidos nucleicos de las muestras no aseguran la lisis de todos los microorganismos presentes y la recuperación de los ácidos nucleicos intactos.

• Es importante purificar los ácidos nucleicos obtenidos para eliminar sustancias que puedan inhibir la reacción de PCR o la acción de enzimas de restricción.

• Es posible que ocurra la co-migración de fragmentos de DNA, que provocaría la subestimación de la diversidad microbiana.

• Dificultad para extraer secuencias para su identificación o la sobreestimación de la diversidad debido a la microheterogeneidad en las secuencias de algunos genes.

Conclusiones

• Muchos alimentos fermentados se producen con la participación de una microbiota compleja.

• Para producirlos en condiciones más controladas que aseguren su calidad e inocuidad es importante profundizar en el estudio de su microbiología. • Esto permitirá la selección adecuada de cultivosiniciadores, en los casos que se considere conveniente, así como el monitoreo y control de la fermentación.

• Los avances recientes en los métodos para el análisis de comunidades microbianas hacen posible complementar a los métodos tradicionales para obtener información sobre aspectos importantes de la microbiota de alimentos fermentados: diversidad, estructura y función.