Transcript Técnicas de muestreo para el control microbiológico.

Técnicas de muestreo para
el control microbiológico.
Dra. Keiko Shirai
Muestreo
 Es la sucesión de
pasos para asegurar
que la muestra posea
las características
esenciales del lote.
Muestra
 Una porción de
material tomada y
seleccionada de tal
forma que sea
representativa del lote
(IUPAC).



La muestra
seleccionada para el
análisis debe ser
representativa del lote
entero del alimento y
lo suficientemente
grande para poder
llevar acabo todas las
determinaciones.
La técnica de análisis
sea ejecutada con
estricto apego a la
metodología
establecida.
Comparación con
normas o estándares
de calidad
Para realizar un muestreo en forma práctica
se utiliza el "Sentido Común".
La experiencia de los procesos de
fabricación permite que el muestreo puede
resolverse al tanteo.


Ejemplo 1: tomando muestras al principio y al
final de la jornada;
Ejemplo 2: tomando como muestra el último
producto de cada serie (como se hace con
algunos alimentos precocidos y congelados).
Desde el punto de vista
microbiológico….
¿Cómo debo de realizar el muestreo?
¿Qué cuidados debo de tener para
evitar un resultado erróneo?

Criterios Generales de
Muestreo.




estéril y envuelto
evitar contaminación
del ambiente.
rotular o etiquetar.
Consignar información




transportar
muestras
de
alimentos
perecederos
bajo
refrigeración o en congelación.
evitar agua de deshielo
reducir
tiempo
comprendido
entre recolección y entrega de la
muestra.
muestras
líquidas
deben
encontrarse homogéneas


¿Cómo manejar una muestra
sólida?
¿Cómo evitar heterogeneidad?
Para muestras sólidas





se recomienda un peso de 100
gramos
a granel o en recipientes o piezas
grandes integrar una muestra
representativa
pueden tomarse muestras de la
superficie y profundas
obtención de muestras
superficiales
usar líquidos de dilución con bajo
potencial redox para anaerobios
estrictos

en alimentos
congelados

Una vez que tengo
la muestra estoy
listo para
trabajar…
Pero
cómo empezar…
1.
2.
Técnicas de
manejo de
muestras.
3.
4.
Recuento en placa
Número más
probable
Reducción de
colorantes
Recuento directo al
microscopio
Recuento en placa: Dilución para conteo de
microorganismos viables




Si es muestra líquida congelada
fundirla y homogeneizarla.
evitar escurrimientos
para muestras sólidas se licua o
se puede usar un mortero estéril.
El volumen que se transfiere
nunca será menor del 10% de la
capacidad total de la pipeta,
¿Cuántas pipetas
estériles deberé de
utilizar para evitar
contaminación y
error?
Cuenta en placa


Consiste en contar
colonias que se
desarrollan después
de cierto tiempo
presupone que cada
colonia proviene de
un microorganismo
en la muestra.


Vertido
Superficie
Reglas para conteo en placa
1.
2.
3.
30 a 300 colonias
Contar todas las colonias de la placa.
Si el número se estima mayor de 300 y no hay diluciones
subsecuentes:
1.
2.
3.
4.
5.
301-500 colonias se divide en dos partes y el número de colonias contadas
se multiplica por 2.
501-800 colonias se divide en cuatro partes
>800 colonias se cuentan de 10 a 20 cuadros se promedia y se multiplica por
el número de cuadros que ocupa la caja.
Multiplicar el número de colonias por el inverso de la dilución
Redondear la cifra obtenida a dos dígitos al inicio de la cifra
por ejemplo:
129 se reporta 130
2,417 se reporta 2400
49 se reporta 49
Diluyentes de uso general
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



Agua peptonada 0.1%
pH 6.8-7
Solución amortiguadora
de fosfatos 0.1M pH 7
Solución de Ringer
Medio enriquecido para
clostridios
Solución de sacarosa al
20% o NaCl al 15%,
osmófilos y halófilos
respectivamente.
Factores que afectan el recuento en
placa
Métodos de muestreo
2. Distribución de los microorganismos en el
alimento
3. Naturaleza de la flora del alimento
4. Naturaleza del alimento
5. Antecedentes del alimento previos al examen
6. Adecuación nutricional del medio utilizado para el
cultivo en placas
7. Temperatura y tiempo de incubación
8. pH, aW y potencial de óxido reducción
9. Tipo de diluyente
10. Número relativo de microorganismos en la
muestra
11. Existencia de otros microorganismos
competidores o antagonistas
1.
Número más probable: Recuento en
tubo



supone una concentración de
microorganismos pequeña
estimación estadística de la densidad de
bacterias en el alimento
permite la inclusión de agentes selectivos
Pruebas presuntivas


se utiliza como una etapa de
enriquecimiento que busca
aumentar la concentración de
microorganismo de interés.
Se considera positivos
aquellos que después de
incubados presenten
enturbiamiento, cambio de
color, formación de gas.
Ejemplo para coliformes
Caldo Lauril sulfato
Fermentación de carbohidratos como caldo
lactosado.

Pruebas confirmativas


De los tubos positivos de la
prueba presuntiva se
inoculan a la prueba
confirmativa. El número de
tubos positivos y negativos
determinará el Número Más
Probable
Ejemplo para coliformes
caldo EC.
Tabla
Número
Más
Probable
Número Más Probable

Ventajas




Sencillo
Es más probable que los resultados coincidan
entre laboratorios a diferencia del recuento en
placa.
Con medios selectivos y diferenciales se puede
determinar el número de microorganismos a
que grupo pertenecen.
Desventajas



Gran cantidad de material
No se puede observar la morfología de las
colonias
Poco exacto
Método de la reducción de
colorantes

Se basa en el tiempo transcurrido
para que tenga lugar la reducción
del colorante es inversamente
proporcional al número de
microorganismos existentes en la
muestra.
Resazurina

Azul pizarra al rosa
o al blanco
morada
rosa
blanco
dihydroresorufin
Azul de metileno

Ventajas


Sencillas, rápidas, baratas y solamente
las células viables reducen los
colorantes.
Desventajas


Las sustancias reductoras propias de
los alimentos pueden afectar el
resultado.
No todos los microorganismos reducen
de igual modo los colorantes.
Recuento directo al microscopio

Consiste en:



Frotis de la
muestra ó cultivo
en portaobjetos
Tinción mediante
un colorante
Observación al
microscopio y
recuento

Para calcular el número de
microorganismos por ml de la
muestra:



Calcular el promedio contado por cada
cuadro
Multiplicar el promedio por 10,000 para
obtener el número de células por ml de
la muestra diluida.
Multiplicar el resultado obtenido por el
factor de dilución.
Ejemplo


Suponga que diluyó la muestra
original (0.1 ml) en 9.9 ml de
diluyente
La cuenta en 5 de los 25 cuadros
grandes fue de 132 y 128 células.
Ejemplo resuelto



El promedio de células fue de 130 x 5 o
650 células por área contada (650
células por 0.1 microlitro).
Multiplicamos las 650 células por área
contada por 10,000 para obtener el
número de células/ml de muestra diluida
(6,500,000)
Multiplicamos 6,500,000 cells/ml por
100 (factor de dilución) para obtener
650,000,000 por ml of muestra original.

Ventajas
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
Sencillo y rápido
Se puede apreciar la morfología
Desventajas
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Cansado
Se cuentan viables y no viables
Las partículas del alimento no siempre pueden
ser diferenciados sustancias
Las células microbianas no están distribuida
uniformemente con respecto a células aisladas.
Algunas células no se tiñen bien.
Conteos elevados.