Transcript metode za ugotavljanje potvorb mesnih izdelkov

UGOTAVLJANJE
POTVORB MESNIH
IZDELKOV
Kako dokazati prevelik dodatek vezivnega tkiva
(kite, kožice...)?
 Kjeldal??? (kaj, pa če je proizvajalec dodal kakšno
organsko spojino, da je povečal vsebnost organskega
N?)
 določiti mišične beljakovine
– mifibrilarne (AK, oligopeptide)
– ali sarkoplazemske
– ali pa kakšno drugo specifično spojino?
 določiti količino vezivnega tkiva?
Kako dokazati nedeklariran dodatek rastlinskih
beljakovin?
Kaj pa, če je v tej klobasi deklarirano svinjsko
meso zamenjano s piščančjim, ki je cenejše?
Pravilnik o veterinarskih pogojih za
proizvodnjo, dajanje na trg ter uvoz mletega
mesa in mesnih pripravkov (2004)
delež kolagenskih mesnih
beljakovin
pusto mleto meso
 12
mleto čisto goveje meso
 15
mleto meso, ki vsebuje prašičje meso
 18
mleto meso drugih vrst
 15
Pravilnik o kakovosti mesnih izdelkov (2004)
mišične beljakovine (%)
barjene klobase
≥8
kranjska
≥ 16
tirolska
≥ 13
šunkarica
≥ 16
konzervirano meso (ekstra kak. razred)
≥ 16
sušene klobase (zimska,…)
presne klobase (pečenice)
masti < 2 x beljak.
≥8
vsebnost mišičnih beljakovin
določanje vsebnosti veznega tkiva
• vsebnost hidroksiprolina
• metode določanja nekaterih sestavin
mišičnih celic z nizkimi molskimi masami • ISO metoda
• metoda Bauer
• metode ugotavljanja značilne sestave
mišičnih vlaken beljakovin
• infrardeča spektroskopija
POTVORBE
določanje vsebnosti rastlinskih beljakovin
• mikroskopske metode
• imunološke metode
• indirektne metode
ugotavljanje vrste (izvora) mesa
• imunološke metode
• izoelektrično fokusiranje
• druge metode (DNA/PCR)
DOLOČANJE VSEBNOSTI MIŠIČNIH BELJAKOVIN
V MESNIH IZDELKIH
•
•
najpomembnejše sestavine mesa z vidika človeške prehrane so beljakovine (20 %)
vsebnost beljakovin klasično določamo z metodo po Kjeldahlu
(celokupni N x korekturni faktor 6,25 = organski N)
• v mesne izdelke (na osnovi mesnih emulzij) poleg čiste mišičnine in mastnega tkiva
dodajajo tudi:
– večje količine veznega tkiva (kožice, kite, tetive; nižja biološka vrednost, slabša
prebavljivost)
– tuj (nemesni) dušik:
• Na-glutaminat in proteinski hidrolizati (dodajajo se zaradi izboljšanja arome),
• razni dodatki z vprašljivimi funkcijami - npr. AK lizin in glicin
• nadomestki samo zaradi zvišanja vsebnosti N (sečnina, amonijev klorid)
• tuje (nemesne) beljakovine (mlečne, rastlinske beljakovine)
• univerzalne kvantitativne analitične metode ni na razpolago:
1. metode določanja nekaterih sestavin mišičnih celic z nizkimi molskimi masami
2. metode ugotavljanja značilne sestave mišičnih beljakovin
1. metode določanja nekaterih sestavin mišičnih celic z nizkimi
molskimi masami
Za uporabo teh metod morajo biti izpolnjeni naslednji pogoji:
• specifičnost sestavine (ne sme se pojavljati v dodatkih nemišičnega izvora)
• konstantna vsebnost sestavine v mišičnini različnih vrst živali in različnih mišicah
• visoka ekstraktibilnost sestavine
• stabilnost sestavine med toplotno obdelavo
• kreatin, karnozin, anzerin in balenin.
a) Določanje vsebnosti kreatina
•
•
•
•
•
•
je ena od karakterističnih sestavin živalskih tkiv z nizko molsko maso
v živi mišici je prisoten v glavnem v obliki kreatin-fosfata
med posmrtno glikolizo se kreatin-fosfat razgrajuje v kreatin
tkiva in organi vsebujejo različne, tipične količine, enake pri živalih različnih vrst
z naraščanjem količine čiste mišičnine v nekem izdelku naraste tudi vsebnost kreatina
vsebnost kreatina lahko služi za ugotavljanje količine čiste mišičnine v mesnih izdelkih
Kreatin analitično določamo z različnimi metodami:
-
klasične metode (so zamudne)
encimske metode
fotometrične metode
tekočinska kromatografija.
Pomanjkljivosti teh metod:
– zaradi nizke vsebnosti kreatina v jetrih te metode niso uporabne za izdelke iz jeter
– kreatin se med toplotno obdelavo počasi razgrajuje
– cena čistega kreatina izredno nizka
b) Določanje vsebnosti karnozina, anzerina in balenina
•
•
•
so dipeptidi (sestavljeni iz ß-alanina, ki ima karboksilno skupino vezano na -amino
skupino histidina, 1-metilhistidina ali 3-metilhistidina)
pomanjkljivost: nahajajo se v zelo različnih količinah v skeletnih mišicah
vretenčarjev
določamo s tekočinsko kromatografijo
2. metode ugotavljanja značilne sestave mišičnih beljakovin
Za uporabo teh metod morajo biti izpolnjeni naslednji pogoji:
• čim bolj konstantna vsebnost izbrane beljakovine v mišičnini klavnih živali
(ta pogoj bolje izpolnjujejo miofibrilarne kot sarkoplazemske belj.)
• postopek izdelave izdelka, zlasti toplotna obdelava, ne sme vplivati na
lastnosti izbrane beljakovine.
I. Določanje aminokislin
II. Določanje peptidov
I. Določanje aminokislin
a) Določanje vsebnosti metiliranih aminokislin
•
•
•
polipeptidne verige miofibrilarnih belj. vsebujejo majhne količine metiliranih AK
primerni sta dve metilirani AK:
– 3-metil-histidin (Nt-MeHis; 3-MeHis; 3 metilne sk. vezane na histidin, aktin)
– metil-lizin (-N-monometillizin; MeLys), ki se nahaja v miozinu
ta metoda se še ne izvaja
b) Določanje aminokislinske sestave vzorca
•
•
•
vsaka belj. ima svojo značilno AK sestavo - posredno določanje čiste mišičnine
določanje z aparati na principu infrardeče spektroskopije
prednosti teh metod:
– je zanesljiva in natančna
– čas analize pa je izredno kratek (rezultat dobimo v nekaj minutah)
• dva osnovna principa:
•
– merjenje intenzitete odbite energije
– merjenje zmanjšanja intenzitete transmitirane energije
absorbcija energije pri specifičnih valovnih dolžinah je v določenem odnosu s
kemijskimi vezmi v masteh, belj. in OH
II. Določanje peptidov
 lastnost, ki je za neko beljakovino še bolj specifična kot njena AK sestava, je
primarna struktura beljakovine
 cepitev na peptide s pomočjo proteolitičnih encimov (npr. tripsin,
kimotripsin) ali pa s pomočjo nekaterih selektivnih reagentov (npr. cianogen
bromid)
 dobljene oligopeptide kvantitativno izoliramo iz zmesi in jih kvantitativno
določimo s pomočjo kromatografskih metod
 vsebnost določenih oligopeptidov je merilo za vsebnost čistih mišičnih
beljakovin v nekem mesnem izdelku
 v praksi se ta način določanja vsebnosti čiste mišičnine v mesnih izdelkih še
ne uporablja.
vse analitične metode za določanje vsebnosti čiste mišičnine v
mesnih izdelkih imajo določene pomanjkljivosti in so še
vedno v fazi raziskovanja in izpopolnjevanja ter se v glavnem
v praksi še ne uporabljajo
DOLOČANJE VSEBNOSTI VEZNEGA TKIVA V
MESNIH IZDELKIH
•
•
•
•
•
•
•
vezivno tkivo: kolagen, elastin in retikulin
slabše prebavljivo
po TO je kolagen lažje prebavljiv, elastin pa še vedno ne
manj esencialnih AK - nižja biološka vrednost
pravilnik omejuje vezivo v svežem, mletem mesu
analize niso problematične, a so dolgotrajne
temeljijo na določanju AK hidroksiprolin (12 – 13 % v vezivu):
1. metoda določanja vsebnosti hidroksiprolina po Neumanu in Loganu,
modificirana po Möhlerju in Antonacopoulosu
2. ISO metoda, izpeljana iz metode Stegemann-Stalder
3. metoda Bauer (1991)
4. infrardeča spektroskopija
1. Metoda določanja vsebnosti hidroksiprolina po Neumanu in Loganu,
modificirana po Möhlerju in Antonacopoulosu:
Princip:
•
•
•
•
•
hidroliza vzorca z SnCl2 16 ur pri 105 °C - sproščanje hidroksiprolina iz kolagena
oksidacija hidrolizata s kloraminom
dodajanje barvnega reagenta (diaminobenzaldehid + perklorna kislina +
izopropanol)
fotometrično merjenje rožnato-rdeče barve
metoda je zelo dolgotrajna
2. ISO metoda, izpeljana iz metode Stegemann-Stalder
•
•
krajša - čas hidrolize 7 ur
kolorimetrično merjenje oksidiranega hidroksiprolina ob uporabi barvnega
reagenta (p-dimetilaminobenzaldehid + perklorna kislina + n-propanol)
3. Metoda Bauer (1991)
•
•
•
hidroliza z mikrovalovno tehniko (s HCl pri 5,9 bar) - čas hidrolize = 30 minut
fotometrično določanje vsebnosti hidroksiprolina
čas celotne analize je 2 uri
4. Infrardeča spektroskopija
• v 1 uri se kvantitativno določi kolagen v 8 do 10 vzorcih
DOLOČANJE RASTLINSKIH BELJAKOVIN V
MESNIH IZDELKIH
•
•
•
•
vloga rastlinskih belj. (SVV, tekstura, zvišanje vsebnosti beljakovin)
če niso deklarirane - potvorba izdelka
sojini proteini
metode:
1. mikroskopske
2. imuno-kemijske (imunološke) (kvantitativni testi)
3. indirektne (kvantitativni testi)
1. mikroskopske metode
• kvalitativni testi - paličaste celice in celice v obliki peščene ure
2. imuno-kemijske (imunološke) metode (kvantitativni testi)
•
•
temeljijo na specifičnih reakcijah med antigeni (npr. sojin protein) in njihovimi
protitelesi, prisotnimi v antiserumu, ki se tvori v poskusni živali
specifično vezanje antigena na ustrezno protitelo, razultat je oborina, zlepljanje
3. indirektne (kvantitativni testi)
•
•
•
•
•
•
temeljijo na določanju vsebnosti nekaterih ne-proteinskih sestavin v preparatih soje
določanje vsebnosti polisaharidov, oligosaharidov, na proteine vezanih sladkorjev,
prostih aminokislin in peptidov, fitatov, saponinov, sterolov, kovin - kot indeksov za
sojine oz. rastlinske beljakovine
sestavine specifične za sojo, kemijsko stabilne med postopki predelave in med
skladiščenjem, njihova količina v sojinih preparatih pa mora biti konstantna
visoko tlačna tekočinska kromatografija
mangan in magnezij
izolati sojinih proteinov so običajno brez spremljajočih snovi, zato se dodajajo
indikatorji, "sintetični markerji”, titanov dioksid
UGOTAVLJANJE VRSTE (IZVORA) MESA
• strojno odkoščeno meso - vizuelno je nemogoče ločiti
vrsto mesa
UGOTAVLJANJE VRSTE (IZVORA) MESA
Identifikacija posameznih vrst mesa je zelo pomembna zaradi:
• pravnih: različne države in organizacije predpisujejo svoja pravila,
kakšni morajo biti izdelki, katere vrste mesa so lahko prisotne v
posameznih izdelkih ali katerim pogojem morajo izdelki ustrezati.
• ekonomskih: nekateri proizvajalci prodajajo meso in izdelke cenejše
vrste pod deklaracijo druge vrste (tune, perutnina...)
• religioznih vzrokov: poznamo predvsem problem s prisotnostjo
svinjine zaradi muslimanov (govedina – Indija, vegetarijanci...)
Konvencionalne metode temeljijo na identifikaciji beljakovin posameznih
vrst mesa: elektroforeza in imunološke metode (kvalitativno, ne
moreta ločevati mesa sorodnih živali!!)
DNA/PCR tehnike – novejše metode
1. imunsko-kemijske (imunološke) metode
•
•
reakcije antigeni/protitelesa - obarjalni testi
metoda ELISA (enzyme - linked imunosorbent assay) - testiranje antigenov in protiteles
- diferenciacija različnih vrst presnega mesa)
• razlaga metode:
a) sendvič sistem
—l–<
—l–<
reakcija
—l–< + A 
—l–<
—l–<
protitelesa
antigeni
(v vzorcu)
b) dvojni sendvič .....)
—l–<A
—l–<A>—l–E
—l–<A >—l–E —l–<A>—l–E
—l–<A

—l–<A>—l–E
—l–<A
—l–<A>—l–E
—l–<A
—l–<A>—l–E
protitelesa,
markirana z
encimom
markirana protitelesa,
vezana na antigene
2. izoelektrično fokusiranje - diferenciacija različnih vrst mesa v izdelkih,
toplotno obdelanih do 100 °C (primerna za sveže in zmrznjeno meso)
• ekstrakcija proteinov iz vzorca
• razstavljanje proteinov na komponente z elektroforezo v poliakrilamidnem
gelu (glede na njihov naboj, velikost in izoelektrično točko)
• barvanje (po različnih metodah) in izvrednotenje komponent (vzporedno s
standardom)
• kot dokument (prstni odtis proteinov, dokaz) služi fotografija gela z
obarvanimi komponentami proteinov vzorca
Analiza je končana v 2 do 3 urah.
3. druge metode za identifikacijo mesa v toplotno obdelanih izdelkih
• določanje specifičnih toplotno stabilnih sestavin (npr. piščančje meso se od
prašičjega loči po razmerju dipeptidov anzerin/karnozin)
• določanje vrste živalske maščobe (analiza maščobnih kislin, tipičnih za
posamezno vrsto živali, vendar moti prehrana)
• diferenciacija vrst mesa z določanjem peptidov po razgradnji s tripsinom
(tenkoplastna kromatografija in HPLC)
• DNA/PCR tehnike: temeljijo na določanju DNA fragmentov določenih vrst,
zelo občutljive metode, možno kvantificiranje