Transcript Bacheloroppgave verifisering Cobas 8000..

Bacheloroppgave i Bioingeniørfag, BIOIN - 112
Kandidatnummer: 11
Verifisering av Cobas® 8000 for analysering av
Valproat
Bioingeniørfag, kull 2010
Universitetet i Tromsø
Innhold
Forord ......................................................................................................................................... 3
Sammendrag ............................................................................................................................... 4
Innledning................................................................................................................................... 5
Teori ........................................................................................................................................... 5
Valproat ...................................................................................................................................... 5
Farmakokinetikk......................................................................................................................... 7
Absorpsjon ............................................................................................................................. 7
Distribusjon ............................................................................................................................ 8
Eliminasjon............................................................................................................................. 8
Valproat kinetikk ........................................................................................................................ 9
Farmakodynamikk ...................................................................................................................... 9
Medikamentreseptorer ............................................................................................................ 9
Virkning ............................................................................................................................... 10
Bivirkning............................................................................................................................. 10
Olympus AU 400 ..................................................................................................................... 10
Analyseprinsipp .................................................................................................................... 11
Cobas® 8000 ............................................................................................................................ 12
Analyseprinsipp .................................................................................................................... 12
Forhold som påvirker analysesvar ............................................................................................ 12
Preanalytiske forhold ............................................................................................................ 13
Analytiske forhold ................................................................................................................ 13
Postanalytiske forhold .......................................................................................................... 14
Verifisering ............................................................................................................................... 14
Interferens ............................................................................................................................. 15
Presisjon ............................................................................................................................... 15
Riktighet ............................................................................................................................... 16
Statistikk ............................................................................................................................... 16
Materiale og Metode ................................................................................................................ 18
Prøveinnsamling ................................................................................................................... 18
1
Analysering .......................................................................................................................... 18
Sammenlikningsforsøk ......................................................................................................... 19
Grenseverdier ................................................................................................................... 19
Reagenser, kontroller og kalibrator ...................................................................................... 19
Resultat ..................................................................................................................................... 22
Sammenlikningsforsøk ......................................................................................................... 22
Bias mellom enhetene ...................................................................................................... 22
Presisjon ............................................................................................................................... 25
Mellom serie presisjon ..................................................................................................... 25
Innen serie presisjon ......................................................................................................... 25
Riktighet ............................................................................................................................... 26
Diskusjon .................................................................................................................................. 26
Presisjon ............................................................................................................................... 28
Mellom serie presisjon ..................................................................................................... 28
Innen serie presisjon ......................................................................................................... 29
Riktighet ............................................................................................................................... 29
Konklusjon ............................................................................................................................... 30
Litteratur ................................................................................................................................... 31
2
Forord
Dette er en avsluttende bacheloroppgave ved bioingeniørutdanningen ved Universitetet i
Tromsø, våren 2013. Den praktiske delen av oppgaven ble utført i løpet av 1 uke våren 2013,
på fagområdet Klinisk Farmakologi og fagområdet Medisinsk Biokjemi ved
Universitetssykehuset i Nord - Norge, avdeling Tromsø.
Den praktiske delen bestod av et sammenlikningsforsøk, hvor det ble benyttet 40
pasientprøver i duplikat. Prøvene ble analysert på Olympus AU400 og Cobas® 8000. Mellom
serie presisjon ble studert ved hjelp av interne kontroller, mens innen serie presisjon ble
studert ved en presisjonssjekk. Riktigheten ble undersøkt ved å benytte eksterne
kvalitetskontroller.
Laboratoriemedisin ved UNN Tromsø ønsker å flytte analyseringen av Valproat fra Olympus
AU400, som drives av Klinisk Farmakologi, til Cobas® 8000 som drives av Medisinsk
Biokjemi. Dette kommer av at Cobas® 8000 er i døgnkontinuerlig drift, mens Olympus AU
400 kun er i drift mandag - fredag fra 08.00-15.00.
Oppgaven er hovedsakelig rettet mot bioingeniører, spesielt de som interesserer seg for
fagområdet klinisk farmakologi. Men personer som driver med verifisering av analyser kan
også ha glede av oppgaven.
Ønsker å rette en stor takk til min praktiske veileder Hårek Sørensen ved Laboratoriemedisin
for et flott samarbeid. Veileder har vært til stor hjelp ved planlegging og tilrettelegging av det
praktiske arbeidet. Han har og vært tilgjengelig for spørsmål etter at den praktiske delen var
gjennomført. Ønsker også å takke skriveveileder Kirsten Raanas Huseby og Ellen Blom ved
Universitetet i Tromsø for god veiledning under skrivingen av oppgaven.
Tromsø 31. mai 2013
3
Sammendrag
Bakgrunnen for oppgaven er at Laboratoriemedisin ved UNN Tromsø ønsker å overføre
analyseringen av Valproat fra Olympus AU 400 til Cobas® 8000. Endringen skal føre til at
Valproat skal kunne analyseres døgnkontinuerlig, samt bestilles som øyeblikkelig hjelps
analyse.
For at Medisinsk Biokjemi skal kunne analysere Valproat på Cobas® 8000 må analysen
verifiseres. Verifiseringen ble utført ved hjelp av 40 pasientprøver som ble analysert i
duplikater på begge instrumentene.
Resultatet fra sammenlikningsforsøket viser at Cobas® 8000 i gjennomsnitt gir et lavere
analyseresultat enn Olympus AU 400. Fra et medisinsk ståsted ble det bestemt at resultatene
var tilfredsstillende til å benytte Cobas® 8000 som analyseinstrument for Valproat. Allikevel
er det anbefalt flere målinger av interne kontroller, samt analysering av nyere eksterne
kontroller, for bedre vurdering av presisjon og riktighet på Cobas® 8000.
4
Innledning
Ved fagområde Medisinsk Biokjemi på Laboratoriemedisin ved Universitetssykehuset Nord
Norge (UNN) Tromsø, analyseres mange medikamentanalyser på Cobas® 8000. Fagområdet
ønsker å undersøke om analysering av Valproat kan flyttes fra analyseinstrumentet Olympus
AU 400 til Cobas® 8000. Grunnlaget for dette er at analyseinstrumentet Olympus AU 400
befinner seg på Klinisk Farmakologi, og ikke er bemannet på kveldstid, helger eller
helligdager. Dette betyr at Valproat bare analyseres mandag-fredag på formiddager. Cobas®
800 som driftes av Medisinsk Biokjemi er alltid bemannet, noe som betyr at dersom man kan
analysere Valproat på Cobas® 8000, vil denne analysen kunne besvares alle dager. Det vil
også være mulig å bestille denne analysen som en øyeblikkelig hjelps analyse.
Analysen av Valproat er validert av Roche på Cobas® 8000, derfor er det nå ønskelig med en
verifisering av analysen.
Teori
Valproat
Valproat er en kort-kjedet fettsyre med antiepileptisk effekt og stemningsbasert virkning
(Figur 1). Det har en molekylvekt på 144,21, og den kjemiske utformingen av Valproat er
forskjellig fra alle andre antiepileptiske medikamenter [1]
Figur 1: Illustrasjon over kjemisk struktur til Valproat [2].
5
Virkningsmekanismen er ikke fullstendig forstått, men det antas at Valproat øker nivået av
gamma amino butansyre (GABA) i hjernen, samt blokkerer spenningsavhengige
natriumkanaler i nervecellemembranen [3, 4]. GABA fungerer normalt ved å hemme signaler
mellom nevroner i hjernen. Valproat ble godkjent som legemiddel for behandling av epilepsi
hos voksne og barn i 1978, og er et av de vanligste krampestillende medikamentene som
brukes i dag. Det er godkjent for bruk i monoterapi, og i kombinasjon med andre
krampestillende medikamenter for behandling av komplekse fraværende krampeanfall,
komplekse delvise krampeanfall og andre typer krampeanfall. Man benytter og Valproat i
behandlingen av migrene og bipolare lidelser [3].
Valproat er tilgjengelig under ulike navn, og finnes i forskjellige medikamentformer (kapsler,
tabletter, flytende), dosene varierer fra 125-500mg [3]. Tiden til maksimal
serumkonsentrasjon som nås etter inntak er avhengig av medikamentformen, og
proteinbindingen i serum er nesten 90 % hvor Valproat primært bindes til albumin [4]. Det er
den frie konsentrasjonen av legemiddelet som er aktivt, noe som er spesielt viktig ved
hypoalbuminemi [5]. Ved høye serumkonsentrasjoner vil den frie fraksjonen være noe høyere.
Sialinsyre og frie fettsyrer kan konkurrere med Valproat om bindingssete på albumin [6].
Halveringstiden antas å være 10-15 timer, og farmakologisk likevekt inntrer i serum etter tre
døgn [4].
Valproat metaboliseres av leveren å skilles ut i urinen [3]. Metaboliseringen i leveren skjer i
hovedsak ved glukoronisering [4] og ved betaoksidasjon. CYP2C9 og CYP2C19 er også
involvert i metabolismen [7]. CYP er en stor gruppe med mangfoldige enzymer i leveren som
katalyserer oksideringen av organiske substanser [8]. Det er dårlig korrelasjon mellom dose
og serumkonsentrasjon, særlig dersom pasienten også bruker andre antiepileptiske
medikamenter [4].
Studier har vist at 5-10 % av langtidsbrukerne vil få forhøyede ALP (alkaliske fosfataser)
verdier, men dette er som oftest asymptomatisk og kan forsvinne av seg selv. Valproat kan
derimot føre til levertoksisitet, og det er rapportert over 100 dødsfall som følge av kronisk
leverskade hos Valproat brukere [3]. Grunnlaget for levertoksisiteten tror man kommer av
mitokondrie toksisitet, ved inhibisjon av beta oksidering og dermed tap av mitokondriets
funksjon. Behandling med Valproat øker konsentrasjonen av carnitine i vevet, som igjen kan
påvirke mitokondrie aktiviteten og forårsake hyperammoniumemi og mikrovaskulær steatose
6
(opphopning av fett). Genetiske faktorer ser også ut til å spille en rolle i levertoksisitet ved
bruk av Valproat. Pasienter som er heterozygot for mutasjoner i gamma polymerasen
(predominant DNA polymerase i mitokondrier) har større sannsynlighet for å utvikle
levertoksisitet ved bruk av Valproat. Levertoksisiteten varierer fra minimal og asymptomatisk
forhøyet ALP til svært alvorlig med ikterus, hepatisk syntetisk dysfunksjon, koma og død [3].
Antatt terapeutisk nivå for epilepsi er 300-600µmol/L, kan være noe høyere ved bruk mot
bipolare lidelser [7]. Alvorlige bivirkninger kan forekomme også ved serumkonsentrasjoner i
terapeutisk område. Serumkonsentrasjoner over 700µmol/L anses å medfører risiko for
forgiftning [4].
Farmakokinetikk
For å gi en bedre forståelse for hvordan Valproat kan påvises i kroppen, vil oppgaven videre
gi en generell beskrivelse av hva som skjer i kroppen når man inntar medikamenter. De ulike
leddene innen farmakokinetikk vil bli gjennomgått, før oppgaven gjennomgår
farmakokinetikk spesifikt for Valproat.
Farmakokinetikk er læren om hva kroppen gjør med et legemiddel (LM). Det dreier seg
nærmere bestemt om opptaket i organismen (absorpsjon), fordelingen mellom ulike vev og
kroppsvæsker (distribusjon) og utskillelsen av legemiddelet fra kroppen (eliminasjon).
Absorpsjon
Den galentiske utformingen til et LM refererer til hvordan det er produsert. Legemidlets form,
mengde fyllstoff, oppløsningstid, ol. Disse, og legemidlets fysiske egenskaper bestemmer dets
effekt. Et LM som skal passere lipidholdige membraner må for eksempel være fettløselig for å
kunne passere. Ved produksjon må man også ta hensyn til virkningssted, altså hvor i kroppen
LM skal utføre sin virkning. Konstruksjonen må derfor være slik at LM når frem til
virkningsstedet, og at konsentrasjonen ved virkningsstedet er tilfredsstillende høy [8].
Den biologiske tilgjengeligheten av LM er den konsentrasjonen som når systemkretsløpet.
Den avhenger av hvor mye av LM som ikke blir absorbert, hvor mye LM som brytes ned i
mage/tarm og total mengde LM som blir metabolisert ved første passasje i leveren. I
absorpsjonsfasen øker plasmakonsentrasjonen fordi absorpsjonsprosessen dominerer over
distribusjonsprosessen og eliminasjonsprosessen [8].
7
Distribusjon
Fordelingen av LM til vevene er avhengig av proteinbinding, lipidløselighet, molekylstørrelse
og blodgjennomstrømningen i vevet som LM skal nå. Distribusjonsvolum Vd er et tenkt
tilsynelatende volum og kan være større enn kroppsvolumet. Volumet beskriver hele volumet
som legemiddeldosen ville vært fordelt i, dersom det hadde samme konsentrasjon som i
blodet. Et LM med stort Vd vil fordele seg med forholdsvis større mengde utenfor blodet enn
LM med lite Vd [8].
Eliminasjon
Eliminasjonen av et LM beskrives ofte som clearance, og sier noe om hvor effektivt en
substans elimineres fra kroppen. Clearance angir hvor stort blodvolum som renses for
legemiddel pr tidsenhet (ml/min) [8].
Et legemiddels halveringstid gir informasjon om eliminasjonshastigheten. Tiden det tar fra
konsentrasjonen av et legemiddel reduseres fra en bestemt verdi til halvparten av denne
verdien betegnes som halveringstiden, T ½. Fullstendig eliminering av LM fra kroppen sies å
være fem ganger T ½. Det vil da være 3,25 % igjen av LM, og det forventes ikke lenger at
LM utøver noen effekt.
De fleste LM elimineres med en hastighet som er proporsjonal til konsentrasjonen. Dess
høyere LM konsentrasjon, dess hurtigere elimineres det. Dette kalles 1. ordens kinetikk, og
betyr at kroppens kapasitet for å eliminere LM ikke er overskredet. Dersom eliminasjons
kapasiteten overskrides, vil LM utskilles med konstant hastighet. Dette kaller man for 0`te
ordens kinetikk, også kalt metningskinetikk. Ved denne typen eliminasjon vil tiden det tar før
stoffet er utskilt, øke med økende konsentrasjon i blodet. Halveringstiden vil da være
avhengig av hvor stor mengde LM som er tilført. Eliminasjonsfasen inkluderer både
metabolisme og utskillelse [8].
8
Valproat kinetikk
Valproat absorberes raskt fra gastrointestinale tractus (GI), og biotilgjengeligheten ved oral
administrasjon er > 90 %. Valproat kan også administreres parenteralt, enten intravenøst eller
ved injeksjoner [7]. Medikamentet metaboliseres nesten kun av leveren. Hos voksne pasienter
på monoterapi vil 30-50 % av den administrerte dosen sees i urinen som glukorionide
konjugat. Mitokondrie β-oksidering er som nevnt tidligere den andre store metabolske
bidrageren. Den metaboliserer rundt 40 % av dosen. Mindre enn 3 % av en administrert dose
skilles ut uendret i urinen [9]. Proteinbindingen for Valproat er nesten 90 %, noe som betyr
lavt opptak/ lavt binding i vev. Dette gir Valproat et lavt distribusjonsvolum. I terapeutisk
område har Valproat 1. ordens kinetikk, mens etter 650µmol/L har Valproat
0.ordens/metningskinetikk [10].
Farmakodynamikk
Farmakodynamikk beskriver hva et legemiddel gjør med kroppen. Det omfatter både
biokjemiske effekter i celler og vev, samt effekter hos enkeltindivider og grupper av individer.
Farmakodynamikk forbindes oftest med den ønskede effekten av legemiddelet, men gir også
bakgrunn for å forstå bivirkninger og visse typer interaksjoner [11]. Dose respons kurver
beskriver forholdet mellom en gitt dose og den farmakologiske effekten til legemiddelet. For
å kunne opprettholde et stabilt nivå ”steady state” av legemidlets plasmakonsentrasjon, er det essensielt at tilførselen av legemidlet er likestor som eliminasjonen [8].
Medikamentreseptorer
Legemidler utøver sin effekt på ulike nivåer. Først vil legemiddelet binde seg til et
mottakermolekyl. Denne bindingen vil utløse en respons i cellen hvor mottakermolekylet er
plassert. Responsen på denne bindingen er en forandring i vevet hvor de aktuelle cellene
finnes, og i det organet hvor det aktuelle vevet finnes. Det finnes flere ulike typer
mottakermolekyler. De fire hovedtypene er reseptorer, ionekanaler, transportmolekyler og
enzymer, som alle er proteiner.
9
Et legemiddel som binder seg til et mottakermolekyl for å utøve en virkning kalles en agonist,
mens et legemiddel som binder seg til et mottakermolekyl for å hindre effekt kalles en
antagonist [8].
Virkning
Valproat binder seg til – og inhiberer GABA transmitase. Dens antiepileptiske virkning kan
relateres til økte konsentrasjoner av GABA i hjernen. GABA fungerer som en inhibitorisk
nevrotransmitter i sentralnervesystemet (CNS) ved at den inhiberer enzymer som
kataboliserer GABA eller blokkerer re - opptaket av GABA inn i glia og nerveender. Valproat
har og en mulig virkningsmekanisme ved å undertrykke repeterte nerve ”fyringer” ved å inhibere volt-sensitive natrium kanaler. Valproat er og en histon deacetyalse inhibitor (hindrer
pakkingen av DNA) [9].
Bivirkning
Mindre alvorlige bivirkninger med Valproat er håravfall, søvnighet, skjelving, vektøkning, og
innsovningsvansker. Det er og rapportert tilfeller med menstruasjonsforstyrrelser og utvikling
av polycystisk ovariesyndrom [7]. Den alvorligste bivirkningen til Valproat er levertoksisitet,
hvor dette i verste fall kan føre til døden. Alvorlige bivirkninger sees oftest i forbindelse med
serumkonsentrasjoner på over 700µmol/L, eller dersom pasienten inntar flere ulike typer
antiepileptiske medikamenter samtidig [4].
Olympus AU 400
Olympus AU 400 er et fullautomatisert analyseinstrument, som kan analysere både serum og
uriner. Det kan utføre opptil 38 fotometriske tester samtidig, med et maksimum av 400 tester
per time [12]. Det leveres av Olympus Norge [13].
10
Analyseprinsipp
Analyseringen av Valproat på Olympus AU 400 utføres vha. CEDIA Valproat assay (Figur
2). Analysen er kvantitiativ, dvs. at både fritt og proteinbundet Valproat måles i humant serum
eller plasma. Ved hjelp av rekombinant DNA teknologi (US Patent No, 4708929) er det
produsert et unikt homogent enzym immunoassay system, som baserer seg på bakterie
enzymet β-galaktosidase. Enzymet har blitt genetisk endret til to inaktive fragmenter; a)
enzym akseptor (EA) og b) enzym donor (ED). Disse fragmentene vil spontant reassosiere og
danne et fullt aktivt enzym, som i assayet vil kløyve en substans og generere en
fargeforandring som kan måles spektrofotometrisk ved 570/660nm. Valproat konkurrerer med
ED for antistoff bindingssete. Dersom Valproat er tilstede i prøven binder den til antistoffet,
noe som fører til at ED kan danne et aktivt enzym ved å reassosiere med EA.
Dersom Valproat ikke er tilstede i prøven vil antistoffet binde seg til ED noe som inhiberer
reassosiasjonen av ED og EA. Dette fører til at det ikke dannes et aktivt enzym, og substratet
blir ikke omdannet til et produkt og man får ikke noen fargeforandring. Mengden aktivt
enzym som dannes og resulterende absorbans forandring er direkte proporsjonal til mengde
Valproat tilstede i prøven. Måleområdet for Valproat på Olympus AU 400 er fra 20,79-1040
µmol/L [14]. Prøver hvor Valproat konsentrasjonen overstiger 1044µmol/L fortynnes og reanalyseres før svaret gis ut [15].
Figur 2: Illustrasjon over CEDIA prinsipp for enzymatisk måling av Valproat på Olympus AU
400 [16].
11
Cobas® 8000
Cobas® 8000 modul er designet for å kunne analysere opptil 3-15millioner prøver per år, og
opptil 8400 prøver per time. Instrumentet kan bygges på med opp til fire moduler innen
klinisk kjemi, noe som tillater stor modul fleksibilitet. Det leveres av Roche diagnostics [17].
Analyseprinsipp
Analyseringen av Valproat på Cobas® 8000 baserer seg på et homogent enzym immunassay
prinsipp. Analysen er kvantitativ, dvs. at både fritt og proteinbundet Valproat måles i humant
serum eller plasma. Prinsippet for analysen baserer seg på konkurranse mellom medikamentet
i prøven (Valproat) og medikament merket med enzymet glukose-6-fosfat dehydrogenase
(G6PDH) for antistoffbinding. Enzymaktiviteten minker ved binding til antistoffet, så
medikamentkonsentrasjonen i prøven kan måles ved enzymaktiviteten. Aktive enzymer
konverterer oksidert nikotinamid adenin nukleotid (NAD) til Nicotinamide adenine
dinucleotide (NADH), noe som resulterer i en absorbans økning som kan måles
spektrofotometrisk ved 415/340nm. Dersom prøven inneholder mye Valproat vil man få en
økning i absorbans, da NAD konverteres til NADH. Endogent serum G6PDH interfererer
ikke, fordi koenzymet fungerer kun med bakterielt (Leuconostoc mesenteroides) enzym
tilstede i assayet. Måleområdet for Valproat på Cobas® 800 er fra 19,4µmol/L til 1040µmol/L
[6]. Prøver hvor Valproat konsentrasjonen overstiger 1044µmol/L fortynnes automatisk og reanalyseres før svaret gis ut [15].
Forhold som påvirker analysesvar
Det finnes tre hovedtyper feilkilder knyttet opp mot analysearbeid ved et laboratorium.
Preanalytiske feil er alle feil som kan oppstå før prøven blir analysert, analytiske feilkilder er
feilene som kan oppstå under analysen, mens postanalytiske feil er feil som oppstår etter at
analysen er fullført og til rekvirenten mottar analysesvaret. Preanalytiske, analytiske og
postanalytiske feilkilder går ofte under samlebetegnelsen totale feilkilder [18]. Feilkilder
innenfor disse gruppene som er relevant for denne studien vil bli beskrevet videre i oppgaven.
12
Preanalytiske forhold
Med preanalytiske feilkilder, menes feil som har oppstått fra prøven rekvireres til prøven er
klar for analysering. Slike feil kan forekomme før man tar blodprøven, under
blodprøvetakingen, og etter at prøven er tatt. Feilkilden kan ligge hos rekvirent,
prøvebehandler eller hos pasienten. En preanalytisk feilkilde er å velge feil prøverør. Dette
kan enten gi feil prøvemateriale for analysering, eller minke konsentrasjonen på analytten i
prøvematerialet. Noen medikamenter absorberes av gelen i blodprøveglassene, noe som vil gi
en falsk for lav verdi ved analysering. Rekkefølgen på blodprøveglassene er og viktig, slik at
man ikke overfører tilsetningsstoffer fra et glass til et annet [19]. For analysering av Valproat
skal blodprøven tas på glass uten tilsetning og uten gel. Det er derfor viktig at dette glasset
fylles først ved en blodprøvetakning. Avdamping av væske eller nedbrytning av analytter i en
prøve kan forekomme dersom prøven står for lenge i uønskede forhold (eks. romtemperatur).
Det er derfor viktig at prøvene oppbevares kjølig (også etter tining) og til de skal analyseres.
Valproat har en holdbarhet på 5 dager i kjøleskap og inntil 14 dager i frosset tilstand [5].
Prøvetakningstidspunkt ved analysering av Valproat er viktig. Blodprøven skal tas like før
neste dose, dvs ca 12 timer etter siste dose ved dosering to ganger per dag, og ca 24 timer etter
siste dose ved dosering en gag per dag. Det skal også være oppnådd stabil likevekt ved
prøvetakning, dvs minst tre dager etter oppstart eller doseendring [5].
Analytiske forhold
Analytiske feilkilder er forhold som kan gi feil analysesvar når prøven er inne i instrumentet.
For å sikre den analytiske kvaliteten benytter man kalibratorer for kalibrering av instrumentet,
og analytiske kvalitetskontroller som skal ligge innenfor forhåndsbestemte grenseverdier.
Vedlikehold, kalibrering og kvalitetskontroller utføres av bioingeniører, så det er viktig at det
blir gitt god opplæring samt at det finnes gode rutiner. Analytiske feil kan også skyldes feil på
selve instrumentet. F.eks. det suges ikke opp riktig prøvevolum, slitasjeskader på utstyr som
brukes ofte. Heldigvis finnes det varslingssystemer i instrumentet som varsler ved slike feil
[19].
Da analyseprosessen vil variere over tid kan man aldri være helt sikker på at analyseresultatet
er riktig. Den analytiske usikkerheten kan beregnes for hver analyse. Man skiller mellom to
13
typer analytiske feil, tilfeldige feil og systematiske feil. Det kan alltid oppstå tilfeldige feil ved
en analysering. Det er ikke mulig å eliminere slike feil, men man kan holde dem på et
minimum ved gode rutiner og regelmessig vedlikehold av instrumentet. Det er flere faktorer
som kan bidra til systematiske feil; menneskelige feil, instrumentelle feil, feil i selve analysen,
eller kombinasjoner av disse [19].
Postanalytiske forhold
Postanalytiske forhold er hva som skjer med prøven etter at den er analysert til prøvesvaret
foreligger i pasientens journal. Dette betyr at prøvesvaret ikke må svares ut til rekvirent
dersom det har kommet varsling under analysen som kan ha innvirkning på prøvesvaret.
Tolkning og vurdering av analysesvar ligger og innenfor postanalytiske forhold. Ved bruk av
data og elektroniske svarsystemer minker man menneskelig feil, og dermed postanalytiske feil
[19]. På Klinisk Farmakologi ved UNN Tromsø ser leger over alle resultatene for analysering
av Valproat og kommenterer ved behov.
Verifisering
Verifisering går ut på å dokumentere at en metode fungerer som forventet i eget laboratorium,
hvor det på forhånd er gjort en validering av analysen på eget eller eksternt laboratorium. Ofte
er mange av egenskapene til metoden og metodens kliniske nytte tilfredsstillende validert av
andre (vitenskapelige publikasjoner, produsent, andre laboratorium), og man kan da nøye seg
med å fremskaffe tilfredsstillende informasjon fra denne valideringen. Hvor omfattende
verifiseringen skal være avhenger av flere faktorer [20]:
1. Hvilken type analyse dreier det seg om
2. Hvordan benyttes analysen i klinikken
3. Hvilken dokumentasjon foreligger
Valproat er en farmakologisk analyse, hvor bivirkningene ved for høye serumkonsentrasjoner
kan bli store. Ved lave serumkonsentrasjoner kan pasienten risikere og ikke få ønsket effekt
av medikamentet. Det er derfor viktig at analyseringen av Valproat gir et så nøyaktig bilde
som mulig i øvre og nedre terapeutiske vindu.
14
Analysen er på forhånd validert av Roche på Cobas® 8000. Dette betyr at laboratoriet kun
trenger å verifisere analysen opp mot analyseinstrumentet som er i bruk til daglig, altså
Olympus AU 400.
Interferens
Interferens er systematiske feil som skyldes en substans i prøven, annet enn den som skal
måles. Det finnes flere ulike substanser som kan interferere med analysen (endogene
substanser, hemoglobin, lipider, bilirubin, andre legemidler) [20]. For analysering av Valproat
på Cobas8000 har man satt grensen for ikterus inntil 513μmol/L. Det er ingen interferens ved
L indeks opp til 500 for lipidemi, mens ved hemolyse sees ingen interferens ved
konsentrasjoner opp til 310μmol/L [6]. På Olympus AU 400 har man ikke noen maksimumsverdier for interferens ved analysering av Valproat [15].
Presisjon
”Overensstemmelse mellom avhengige måleresultater oppnådd med en måleprosedyre under angitte betingelser” [20]. Sagt på en annen måte er presisjonen graden av samsvar mellom
verdier fra gjentatte målinger av samme prøve. Dårlig presisjon skyldes tilfeldige feil som:

Dårlig kvalitet på laboratorieutstyr

Mangelfull opplæring (menneskelig feil)

Varierende analysetekninkk (menneskelige feil)

Metodens begrensninger [21]
Det er ikke mulig å sette krav til presisjon basert på biologi, da Valproat ikke finnes naturlig i
kroppen. Kravet for presisjon settes derfor lik analytiske variasjonskoeffisient (CV %) for
Valproat på interne kvalitetskontroller, som er 7,5 % i lavt måleområde og 5,0 % i høyt
måleområde på Olympus AU 400. CV er fastsatt på bakgrunn av laboratoriets erfaring med
metoden, samt medisinsk faglig vurdering av analysenes kliniske nytteverdi og
analysekvalitetens innvirkning på kliniske beslutninger. Dahlbergs metode vil og bli benyttet
for å vurdere innen serie presisjon på begge metodene ved å regne ut ett standardavvik basert
på forskjellen mellom parallellene.
15
Riktighet
”Overensstemmelse mellom gjennomsnittlig verdi fremskaffet fra en stor serie måleresultater
og en sann verdi” [20]. Riktighet kan også sies og være graden av overensstemmelse mellom
gjennomsnittsverdien fra en serie måleresultater av samme prøve, og prøvens sanne verdi.
Dårlig riktighet skyldes systematiske feil som:

Feil kalibrering/kontroller

Feil pipette eller volum

Uriktig oppbevaring av reagenser [21]
I denne oppgaven vil riktigheten bli vurdert ut fra eksterne kvalitetskontroller som tidligere er
analysert på Olympus AU 400.
Statistikk
Resultatene fra forsøket i denne oppgaven tolkes ved hjelp av en statistikk mal fra Norsk
Klinisk-Kjemisk Kvalitetssikring (NKK). Malen presenterer resultatene ved hjelp av fire
ulike statistiske metoder, Passing Babloks, minste kvadraters metode (OLR), Demings vektet
og Demings uvektet. En kort gjennomgang av de ulike statistiske metodene vil derfor bli
beskrevet.
Passing Babloks er en ikke parametrisk metode, der det ikke er noen krav til fordeling i X
eller Y metoden. I denne metoden beregnes alle mulige regresjonslinjer mellom punktene,
hvor man så velger ”den midterste” [19].
OLR er en parametrisk metode, som baserer seg på at den linjen som best representerer alle
punktene (målingene) er den som gir den minste summen av kvadratene av Y-verdienes avvik
(residualer) fra linjen. Metoden går ut fra at usikkerheten kun ligger i Y-metoden, og hvor den
konstant er uavhengig av konsentrasjonen [19].
Demings metode velger den linjen som gir den minste verdien av den korteste avstanden
mellom punktene og linjen. Man antar at usikkerheten ligger i både X – og Y metoden.
Demings uvektet tar ikke hensyn til slengere (verdier som avviker vesentlig fra andre verdier i
16
et datasett), men dette tas hensyn til i Demings vektet. Med vektet regresjon lar man noen
punkter telle mer enn andre [19].
Formelen (sp/se)2 beregner forholdet mellom summen av usikkerhet i metode X og Y og
usikkerheten rundt regresjonslinjen. Sp = usikkerheten rundt regresjonslinjen. Dersom
usikkerheten i metodene er lik usikkerheten rundt regresjonslinjen vil (sp/se)2 = 100 %. Hvis
usikkerheten rundt regresjonslinjen er større enn usikkerheten i metodene vil (sp/se)2 falle.
Når verdien nærmer seg 10 % (og mindre) er det grunn til å tro at noe annet enn usikkerheten
i X og Y er årsaken til usikkerheten rundt regresjonslinjen. Dette kan skyldes årsaker som
f.eks. Ulinjert forhold mellom metodene, forskjellig spesifisitet ol [22].
For å kunne studere instrumentenes repeterbarhet og innen serie presisjon benyttes forskjellen
mellom parallellene for å regne ut standardavviket. Formelen som benyttes er
SD=√(∑(∆x)2/2n), hvor n er antall pasientprøver. Fordelen med å måle repeterbarheten på
denne måten er at standardavviket forteller om spredningen over hele konsentrasjonsområdet
[19].
Korrelasjonskoeffisienten (R) beregnes ved å bruke Pearsons produktmetode (parametrisk
metode). R forteller noe om korrelasjonen mellom to metoder. Jo nærmere R kommer 1, jo
bedre korrelasjon er det mellom de to metodene. R2 forteller noe om sammenhengen mellom
variablene. Usikkerheten i korrelasjonskoefisienten er beskrevet med uttrykket 1-R2. Dermed
kan man si at den porsjonen av resultatene som ikke skyldes usikkerhet, er resten, altså 1-(1R2) = R2 [19].
17
Materiale og Metode
Prøveinnsamling
Valproat er ikke en analyse som utføres ofte, og prøver i rutinen oppbevares i kjøleskap ved 4oC til de analyseres. Deretter plasseres de i fryser ved -20oC til de kastes. Prøvene som ble
benyttet i verifiseringsforsøket var samlet opp på Klinisk Farmakologi over en periode på
rundt 4 uker. Prøvene ble lagret i fryser ved -20oC etter at de var analysert på Olympus AU
400 i rutinen. Prøver som lagres ved -20oC har en holdbarhet på 14 dager [5]. Prøvene var
lagret på ulike type glass, ettersom noen prøver er tilsendte, andre er interne fra UNN Tromsø.
Dette betyr også at prøvevolumet varierte mellom de ulike prøvene. Utvelgelsen av prøvene
ble derfor gjort på grunnlag av prøvevolum og konsentrasjonen av Valproat i prøven.
Konsentrasjonen ble sjekket i Dips før man valgte å gå videre med prøven. Det spilte ingen
rolle hvilket glass prøven var lagret på, eller om prøvene hadde ulikt volum. Dette fordi
prøven ble pippetert over i clinicon og hitachi kopper med et volum på henholdsvis 400µl og
200µl. Dersom noen av prøvene var lagret lenger enn 14 dager ved -20oC vil ikke dette spille
noen rolle for resultatet, da prøven analyseres på begge instrumentene etter at den er gått ut på
dato.
Analysering
Før analysering ble prøvene tint i vannbad ved romtemperatur, blandet godt og sentrifugert.
Alle prøvene visuelt sjekket for utfelling, hemolyse, ikterus eller lipidemi før analyse. Det ble
analysert 40 pasientprøver i duplikater på Olympus AU 400 og Cobas® 8000. Dersom det
var nok prøvematerialet ble prøven pipettert i fire ulike prøveglass (to til Olympus AU 400 og
to til Cobas® 800), slik at analyseringen kunne foregå omentrent samtidig. Dersom det var
begrenset med prøvematerialet ble prøven først analysert på Olympus AU 400, og deretter på
Cobas® 8000. Ved ventetid på Cobas® 8000 ble det satt kort på prøveglassene før de ble satt
i kjøleskap -4oC frem til analysering. Ved Klinisk Farmakologi på UNN Tromsø er ikke
analyseringen av Valproat på Olympus AU400 en akkreditert analyse [15].
Prøvematerialet er serum fra BD Vaccutainer Z rør (serum uten gel) fra BD. Det ble analysert
10 - 15 prøver per dag, dette for å sikre at vi fikk med døgnvariasjon i analysen. Alle prøvene
ble gitt et anonymisert nummer fra 1-40, slik at det ikke var mulig å spore opp pasientdata.
Ideelt sett hadde det vært ønskelig med prøver som dekket konsentrasjonsområdet 018
1000μmol/L godt. Valproat analyseres ikke i stor skala på Klinisk Farmakologi, noe som
setter begrensninger for utvalget av prøver.
For å undersøke presisjonen ble det utført en presisjonssjekk. Det ble valgt rundt 20 prøver fra
de 40 anonymiserte prøvene. Det ble forsøkt å finne prøver i konsentrasjonsområde 100350µmol/L og 400-1000µmol/L. Serumet ble samlet i to «pooler», slik at man hadde en
løsning fra nedre terapeutiske område, og en løsning i øvre terapeutiske område. Fra hver av
løsningene ble det pipettert ut 200µl i 21 prøverør som ble analysert på Cobas® 8000 i serie.
Interne kvalitetskontroller benyttes for å vurdere metodens presisjon. Disse analyseres daglig
på Cobas® 8000 og Olympus AU 400 under valideringsforsøket. Eksterne kvalitetskontroller
benyttes for å vurdere metodens riktighet. Disse er forhåndsanalysert på Olympus AU 400, og
ble analyser på Cobas® 8000 under denne Valideringen.
Sammenlikningsforsøk
Grenseverdier
Det ble satt en nedre og en øvre grenseverdi hvor det var ønskelig at prøvene skulle ligge
innenfor. Olympus AU 400 har et måleområde fra 20,79-1040µmol/L [14], mens Cobas®
8000 har et måleområde fra 19,4-1040µmol/L[6]. I Dips gis svaret for Valproat ut som
<86µmol/L, dersom konsentrasjonen er lavere enn 86µmol/L. Nedre grense var derfor <86
µmol/L, mens øvre verdi begrenset seg selv til 1031µmol/L, da vi ikke hadde prøver med
høyere konsentrasjon enn dette. Terapeutisk serumkonsentrasjon er rapportert til 300600µmol/L, så det var ønskelig at flesteparten av prøvene skulle ligge innenfor dette
intervallet [7].
Reagenser, kontroller og kalibrator
For analysering på Olympus AU400 ble det benyttet samme reagenser og kontroller som
Klinisk Farmakologi bruker i det daglige. For Cobas® 8000 ble det bestilt helt nye reagenser
fra Roche, da dette ikke er en etablert analyse. Det analyseres 3 kontroller for Valproat
19
analysen på Olympus AU400 (Tabell 1), og på Cobas® 8000 hver dag (Tabell 2). På
Olympus AU 400 har man tidligere satt en CV på 7,5 % (TDM1) og 5,0 % (TDM 2 og 3).
Tabell 1: Kontroller benyttet på Olympus AU400 [23].
TDM 1
TDM2
TDM3
Lot. nummer
25751
25752
25753
Range (µmol/L)
140-210
390-650
662-1036
Mean (µmol/L)
175
520
829
TDM 1
TDM 2
TDM 3
Lot. nummer
25751
25752
25753
Range (µmol/L)
126-189
412-618
668-1002
Mean (µmol/L)
157
515
835
Tabell 2: Kontroller benyttet på Cobas® 8000 [23]
Det er verdt å bemerke seg at kontrollene som benyttes på Olympus AU400 og Cobas® 8000
er de samme. I pakningsvedlegget oppgis referanseområdene for ulike instrumenter, altså en
verdi for Olympus AU400 og en verdi for Cobas® 8000. Ved analysering på Cobas® 8000 er
det oppgitt at mean for kontrollene TDM1 og TDM 2 ligger lavere i konsentrasjon enn på
Olympus A 400. For kontroll TDM3 skal Cobas® 8000 gi et høyere svar enn Olympus
AU400.
På Olympus AU400 benytter man en 2-punkts kalibrering (Tabell 3). Dette gir en rett
kalibreringskurve basert på to punkter.
Tabell 3: Lot nummer på kalibrator benyttet på Olympus AU 400
Core TDM multi Calibrator
Lot nummer
59771288
20
På Cobas® 8000 benytter man en 6. punkts kalibratorer for å kalibrere analysen (Tabell 4).
Dette kalles en fullkalibrering og gir en buet kurve basert på 6 ulike punkter.
Tabell 4: Lot nummer på kalibrator benyttet på Cobas® 8000
Preciset TDM
Lot nummer
674 606-01
Reagensen som benyttes på Olympus AU400 er et multireagens som heter Valproic Acid II
Assay. Det hadde lot nummer 59839825 og inneholdt:

EA tilberedningsbuffer: N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N’-[2-ethanesulfonic syre],
stabilisator og konserveringsmiddel (13 mL).

EA reagens: 0,25 g/L enzym akseptor, 24 mg/L monoklonal anti-VPA antistoff, BSA,
Sodium Salicylate, buffer salt, og konserveringsmiddel.

ED tilberedningsbuffer: N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N’-[2-ethanesulfonic syre],
stabilisator og konserveringsmiddel (11 mL)

ED reagens: 40 µg/L enzym donor konjugert til VPA, 2.4 g/L klorofenol rød- -Dgalaktopyranoside, 27 ml/L geit anti-mus antistoff, buffer salter, stabilisatorer og
konserveringsmiddel [14]
Reagensen som benyttes på Cobas® 8000 er et multireagens kalt Valp 2. Det hadde lot
nummer 661640-01 og inneholdt:

Reagens 1: Anti-Valproat syre antistoff (monoklonalt fra mus), G6P, NAD og bovint
serum albumin i buffer

Reagens 3: Valproat syre merket med bakteriellt G6PDH, og bovint serum albumin i
buffer [6]. Type buffer og pH var ikke oppgitt i pakningsvedlegget.
21
Resultat
Sammenlikningsforsøk
Det ble benyttet en statistikk mal fra NKK, som gir resultater ved hjelp av fire ulike statistiske
metoder.
Statistikken videre i oppgaven er basert på Demings vektet (forutenom beregning av R og R2).
Dette fordi vi anser utvalget av prøver til å være nær gauss fordelt, ved vurdering av
histogram, kurtose, skjevhet, median og middelverdi (ikke vist i oppgaven). Demings vektet
tar også utgangspunkt i at det er usikkerhet i begge analysene, samt vektlegger slengere.
Bias mellom enhetene
Resultatene for de 40 prøvene som ble analysert på Cobas® 8000 og Olympus AU 400 i
paralleller presenteres i vedlegg 1 (Olympus AU400 vises som metode Y, mens Cobas® 8000
vises som metode X). Vedlegget viser og gjennomsnittet for de to parallellene for hver
analysemetode.
Resultatene i vedlegg 1 gir ved Demings vektet regresjon: Y = 0,9611x – 11,04.
Spredningsdiagrammet i Figur 3 viser resultatene for analyseringen av Valproat på Olympus
AU 400 (Y-aksen) og Cobas® 8000 (X-aksen). Y = 0,9611x – 11,04. Ved beregning av R og
R2, ble resultatene som følgende; R=0,945, R2=0,976
22
Spredningsdiagram
Olympus AU400 (µmol/L)
1200
1000
800
600
Deming, vektet
400
200
0
0
200
400
600
800
1000
1200
Cobas ® 8000 (µmol/L)
Figur 3: Spredningsdiagram for analyse av Valproat på Olympus AU 400 (Y-aksen) og
Cobas® 8000 (X-aksen).
Ved å benytte likningen Y = 0,9611x – 11,04 ser man at i nedre terapeutisk området
(300µmol/L) vil Cobas® 8000 gjennomsnittelig gi et svar på Y=0,9611*300-11,04 =
277µmol/L. Dette er 7,6 % lavere enn svaret ville vært på Olympus AU400. I øvre
terapeutiske område (600µmol/L) vil Cobas® 8000 gi Y = 0,9611*600-11,04 = 566 µmol/L.
Dette svaret er 5,7 % lavere enn det ville vært på Olympus AU400.
Ved å benytte malen fra NKK (vedlegg 1) fikk analysen en (sp/se)2 = 53 %
Et differansediagram for Olympus AU 400 og Cobas® 800 er presentert i figur 4.
23
Differansediagram Valproat
Olympus - Cobas (µmol/L)
100
80
60
40
20
0
-20 0
200
400
600
800
1000
-40
-60
-80
(Olympus +Cobas) / 2 (µmol/L)
Figur 4: Differansediagram for Valproat ved analysering av 40 prøver i duplikat på Olympus
AU 400 og Cobas® 8000. Figuren viser at for 34 av de 40 prøvene gir Olympus AU 400
høyere svar enn på Cobas® 8000. Spredningen mellom instrumentene ved konsentrasjonene
400-500 µmol/L er stor. På det meste varierer det med ca 80μmol/L.
24
Presisjon
Mellom serie presisjon
Resultatene for interne kontroller er vist i tabell 5.
Tabell 5: Mean og CV for interne kontroller analysert på Olympus AU400 og Cobas® 8000.
Olympus AU400
Mean
Tillatt
(µmol/L)
CV
(%)
TDM1
Cobas® 8000
CV
Target
(%)
Mean
CV
(µmol/L)
(%)
Target
178
7,5
6,6
175
TDM1 (n= 5)
159
1,4
157
562
5,0
4,5
520
TDM2 (n=5)
516
4,5
515
894
5,0
4,3
829
TDM3 (n=5)
817
6,9
835
(n=76)
TDM2
(n=78)
TDM3
(n=77)
Innen serie presisjon
Resultatene for presisjonssjekk på Cobas® 8000 er vist i Tabell 6.
Tabell 6: Resultatene for presisjonssjekk på Cobas® 8000 ved mean 322µmol/L og
514µmol/L, n = 21
CV
Mean 322 µmol/L
Mean 514 µmol/L
4,7 %
3,3 %
25
På bakgrunn av målingen av 40 pasientprøver i paralleller benyttes formelen
SD=√(∑(∆x)2/2n) for å regne ut standardavviket. Dette vil gi et bilde på innen serie presisjon
og repeterbarheten for begge instrumentene. Formelen gir Olympus AU400 et standardavvik
på 15µmol/L, mens Cobas® 8000 har et standardavvik på 24µmol/L.
Riktighet
Tabell 7: Resultatene for eksterne kontroller analysert på Olympus AU400 og Cobas® 8000.
Target, mean og tillatt konsentrasjonsområde er oppgitt fra LoGiCal® (LGC) som leverer
eksterne kontroller. * holdbarhet utgått ved analysering.
Cobas®
Olympus Mean
Tillatt
8000
AU 400
konsentrasjonsområde
112-TD2A (µmol/L)
227 *
284
287
217 – 378
112-TD2B (µmol/L)
274 *
352
363
265 – 430
113-TD2B (µmol/L)
452 *
449
483
369 – 572
Tillat konsentrasjonsområde er bredt da det er felles for alle metodene som har analysert de
eksterne kontrollene.
Diskusjon
I løpet av en verifisering er der en fordel å kalibrere flere ganger, slik at man kan være sikrere
på at kalibreringskurven er riktig. Det er og en fordel å benytte reagenser fra flere ulike lot.
nummer, slik at reagensene ikke er en kilde til feil.
Spredningsdiagrammet (Figur 3) viser god korrelasjon mellom analysen på Olympus AU 400
og Cobas® 8000. Utregnet R verdi viser 0,945. Jo nærmere R kommer 1, jo bedre korrelasjon
er det mellom analysene. R2 forteller noe om usikkerheten, og R2=0,975. Dette betyr at 2,5 %
26
av resultatene (1-R2 i %) skyldes usikkerhet, mens resten (97,5 %) viser en direkte
sammenheng mellom de to variablene. Det som er viktig å tenke på i tolkningen av R og R2,
er at Olympus AU 400 ikke er uten usikkerhet, noe R og R2 tar utgangspunkt i, ettersom de er
beregnet på bakgrunn av Pearsons produktmetode hvor Olympus AU400 ble satt som
metoden uten usikkerhet. Dette ble gjort fordi det er Olympus AU400 som benyttes i den
daglige analyseringen av Valproat og det er dette instrumentet man ønsker å erstatte.
Likningen Y = 0,9611x – 11,04 viser at Cobas® 8000 i gjennomsnitt gir 7,6 % lavere svar
enn Olympus AU 400 i nedre terapeutiske området. I øvre terapeutiske område gir Cobas®
8000 5,6 % lavere svar enn Olympus AU 400.
Da Valproat har en metningskinetikk fra 650µmol/L vil avvik i dette området være særlig
interessante. Ut fra samtale med Overlege Georg Sager på Klinisk Farmakologi ved UNN, ble
det bestemt at et resultat på 565µmol/L på Cobas® 8000 (vs 600µmol/L på Olympus AU400)
var akseptabelt fra et medisinsk ståsted. Akseptabel CV i øvre terapeutiske område var satt til
5,0 % på Olympus AU400 (tabell 5). Nå man ut fra likningen Y=0,9611x-11,04 ser at
Cobas® 8000 i gjennomsnitt gir 5,7 % lavere svar i øvre terapeutiske område, kan dette tyde
på at fra et statistisk ståsted er forskjellen mellom Olympus AU400 og Cobas® 8000 for stor.
(sp/se)2 = 53 %. Dette betyr at det er lite sannsynlig at usikkerheten rundt regresjonslinjen
skyldes noe annet enn selve usikkerheten i hver av metodene, og det kan aksepteres.
Differansediagrammet i figur 4 viser at det er stor spredning mellom målte verdier, særlig i
konsentrasjonsområde 400-500µmol/L. Diagrammet viser at i dette konsentrasjonsområde
kan analyseresultatet variere med opp til 80μmol/L. Diagrammet viser også at i området rundt
0-350µmol/L gir Olympus AU 400 høyere svar enn Cobas® 8000. Fra rundt 400-650umol/L
gir fire av prøvene høyest svar på Cobas® 8000, men de fleste prøvene i dette området fikk en
høyere verdi når de var analysert på Olympus AU 400. Det var bare to prøver i området over
650µmol/L hvor den ene ga høyest svar på Olympus AU 400, mens den andre ga høyest svar
på Cobas® 8000. Det er derfor vanskelig å si noe om målingene i dette området. Ut fra
kontrollene (tabell 1 og 2) forventer man at Olympus AU 400 skal gi høyest svar i nedre
terapeutiske område, og at metodene skal gi omtrent likt svar i midtre område. Man forventer
så at Cobas® 8000 skal gi høyere svar enn Olympus AU 400 i øvre terapeutiske område. Ut
fra figur 4 stemmer ikke dette med forventningene, da man for det meste får høyere svar ved
27
analysering på Olympus AU 400 enn ved analysering på Cobas® 8000 i området 01000µmol/L.
Presisjon
Mellom serie presisjon
Mellom serie presisjon er studert ved hjelp av interne kontroller (Tabell 5).
CV ved TDM1 er 1,4 % på Cobas® 8000 og 6,6 % på Olympus AU 400. Den tillatte CV i
dette området er 7,5 %, så Cobas® 8000 ligger godt under tillat CV, noe som indikerer god
presisjon på Cobas® 8000.
TDM2 er på 4,5 % både på Olympus AU 400 og Cobas® 8000, hvor begge er innenfor tillat
CV på 5 %. Dette indikerer at det er like god presisjon på Cobas® 8000 som på Olympus AU
400.
TDM3 har en CV på 4,3 % på Olympus AU 400, men en CV på 6,9 % på Cobas® 8000. Den
tillatte CV er 5 %, noe som betyr at Cobas® 8000 ikke har en tilfredsstillende CV i det høye
måleområdet.
Under analyseperioden ble analysen kalibrert to ganger. Høy kontroll falt utenfor tillatte
grenser en av dagene, det ble kalibrert og kontrollen analysert på nytt. Etter kalibrering var
kontrollen fortsatt utenfor tillatt konsentrasjonsområde. Da det var lite reagens igjen av
kontrollen ble det benyttet ny kontrollreagens. Høy kontroll falt da fra 964,4 µmol/L til
762,6µmol/L. Dette kan bety at kontrollene for Valproat har en kort holdbarhet, eller at man
ikke burde benytte kontroll reagenset når volumet i flasken begynner å bli lavt. Denne
oppdagelsen kan ha konsekvenser for den høye kontrollen analysert dagen før, som ga et
resultat på 907,3 µmol/L. Det er mulig at dette resultatet er høyt som følge av dårlig
holdbarhet/lite volum på kontroll reagenset. Denne verdien vil også gi utslag i den høye CV`n
for TDM3 kontrollen (tabell 5).
Tabellen viser også at Olympus AU 400 måler en høyere verdi enn target for alle tre
kontrollene. Resultatet baserer seg på godt over 70 målinger, så dette indikerer at Olympus
AU 400 konsekvent måler høyere verdier enn target. Dersom man ser på resultatene for
28
målingene på Cobas® 8000 ser man at i lavt og midtre område (TMD1 og TDM2) har
Cobas® 8000 fått verdier som er ganske nærme target. I øvre område måler Cobas® 8000 litt
høyere enn target. Da målingene kun baserer seg på fem målinger (n=5) kan man ikke stole
fullt på resultatet. Det gir allikevel en pekepinne på at Cobas® 8000 gir verdier likt target i
lavt og middels måleområde. Når resultatene fra målingene av 40 pasientprøver (vedlegg 1)
viser at Olympus AU400 generelt gir høyere resultater enn Cobas® 8000 kan dette muligens
forklares ved at resultatene i tabell 5. Dersom Olympus AU400 konsekvent måler over target
vil dette gi resultater hvor det ser ut som Cobas® 8000 måler for lave verdier, når det faktisk
er Olympus AU400 som måler for høye verdier. Dette kan bety at Cobas® 8000 faktisk måler
en ”sannere” verdi enn Olympus AU400. Innen serie presisjon
Innen - serie presisjon for Cobas® 8000 er studert ved hjelp av en presisjonssjekk (Tabell 6).
Den viser en CV på 4,8 % ved mean 332µmol/L, og en CV på 3,3 % ved mean 514µmol/L.
Siden analysen av Valproat er en enzymatisk analyse ved bruk av antistoffer, vil man kunne
tillate en høyere CV enn ved andre analyser. Som forventet er CV lavere i høyt måleområde
enn i lavt måleområde. Dette kommer av at en liten endring i lavt måleområde vil føre til en
stor endring i %. De to måleområdene i presisjonssjekken (332µmol/L og 514 µmol/L) ble
valgt ut på bakgrunn av terapeutisk konsentrasjonsområde for Valproat, samt hvilke prøver vi
hadde tilgjengelig. Ideelt sett kunne det høye måleområdet (514µmol/L) vært ennå høyere –
opp mot 600µmol/L, men på bakgrunn av prøvematerialet tilgjengelig var ikke dette mulig.
Innen serie presisjon og repeterbarhet ble studert ved å benytte forskjellen mellom
parallellene for beregning av standardavvik (SD=√(∑(∆x)2/2n). Dette ga et standardavvik på
15µmol/L på Olympus AU400 og et standardavvik på 24µmol/L på Cobas® 8000. Dette
forteller at repeterbarheten og innen serie presisjon er bedre for Olympus AU400. Cobas®
8000 har nesten dobbelt så høyt standardavvik som Olympus AU400.
Riktighet
Eksterne kontroller har en holdbarhet på 1uke i kjøleskap og 4uker i fryseren [15].
Kontrollene med prefiks 112 og 113 ble løst opp henholdsvis 08.02.2013 og 07.03.2013, og
29
sannsynligvis fryst ned samme dag. Holdbarheten for disse kontrollene vil derfor være gått ut,
noe som kan ha innflytelse på resultatet.
Tabell 7 viser resultatene for analyseringen av de eksterne kontrollene. De var analysert på
Olympus AU400 før verifiseringsforsøket startet, og pga. lite prøvevolum ble de kun
analysert på Cobas® 8000. Tabellen viser at alle tre kontrollene analysert på Cobas® 8000
ligger innenfor tillatt konsentrasjonsområde, men at alle ligger et stykke under target. Da
kontrollene var gått ut av dato ved analysetidspunktet er det vanskelig å trekke noen
konklusjon fra resultatene. Ser man derimot på resultatene fra Olympus AU400 vise de at for
112-TD2A og 112-TD2B har Olympus AU400 målt verdier som ligger ganske nær (men
under) target. Olympus AU400 måler også lavere enn target for 113-TD2B. Dette motsir
resultatene fra de interne kontrollene (tabell 5), hvor det kunne se ut som om Olympus AU400
generelt målte verdier høyere enn target.
Konklusjon
Resultatet fra sammenlikningsforsøket viser at Cobas® 8000 i gjennomsnitt gir et lavere
analyseresultat enn Olympus AU 400. Ut fra samtale med Overlege Georg Sager ble vi enige
om at resultatene fra sammenlikningsforsøket indikerer at man kan benytte Cobas® 8000 for
analysering av Valproat – fra et medisinsk ståsted.
Det anbefales allikevel flere analyser for å studere riktigheten og mellom serie presisjon til
Cobas® 8000. De eksterne kontrollene var ikke tilfredsstillende til vurderingen av riktighet
pga holdbarhet, mens de interne kontrollene var analysert for få ganger (n=5).
Basert på Dahlbergs metode viser Cobas® 8000 dårligere innen serie presisjonen enn
Olympus AU400. Ved hjelp av en presisjonssjekk fikk Cobas® 8000 en CV på 4,7 % ved
mean 322µmol/L, og en CV på 3,3 % ved mean 514µmol/L. Dette viser en høy CV for
Cobas® 8000 i presisjonssjekken og indikerer dårlig innen serie presisjon.
Resultatene bør vurderes nøye av nøkkelpersoner på Medisinsk Biokjemi, for å se om
Cobas® 8000 er tilfredsstillende nok i forholdt til Olympus AU400. Vurderingen bør også ta
hensyn til om det er mulig å senke kravene for analysen, slik at man har muligheten til å
analysere Valproat hele døgnet.
30
Litteratur
1.
Burgeosis, B.F.D., The treatment of Epilepsy. 3 ed. 2009: Blackwell Publishing Ltd.
2.
Mccandless, P. Valproate Lawsuit Investigation: Migraine Drug Used in Pregnancy
Lowers Child’s IQ. 2013; Available from:
http://www.girardgibbs.com/blog/valproate-lawsuit-investigation-migraine-drug-usedin-pregnancy-lowers-childs-iq/.
3.
U.S. National Library of Medicine, N.I.o.H., U.S. Department of Health & Human
Services Valproate. 2013; Available from: http://livertox.nlm.nih.gov/Valproate.htm.
4.
Universitetssykehus, A. Valproat. 2013; Available from:
http://old.ahus.no/eqs/labhbok/docs/doc_1684/index.html.
5.
Norge, U.i.N. Valproat i Serum. 2004; Available from:
http://www.unn.no/laboratoriehaandbok/valproat-i-serum-article17570-14289.html.
6.
Diagnostics, R., Valp2. 2012, Roche. p. 4.
7.
Legemiddelhåndbok, N. Valproat. 2012; Available from:
http://legemiddelhandboka.no/Legemidler/57108.
8.
Carol. T. Walsh, R.D.S.-B., Levines Pharmacology. 7 ed. 2007: Informa Health Care.
9.
DrugBank. Valproic Acid. 2013; Available from:
http://www.drugbank.ca/drugs/DB00313.
10.
Sager, G., Bacheloroppgave Valproat H.M. Hansen, Editor. 2013: Tromsø.
11.
Legemiddelhåndbok, N. Farmakodynamikk. 2012; Available from:
http://legemiddelhandboka.no/Generelle/88363.
12.
Solutions, A.B. Olympus AU 400 & AU400e Chemistry Immuno Analyzer. 2011;
Available from: http://absbiomedical.com/Olympus_AU400.htm.
13.
Olympus. Medisinske Systemer. 2013; Available from:
http://www.olympus.no/medical/en/medical_systems/startpage.jsp.
14.
Microgenics, CEDIA Valproic Acid II Assay. 2003.
15.
Hårek Sørensen, B., Klinisk Farmakologi UNN, Tromsø, Valproat, H.M. Hansen,
Editor. 2013, Hege Marie Hansen: Tromsø.
16.
Unknown, How CEDIA works. Unjnown, Klinisk Farmakologi: Tromsø.
17.
Roche. Cobas® 8000 modular analyzer series. 2013; Available from:
http://www.roche.com/products/product-details.htm?type=product&id=137.
18.
M.Cox, D.L.N.a.M., Principles of Biochemistry, ed. 3. 2000: Lehninger.
19.
Thoresen, T.S., Statistikk for laboratoriet. Vol. 1. 2008, Tromsø: Eureka Forlag.
20.
Kvalitetskontroll, N.K.-K., Validering/verifisering av klinisk kjemiske analyser. 2002,
Norsk klinisk kjemisk kvalitetskontroll. p. 18.
21.
Noklus, Presisjon og riktighet. 2010.
31
22.
Rørstad, S., Statistikk (sp/se)2, H.M. Hansen, Editor. 2013: Tromsø.
23.
Rad, B., Liquichek Therapautic Drug Monitoring (TDM). 2011, Bio Rad.
32
Vedlegg 1 – Mal fra NKK
Analyse:
Valproat Cobas® 8000
Dato:
15.04.2013
Passing &
Bablok
Regresjonsmetode
OLR
Deming, uvektet
Stigningstall med 95 % CI
1,0258
0,9792
1,0866
Skjæringspunkt med 95 %
CI
- -68,168
-66,893
-40,774 -14,655
37,505 -11,222
se
0,9678
1,0950
Lineær (p>0.10)

uxuy 
Nivå 1
300
Nivå 2
600
Antall
160
Middelverdi/standard avvik
sp/CVp for paralleller
Akseparallell
1
1
2
2
3
3
2
4
3
5
2
6
3
7
4
8
457,81
40
166,6
1
14,994 3,3 %
0
27,595 6,0 %
0
30,89
21,01
29,75
22,00
40
1,0329
40
432,11
-43,13
-18,65
-32,69
-9,34
1,0406
0,9611
0,9291
0,9931
-44,280
-86,648
-1,912
-11,037
-21,772
-0,303
Foreslå
tt
0,39
32,10
19,92
Brukt
Foreslått
Brukt
0,35
-46,19
-18,02
-22,72
-28,61
-16,82
-40,42
0,58
-34,40
-46,18
-22,61
Konst.
vekt
40
174,2
4
23,976 5,5 %
Deming, vektet
0,9401
1,1411
SANN
x
(sp/se)
=
2
x1
436
433
401
658
323
659
559
409
x2
422
418
382
637
315
660
551
414
y1
406
413
394
604
308
631
480
355
y2
437
412
393
633
296
607
522
408
429
425,5
391,5
647,5
319
659,5
555
411,5
y
421,5
412,5
393,5
618,5
302
619
501
381,5
3
2
9
10
333
666
321
633
280
626
304
662
327
649,5
292
644
1
11
305
275
279
265
290
272,05
0
12
401
420
323
379
410,6
351,25
-1
13
412
389
342
325
400,75
333,2
0
14
479
500
402
421
489,45
411,35
-1
0
1
15
16
17
229
393
532
233
390
472
187
373
454
221
344
461
231,15
391,2
501,65
203,85
358,45
457,6
0
18
362
353
328
342
357,65
334,9
1
2
3
19
20
21
34
392
473
44
393
496
25
346
424
31
366
492
38,85
392,4
484,85
28,1
355,7
458
4
3
22
23
560
301
558
297
457
256
515
252
558,55
299,1
486,05
254,05
Slenger>
53 %
4
0,0247
y-x
-7,5
-13
2
-29
-17
-40,5
-54
-30
(y-x)/x
-1,7 %
-3,1 %
0,5 %
-4,5 %
-5,3 %
-6,1 %
-9,7 %
-7,3 %
-10,7
-35
%
-5,5 -0,8 %
-17,95 -6,2 %
-14,5
-59,35
%
-16,9
-67,55
%
-16,0
-78,1
%
-11,8
-27,3
%
-32,75 -8,4 %
-44,05 -8,8 %
-22,75 -6,4 %
-27,7
-10,75
%
-36,7 -9,4 %
-26,85 -5,5 %
-13,0
-72,5
%
-45,05
-15,1
Vedlegg 1 – Mal fra NKK
2
24
607
607
578
638
606,6
608,1
1,5
1
0
-1
-2
-3
-4
-5
25
26
27
28
29
30
31
562
647
783
913
533
395
561
589
657
790
904
572
404
552
465
664
772
1031
497
392
521
531
656
767
929
507
366
552
575,5
652,05
786,5
908,4
552,4
399,65
556,25
498,15
659,7
769,35
980,05
502,05
379,25
536,3
-77,35
7,65
-17,15
71,65
-50,35
-20,4
-19,95
-4
32
397
387
344
353
391,8
348,6
-43,2
-3
-2
-3
-4
-3
-2
-1
0
33
34
35
36
37
38
39
40
60
387
501
559
404
368
418
484
59
379
551
524
414
394
458
485
49
373
509
555
399
369
440
436
37
338
494
559
405
372
436
456
59,3
382,7
525,65
541,55
408,9
381,15
438,1
484,65
43,1
355,05
501,4
557,05
402,25
370,55
437,6
445,95
-16,2
-27,65
-24,25
15,5
-6,65
-10,6
-0,5
-38,7
%
0,2 %
-13,4
%
1,2 %
-2,2 %
7,9 %
-9,1 %
-5,1 %
-3,6 %
-11,0
%
-27,3
%
-7,2 %
-4,6 %
2,9 %
-1,6 %
-2,8 %
-0,1 %
-8,0 %