Transcript Hvordan hemolyse virker inn på testen a

Det helsevitenskapelige fakultet
Institutt for medisinsk biologi
Hvordan hemolyse virker inn
på testen a-tissue
transglutaminase IgA
Avsluttende Bacheloroppgave for Bioingeniør studenter
kull 11
30.05.2014
Norges Arktiske Universitet, Tromsø
Kandidat nummer 8 og 4
Innholdsfortegnelse:
1.0 Sammendrag av oppgaven........................................................s.3
2.0 Innledning.....................................................................................s.4
3.0 Teori om cøliaki............................................................................s.5-10
3.1 Cellulære mekanismer.........................................................................s.5-7
3.2 Vevstransglutaminase..........................................................................s.7-9
3.3 Hemolyse interferens med deteksjon av a-tTG.................................s.9-10
4.0 Materiale og metode......................................................................s.11-19
4.1 Materiale................................................................................................s.11-12
4.2 Instrument.............................................................................................s.12-13
4.3 ELISA....................................................................................................s.13-15
4.4 Kalibrering, kontroller og reagens......................................................s.15-17
4.5 Statistikk.................................................................................................s.17-18
4.6 Fremgangsmåte......................................................................................s.18-19
5.0 Resultater.........................................................................................s.20-26
5.1 Kalibrering, kurvekontroll og kontroller.............................................s.20-22
5.2 Hemolysegrader......................................................................................s.22-23
5.3 Resultater forsøk....................................................................................s.23-26
6.0 Diskusjon..........................................................................................s.27-29
7.0 Konklusjon.......................................................................................s.30
8.0 Referanseliste...................................................................................s.31-33
1
Forkortelser
t-TG
Tissue transglutaminase
TG2
Transglutaminase type 2
CD
Cluster of differensiation
RBC
Erytrocytter
GTP
Guanosine-5’-triphosphate
GDP
Guanosine-5’-diphosphate
HB
Hemolysert blod
HLA-molekyler
Human leukocytt antigen
ELISA
En enzym-linked immunosorbent assay
IgA
Immunoglobulin A
IgG
Immunoglobulin G
2
1.0 Sammendrag av oppgaven
I denne oppgaven ser vi på hvordan hemolyse innvirker for metoden anti-tissue
transglutaminase IgA. Vi begynner med en kort innledning, etterfulgt av teori om cøliaki med
fokus på de cellulære mekanismene ved sykdommen. Deretter sier vi litt om
vevstransglutaminase og deres betydning for cøliaki. Vi har også litt teori om hemolyse, hva
som forårsaker dette og konsekvenser hemolyse kan ha for prøvesvar. Så presenterer vi
hvilken metode og hvilket materiale vi har brukt for våre forsøk og hvordan vi utførte
forsøkene. Så blir resultatene presentert, etterfulgt av en diskusjon rundt dette. Til sist har vi
en konklusjon ut fra våre forsøk.
3
2.0 INNLEDNING
Vi gjennomførte vår bacheloroppgave i forbindelse med avsluttende bioingeniørutdannelse
ved Universitet i Tromsø. Oppgaven er rettet mot personer med laboratoriemedisinsk
bakgrunn og som har interesse for fagområdet. Vi har i denne oppgaven undersøkt om ulik
hemolyse grad har innvirkning på testen a- tissue transglutaminase IgA. Dette har ikke blitt
undersøkt i stor grad tidligere, dermed kan man ikke være sikker på om hemolyse vil ha
innvirkning på prøvesvar for denne metoden. I oppgaven har vi presentert relevant teori,
materiale og metode, resultater, diskusjon og konklusjon. Forsøkene ble utført på
Universitetssykehuset i Nord Norge ved immunologisk seksjon på laboratoriemedisinsk
avdeling. Veileder for førsøket var Ann Karin Lien og skrive veileder var Mette Kjær.
4
3.0Teori om cøliaki
3.1 Cellulære mekanismer
Cøliaki er en kronisk betennelsessykdom i tarm forårsaket av en overfølsomhet for gluten.
Gluten er et lagringsprotein og kan deles inn i to hovedgrupper: gliadiner og glutiner. Begge
proteiner er rike på aminosyrene glutamin og prolin. Cøliakere har intoleranse for gliadiner og
antakelig også gluteniner. Disse proteinene finnes i hvete, rug og i andre kornarter.[1] Men
det er ikke selve glutenproteinene som er sykdomsfremkallende, men ulike antigenfraksjoner i
glutenproteinet; prolaminfraksjoner. Både hvete, rug, bygg og havre inneholder
prolaminfraksjoner; hvete inneholder gliadin; rug secalin; bygg hordein (og havre avenin).
Disse fraksjonene fremkaller immunrespons, ødelegger tarmtottene og reduserer absorbsjon
av næringsstoffer.[2]
I hvetegenomet er det et stort antall gener som koder for gliadiner og gluteniner. I en enkelt
hvetesort finnes det over hundre forskjellige gliadin proteiner som likner svært på hverandre,
men som har litt forskjellig aminosyresekvens.[1]
Sykdommen har multifaktorell etiologi, dvs. det er flere gener, i tillegg til miljøfaktorer, som
spiller en rolle for utvikling av sykdommen. Gluten er en slik miljøfaktor.[1]
Videre har cøliaki en sterk assosiasjon til spesielle varianter av HLA- molekyler. Det er
beregnet at HLA bidrar med ca. halvparten av de genetiske komponentene. [3]
HLA- molekyler eller vevstypeantigener, er spesialiserte molekyler som binder
antigenfragmenter og presenterer dem for T- celler. Genene som er hovedansvarlig for HLAassosiasjonen, ble identifisert for ti år siden. De fleste med cøliaki i Norge er bærere av HLA
klasse II molekyler med- haplotypene DR3- DQ2 eller- DQ8. Disse molekylene er
heterodimere av α- og β- kjeder som kodes av gener i HLA- gen komplekset på kromosom
6.[4,5]
Når tarmen utsettes for gluten så akkumuleres cytotoksiske CD8- positive T- lymfocytter i
overflateepitel, og CD4- positive celler i lamina propria i tarmen. CD8- positive celler er ikke
spesifikke for gliadin, men har NK- assosiert reseptor, som reagerer på stress-induserte
molekyler på epiteloverflate. Gliadin utløser stress på CD8-positive celler og medierer skader
av epitelceller. CD4-positive celler responderer på gliadin presentert av HLA- molekyler på
antigen-presenterte celler. CD4- positive celler vil videre aktivere vevsmakrofager som
sekretere proinflammatoriske cytokiner å gi betennelsen i tarmen. [6]
5
Sykdommen kan gi tynntarmskader i slimhinneoverflaten og viser nesten alltid totteatrofi.
Betennelsen er hovedsakelig lokalisert i tarmmucosa og duodenum og i den proksimale del av
jejunum.
I en fullt utviklet lesjon ved cøliaki ser man total atrofi av tarmtottene, forstørrete
hyperplastiske krypter, og økt tetthet av forskjellige leukocytter (plasmaceller, makrofager,
dendriske celler og T- celler) i lamina propria.[3] Økt infiltrasjon av T- cellene i epitelet er
den morfologiske forandringen som kommer først. Disse forandringene og aktivering av
CD4- positive celler er illustrert i figur 1.
Figur1. Tynntarmslesjonen ved cøliaki. Skjematisk fremstilling av tarmmucosa, med spesielt vekt på faktorer
som er av betydning for utvikling av cøliaki. Glutenpeptider blir deamidert av vevstransglutaminase. CD4positive T-celler gjenkjenner med sine cellereseptorer deamiderte glutenpeptider bundet til HLA-DQ2 eller
HLA-DQ8 molekyler på antigenpresenterende celler (APC). Bildet oppe til høyre viser
immunfluorescensfarging av vevstransglutaminase (rød), HLA-DQ celler (grønn) og T-celler (blå) tatt fra en
tynntarmsbiopsi fra pasient med ubehandlet cøliaki. [7]
Cøliaki er videre tett forbundet med produksjon av autoantistoffer som er spesifikke for
enzymet transglutaminase 2 (t- TG 2)
Autoantistoffer IgA mot enzymet transglutaminase 2(t- TG) er et kjennetegn på glutensensitiv cøliaki. Denne patogenesen er drevet av CD4+T- celler som reagerer med
glutenliknende peptider når de presenteres på sykdomsassosierte HLA- molekyler; HLADQ2 og DQ8. Disse molekylene presenterer glutenpeptider i tarmen til T- celler. Så lenge det
er gluten-peptider til stede i tarmen vil kroppen produsere antistoffer av type IgA mot
enzymet.(8,9)
Disse kompleksene av IgA og Tg2 kan påvises ved immunhistokjemiske undersøkelser av
tynntarmbiopsier (Figur 3), selv hos dem som ikke har påvisbare autoantistoffer i blodet.[10]
6
Figur 2. Påvisning av immunkomplekser av IgA(grønn) med transglutaminase TG 2 som er samlokalisert og
vises ved ubehandlet cøliaki.[10]
IgA og IgG- antistoffer mot t-TG 2 regnes som en pålitelig faktor for diagnostikk av
ubehandlet cøliaki. IgG er mindre spesifikt for sykdommen, men vil fungere som en hjelpende
markør for pasienter med IgA mangel. IgG og IgA antistoffer mot t-TG 2 kan påvises hos 8090 % av de med ubehandlet sykdom, det vil si at noen av pasienter som har lidelsen vil ikke
ha anti- tTG blodet.[11,12]
I tillegg til IgA- og IgG-antistoffer vil økt antall av intraepiteale T- celler med gamma- delta T- cellereseptor være typisk for cøliaki og kan brukes som et diagnostisk hjelpemiddel.[13]
3.2 Vevtransglutaminase (t-TG)
Begrepet t- TG- transglutaminase ble først utarbeidet av Waelsch og hans medarbeidere i
1959. Tissue transglutaminase (t-TG) er kalsium avhengige enzymer av protein- glutamin !glutamintransferase familien [14,15,16].
t- TG-2 genet er lokalisert på kromosom 20q 11-12[1] og proteinet består av 687 aminosyrer
og har en molekylær vekt på 77,3kDa [16,17].
Det har blitt identifisert ni medlemmer som hører til transglutaminase familien. t- TG
kryssbinder proteiner mellom "- aminogruppen i lysin og en !-karboksamid gruppe i
glutamin, noe som skaper et inter- eller intramolekylært bånd som er svært motstandsdyktig
mot proteolyse (proteinnedbrytning).[17] Kryssbindingsaktivitet av t-TG-2 krever binding av
Ca2+- ioner[16].
7
Bortsett fra sin tverrbindingsfunksjon, katalyserer t- TG andre typer reaksjoner som
deamidering, GTP- binding og isopeptidase aktiviteter.[14]Bindingen av GTP eller GDP
hemmer tverrbindingsaktivitet av enzymet. Derfor er det meste inaktive intracellulært på
grunn av den relativt høye konsentrasjonen av GTP/ GDP og de lave nivåene av Ca2+.
t- TG-2 er mest uttrykt i RBC- erytrocytt – membraner, lever og milt, og tjener som en viktig
komponent av erytrocytt skjelettnettverk og oppretter erytrocytt form og mekaniske
egenskaper.[18,19]
Deamiderings reaksjonen består av deaminering av sidekjeder i glutamin og det resulterer i en
oppregulering av bindingskapasitet for gluten til DQ 2 og responsen av T- cellene. Nedbrutte
proteiner (gliadiner) deamideres av transglutaminase, ved hjelp av Ca 2+ og lav pH i tarmen,
se figur 3.
Deamidering av gluten induserer toksisitet og immunrespons i tarmslimhinnen[20].
Figur 3. Deamidering av gliadin- protein.[21]
Transglutaminasene er vanligvis intracellulært og frigjøres fra celler ved skade.
t- TG- 2 har også andre enzymatiske aktiviteter som er uavhengige av Ca2+. Disse
Ca2+uavhengige aktiviteter av t-TG-2 er involvert i mange kritiske fysiologiske prosesser som
ligger bak mange viktige aspekter ved celleadferd, inkludert celleadhesjon, vekst og apoptose
(programmert celledød). t-TG-2 deltar også i sårheling og reparasjon av vev.[22]
I motsetning til andre medlemmer av TG- familien, finnes t-TG- 2 både i det intracellulære og
ekstracellulære område av ulike typer vev. Intracellulær er det rikelig med t-TG-2 i cytosol,
men mindre mengder kan også finnes i kjernen og mitokondriene.[15]
8
I autoimmune sykdommer som cøliaki, er tilstedeværelsen av autoantistoffer IgA og IgGklasse mot t- TG-2 en indikator på at t- TG-2 kan binde potensielle autoantistoffer til seg selv
og utløse en immunologisk respons.[23]
Videre spiller t-TG-2 en sentral rolle både på sekresjon av granuler og makrofagfunksjon og
ved å regulere funksjon av de sentrale mediatorer.[24]
3.3 Hemolyse interferens med deteksjon av anti- tissue Transglutaminase
Hemolyse er en hyppig preanalytisk feilkilde som kan oppstår under prøvetakning eller
preanalytisk håndtering av prøven på laboratoriet og fører til at mange prøver må tas på
nytt[25]. Dette er både tidskrevende og kostbart. Hele 60 % av alle blodprøver som avvises
blir avvist pga. hemolyse.
Derfor er hemolyse en viktig faktor som må tas i betraktning ved laboratoriemålinger.
Hemolyse kan føre til feile analyseresultater og gi forhøye eller for lave verdier. Og i
alvorlige tilfeller kan dette gi falske patologiske funn. Dette har vært vist, - for målinger som
kalium, LDH, ASAT og sure fosfataser.[26]
Hemolyse skyldes at erytrocyttmembran ødelegges, slik at hemoglobin og andre
intracellulære komponenter fra røde blodceller (erytrocytter), frigis i den ekstracellulære
væsken dvs. i plasma eller serum. Ved skade på blodplater(trombocytter) og hvite
blodceller(leukocytter) sin cellemembran oppstår trombocytolysis og granulocytolysis.
En av komponentene i røde cellene er fritt hemoglobin, noe som vil gi plasma eller serum
synlig rød farge når konsentrasjonen i serum eller plasma etter sentrifugering er høyere enn
0,02 g/dl.[27] Noen av komponentene, for eksempel kalium K+ er opp til tretti ganger så
konsentrert i det intracellulære rom, dermed vil kalium målingen være sterkt påvirket av
celleskade. Figur 4 viser hvilke komponenter som frigjøres ved celleskade og i hvilke
konsentrasjoner.
Figur 4 a,b. Skjematisk fremstilling av intra og ekstracellulære komponenter før og etter hemolyse.[28]
9
In vivo hemolyse kan forårsakes av antistoffer, medisiner, giftige stoffer, arvelige faktorer
enzymdefekter (acholuric gulsott), ved infeksjoner (for eksempel malaria) eller på grunn av
arvelige faktorer(for eksempel hemoglobinopatier). Ved mistanke om in vivo hemolyse blir
plasma kontrollert for å utelukke mulighet for feil diagnostikk.
Figur 5. Skjematisk forestilling av stigende hemolyse grad.[28]
Trombocytolysis og granulocytolysis kan også påvirke testresultater uten visuell hemolyse.
10
4.0 Materiale og metoder
4.1 Materiale:
Prøver:
Til forsøkene benyttet vi 11 positive pasient prøver. I tillegg til dette benyttet vi prøver fra en
negativ donor for å lage ulike hemolysegrader i pasientprøvene.
Alle prøvene ble tatt på serum glass med gel og de sto i minst en halv time for å koagulere før
de ble sentrifugert i 10 minutter ved 2000 g. Så ble serum pipettert over i plastrør.
De eldste av pasient prøvene var frosset ned etter analysering slik at de skulle være holdbar til
våre forsøk, mens de nyeste ble oppbevart i kjøleskap. Holdbarheten til prøvene er syv dager i
kjøleskap, mens de er svært stabile dersom de fryses. [29]
Referanseområde
Referanseområde for t-TG målt på Phadia 250 er:
Resultat
Konsentrasjon t-TG (U/ml)
Negativ
0-7
Tvetydig
7-10
Positiv
11-128*
Tabell 1: Referanseområde for t-TG.
Tabell 1 viser referanseområde for t-TG målt på Phadia 250.
*Dersom prøvene har høyere konsentrasjon enn 128 svares det med >128.
Instrumentet måler konsentrasjonen av IgA antistoff i µg/l, deretter benytter den seg av en
faktor oppgitt for hver Lot for å konvertere resultatene til U/ml.
Hemolysat:
For å lage hemolysat ble negative prøver satt direkte i -70 °C fryser, for at de røde blodcellene
skulle hemolysere. I tillegg lot vi noen av glassene koagulere på benk som vanlig. Første dag
lot vi glassene stå 10 minutter i fryser, før de ble tint i vannbad og sentrifugert. Andre dag lot
vi prøvene stå i 15 minutter i fryser for å få en større grad av hemolysering, deretter ble de tint
i vannbad og sentrifugert.
11
Deretter målte vi serum index på de hemolyserte prøvene. Dette ble gjort på Cobas
8000(Roche/Hitachi, Sveits). Serum index verdiene ble brukt til å beregne hvor stort volum vi
trengte å tilsette av hemolysatet til uhemolysert serum slik at vi fikk stigende grader av
hemolyse.
Til selve analyseringen brukte vi 200 µl pasient prøve tilsatt 100 µl med serum i forskjellig
hemolysegrad.
Serum index:
Serum index analysen er basert på absorpsjonsmålinger av fortynnede prøver ved forskjellige
bølgelengder for å få en oppførelse av hemoglobin i serum. Svaret vil være semikvantitativt.
Instrumentet fortynner pasientprøvene med NaCl og måler absorbansen av prøven ved
bølgelengde 570 nm (primær) og 600 nm (sekundær). Ut fra disse absorpsjonsverdiene vil
instrumentet beregne serum index ved hjelp av forskjellige faktorer. [30]
4.2 Instrument:
Phadia 250(Thermo scientific, USA) er et helautomatisert instrument som er designet for
ImmunoCap- reagenser og EliA-reagenser (se beskrivelse lenger ned i dokumentet).
Instrumentet utfører alle trinn, fra pipettering av prøve til avlesning av respons. Kapasiteten er
60 tester per time. Instrumentet er svært brukervennlig og krever lite «hands on time» fra
operatøren. Dødvolum for vanlige prøverør er 100 µl, mens for prøver i pediatriske rør 60 µl.
Etter endt analyse finnes det informasjon om hvilke reagenser som har blitt brukt i analysen
av den enkelte prøven. [29]
12
Variasjon
Presisjon til instrumentet ble bestemt fra en studie der det ble analysert 3 prøver 14 ganger på
3 instrument. Variasjonskoeffisienten ble beregnet og illustrerer usikkerheten i målingene
internt innen en analyse (intern) og mellom analyser utført ved ulike tidspunkt (intra).
Variasjonskoeffisient for metoden ved ulike konsentrasjoner oppgis i tabell 2.
Prøve
Variasjonskoeffisient (%)
Kons. Gjennomsnitt Intra assay
Inter assay
(U/ml)
variasjon
variasjon
1
11,0
4,8
2,8
2
15,6
4,1
1,6
3
126,1
5,1
4,4
Tabell 2: Variasjonskoeffisient for metoden på Phadia 250.
4.3 ELISA:
For analysering av autoimmune analyser brukes det EliA-teknologi. Metoden er bygget opp
som en «enzyme linked immunosorbant assay» (ELISA) med fluorescerende sluttprodukt.
EliA-teknologi benyttes for alle autoimmuneanalyser (IgG, IgM og IgA) i serum. EliAteknologi benytter seg av EliA-brønn, som er en polystyrenbrønn «coated» med antigener som
korresponderer med antistoffene vi skal påvise. [29,31]
ELISA er en vanlig metode som brukes for å måle konsentrasjonen av en analytt, som regel et
antigen eller et antistoff i en prøve. Ved en ELISA skjer bindingen av spesifikke og ikke
spesifikke interaksjoner til en solid overflate, for eksempel en mikroplate eller en «cap» og
man kan oppnå kvantitative resultater ved å benytte seg av en standardkurve. Alle trinnene i
metoden fører til sist til et farget produkt som korrelerer til konsentrasjonen av analytten i
prøven. ELISA metoden er enkel og rask, og man kan analysere mange prøver samtidig, og
dermed er dette en populær teknikk å bruke på laboratoriet. [31]
Det første steget i en ELISA metode er «coating», der for eksempel en mikroplate blir coatet
med enten et antigen eller et antistoff, ut fra hva man skal undersøke i prøven. Steg to er
blokkering der man bruker et urelatert protein basert reagens for å dekke over alle de stedene
som ikke har fått antigen eller antistoff bundet til seg. For instrumentet får man kjøpt ferdig
«coatede» mikroplater eller «caper» slik at disse er klare til bruk. Pasientprøve blir så tilsatt i
de «coatede» mikroplatene før steg tre.[31]
13
Steg tre er deteksjon, der enzym-konjugert antistoff eller antigen vil binde seg til antigen eller
antistoff som brønnene er «coatet» med. Så vil det tilsettes substrat som gir et signal som kan
leses av. Mellom hvert trinn vaskes det grundig, slik at det ikke skal være noen rester igjen fra
forrige steg. [31]
ELISA metoden bygger på den spesifikke reaksjonen mellom en epitop som finnes på
antigenet og det spesifikke bindingsstedet for denne epitopen funnet på et matchende
antistoff. Antistoffene som brukes i ELISA kan enten være monoklonale, det vil si at de kun
binder til en spesifikt epitop, eller de kan være polyklonale, der det er et utvalg av antistoffer
som kan binde seg til flere epitoper på antigenet. Det finnes fire hovedformer for ELISA;
direkte, indirekte, «sandwich» og konkurrerende ELISA. Phadia 250 bruker «sandwich»
ELISA. [31]
«Sandwich» ELISA:
«Sandwich» ELISA benytter seg av antistoff par. «Capene» som brukes er «coated» med
antigen som er spesifikt for IgA (i dette tilfellet) i prøven. Dette er illustrert på figur 6, der vi
ser hvordan IgA fra prøven binder seg til antigenet som «capene» er «coated» med. Etter
vasking, tilsettes det enzym merket anti-IgA (konjugat) slik at det blir dannet et kompleks.
Komplekset blir inkubert en viss tid, så blir overflødig reagens vasket bort. Hele dette
komplekset vil være bundet fast til antigenet som «coater» capen. På figur 7 kan vi se hvordan
enzymmerket anti-IgA har bundet seg til IgA fra prøven, som igjen er bundet fast i antigen i
brønnen. Overflødig kompleks vaskes bort. Deretter blir det tilsatt et substrat, før reaksjonen
inkuberes på nytt. Enzymet i komplekset vil katalysere en reaksjon i substrat løsningen slik at
det blir dannet en fluorescerende forbindelse. Ved å tilsette stop-løsning vil reaksjonen stoppe
og fluorescens kan måles i eluatet. Dette illustreres på figur 8. Denne verdien vil være
proporsjonal med konsentrasjonen av IgA antistoffer i prøven. [29,32]
14
Figur 6 a,b og c:Bildet illustrerer EliA brønnene «coated» med antigen som IgAantistoffer fra prøven kan binde
seg til. Enzym merket anti-IgA tilsettes brønnen og det blir dannet kompleks. Kompleks som ikke er bundet til
antigen i brønnen vaskes bort. Kompleks fører til at enzym i development-løsning katalyserer en reaksjon slik at
det dannes fluorescerende forbindelser. Stop løsning tilsettes for å stoppe reaksjonen.
[29]
4.4 Kalibrering, kontroller og reagens:
Kalibrering
Instrumentet blir kalibrert hver 28 dag, etter månedlig vedlikehold eller etter skifte av
konjugat. Det blir da satt opp en felles kalibreringskurve kurve for analyse av IgA, IgG og
IgM.
For hvert punkt gjøres det to paralleller, der gjennomsnittet av disse blir brukt.
Instrumentet har innebygde akseptgrenser for kalibreringskurven, og ved godkjenning av
kalibrator kurver blir resultatene av denne sammenlignet med forventet verdi og de fastsatte
grensene. Dersom disse verdiene faller innenfor de satte grensene, vil kurven bli godkjent og
brukt. Dersom en eller flere av verdiene faller utenfor de fastsatte grensene vil instrumentet
benytte seg av et sett med regler for å bedømme om kalibreringskurven kan brukes eller ikke.
Kurvekontroll
I tillegg til månedlig kalibrering blir det daglig analysert en kurvekontroll (foruten dagen for
oppsett av ny kalibratorkurve). Dette er en kontroll med kjent konsentrasjon som skal forsikre
operatøren om at kalibratorkurven er riktig. Dersom kurvekontrollen blir feil, blir det
analysert en ny kurvekontroll, og dersom denne også blir feil blir det gjort en ny kalibrering
av instrumentet. Det blir analysert to paralleller av kurvekontrollen og gjennomsnittet av disse
to blir brukt.
15
Kontroller
Kontroller som brukes på instrumentet er en negativ EliA kontroll og en positiv EliA kontroll.
Disse blir laget av firma og er ferdig fortynnet, dermed blir ikke fortynningen på instrumentet
sjekket. For å sjekke fortynningen på instrumentet brukes det på UNN i tillegg en intern
pasient kontroll som de har laget selv. Resultatene fra intern pasient kontroll følges nøye over
tid i eget statistikk program.
Reagenser:
Tabell over reagensene som bruktes:
Navn
Beskrivelse
Lot
Holdbarhet
Oppbevaring
EliA Celikey
«Coted» med
BRJ2S
1.6.2015
Tørt ved 2-8 °C
IgA Well
rekombinant tissue
C9XBM
30.1.2015
2-8 °C
C9ZBL
30.9.2015
2-8 °C
BVXCN
1.3.2017
2-8 °C
BVRD7
1.4.2015
2-8 °C
transglutaminsase
fra menneske
EliA Celiac
Multiparameter
Positiv kontroll
kontroll,
250
inneholder IgG og
IgA antistoffer
EliA IgA
Multiparameter
Negativ kontroll kontroll,
250
inneholder normalt
sera fra friske
donorer
EliA Sample
PBS som
Diluent
inneholder BSA,
detergent og
natrium azid
(0,095 %)
EliA IgA
β-galaktosidase
Konjugat
anti-IgA i PBS
50/200
som inneholder
BSA og natrium
azid (0,06 %)
16
EliA IgA
IgA fra menneske
Kalibrator
med ulik
Strips
konsentrasjon i
BVJB6
30.11.14
2-8 °C
BVMBM
30.11.14
2-8 °C
0048
3.3.2015
Tørt ved 2-8 °C
BW1LJ
1.12.2014
2-8 °C (må ikke
PBS som
inneholder BSA,
detergent og
natrium azid
(0,095 %)
EliA IgA
IgA fra menneske
kurvekontroll
i PBS som
Strips
inneholder BSA,
detergent og
natrium azid
(0,095 %)
EliA IgA
«Coated» med
Kalibrator Well
monoklonale
antistoff fra mus
Development
4-
Solution
Metylumbelliferyl-
fryses)
β-D-galaktoside
Stop Solution
4 % natrium
BNDFZ
1.12.2015
2-8 °C
karbonat
Dilution Plates
Mikroplater med
Romtemeratur
96 brønner (0,5
ml)
Tabell 3: Reagenser som bruktes for analysen
Tabell 3 viser de reagensene som bruktes for analysen, LOT nummer, holdbarhet og
oppbevaring av disse. Det er også nevnt kort hva de forskjellige reagensene inneholder.
4.5 Statistikk:
Vi brukte Excel for å behandle alt av data og for å utføre de statistiske beregningene vi har
gjort. For alle prøvene utførte vi en T-test for avhengige data for å sjekke om det var
17
signifikant forskjell mellom det første og siste punktet. Dersom p<0,05 er det signifikant
forskjell.
4.6 Fremgangsmåte:
Forsøk 1:
Vi utførte to forsøk på ulike dager. I forkant av de faktiske forsøkene utførte vi test forsøk for
å kartlegge hvordan vi skulle lage de forskjellige hemolysegradene.
Prøve fra negativ donor ble analysert for å verifisere at den var negativ. Deretter ble
hemolysert serum analysert på Cobas 8000 for å finne serumindex. Vi brukte dette svaret for
videre å beregne hvor stort volum vi trengte for å lage forskjellige hemolysegrader. I det
første forsøket laget vi 4 forskjellige grader av hemolyse hhv; hemolysegrad 1, 2, 3 og 4, der
1 var den som hadde minst hemolyse og 4 var den med mest. For grad 4 tilsatte vi ikke noe
uhemolysert serum for å få en høyest mulig hemolysegrad. Vi hadde også serum uten
hemolyse som vi kalte grad 0. Alle gradene av hemolyse var laget fra samme serum.
Vi laget rundt 1 ml prøve av de forskjellige hemolyse gradene, for å ha nok til hele forsøket.
Etter å ha laget de forskjellige gradene, målte vi igjen serumindex på disse før vi brukte de
videre i forsøket.
For det første forsøket brukte vi syv forskjellige pasient prøver som hadde blitt samlet av
veileder. Alle disse var positive for t-TG i forskjellige konsentrasjoner.
For hver pasient prøve laget vi 5 ulike hemolyse grader, til sammen 30 prøver totalt.
For alle pasientprøvene ble det fordelt 200 µl pasient prøve i 5 forskjellige rør. Deretter ble
det tilsatt 100 µl av de forskjellige hemolysegradene, det vil si at i det første røret tilsatte vi
100 µl av hemolysegrad 0, i det andre røret 100 µl av hemolysegrad 1 osv.
Disse ble så analysert på Phadia 250. Etter avsluttet analyse ble det målt serumindex på alle
disse prøvene på Cobas 8000.
Forsøk 2:
Vi begynte med å lage ferskt hemolysat på samme måte som for det første forsøket, med
unntak av å ha glassene i -70 °C i 15 minutter i stede for 10 minutter, for å få en sterkere
hemolyse. Detter fulgte vi samme prosedyre som for forsøk 1. For dette forsøket laget vi 5
forskjellige hemolysegrader i tillegg til grad 0 (serum uten hemolyse).
18
Vi brukte fire nye pasientprøver på dette forsøket i tillegg til en negativ prøve.
I tillegg brukte vi seks av syv pasientprøver fra forsøk 1. Den siste kunne ikke benyttes da det
var for lite prøvemateriale igjen. For disse seks pasientprøvene tilsatte vi kun grad 5, på grunn
av at denne hadde sterkere hemolysegrad enn grad 4 for det første forsøket, for vi ville se
effekten av en nokså sterk hemolyse.
Videre ble det på grunn av lite prøvemateriale ikke tilsatt grad 1 på to av prøvene fra forsøk 2.
Vi brukte, som i forsøk 1; 200 µl pasientprøve og 100 µl av prøve med ulik hemolysegrad. Vi
analyserte til sammen 34 prøver. Disse ble analysert på Phadia 250, slik som for forsøk 1, og
når de var ferdig analysert, ble serum index bestemt på Cobas 8000.
19
5.0 Resultater
5.1 Kalibrering, kurvekontroll og kontroller:
Kalibrering:
Figur 7: Kalibreringskurven for metoden.
Figur 7 er bilde av den kalibreringskurven som bruktes den måneden vi gjorde våre forsøk. På
y-aksen vises responsen, det vil si hvor mye lys som blir registrert fra reaksjonen, på x-aksen
vises konsentrasjonen av kalibratorene som brukes. Ved avlesning av prøve vil instrumentet
måle responsen og ut fra kalibrator kurven bestemme konsentrasjonen i prøven (U/ml).
20
Kurvekontroll:
For forsøk 1 ble det ikke gjort kurvekontroll på grunn av at instrument hadde blitt kalibrert
samme dag.
Resultater kurvekontroll for forsøk 2:
Kurvekontroll
Forventet
% CV
Målt konsentrasjon
1,2
4,9
konsentrasjon
CC-1
5,00
Tabell 4: Resultatene fra kurvekontrollen for forsøk 2.
Tabell 4 viser resultatene fra kurvekontrollen som ble gjort samme dag som forsøk 2. Den
forventede konsentrasjonen av denne var 5,00 og målt konsentrasjon var 4,9, dermed ble
kurvekontrollen godkjent, noe som viste at kalibratorkurven var rett.
Kontroller:
For begge forsøkene våre ble det analysert negativ EliA kontroll, samt internkontroll.
Resultater for kontroller analysert for forsøk 1:
Kontroller
Konsentrasjon (U/ml)
Lot
EliA Neg
Under grensen
C9ZBL
tTGint.
19
71013
Tablell 5: Kontrollverdier for forsøk 1.
Tabell 5 viser resultatene av den negative kontrollen og internkontrollen som ble analysert
samme dag som vi utførte forsøk 1. Begge disse var innenfor sine grenser og kunne godtas.
Resultater for kontroller analysert for forsøk 2:
Kontroller
Konsentrasjon (U/ml)
Lot
EliA Neg
0,1
C9ZBL
tTGint.
18
71013
Tabell 6: Kontrollverdier for forsøk 2.
21
Tabell 6 viser resultatene av den negative kontrollen og internkontrollen som ble analysert
samme dag som vi utførte forsøk 2. Begge disse var innenfor sine grenser og kunne godtas.
5.2 Hemolysegrader:
Forsøk 1:
Serum index målt på Cobas 8000 for hemolysert prøve ble 939. Ut fra dette beregnet vi hvor
stort volum vi trengte for å lage ulike hemolysegrader. Resultatet av dette ble:
0)
1000 µl uhemolysert serum
1)
30 µl hemolysert serum + 990 µl uhemolysert serum
2)
125 µl hemolysert serum + 1000 µl uhemolysert serum
3)
650 µl hemolusert serum + 975 µl uhemolysert serum
4)
1000 µl hemolysert serum
Forsøk 2:
Serum index målt på Cobas 8000 for hemolysert prøve ble 5453. Ut fra dette beregnet vi hvor
stort volum vi trengte for å lage ulike hemolysegrader. Resultatet av dette ble:
0)
700 µl uhemolysert serum
1)
5 µl hemolysert serum + 645 µl uhemolysert serum
2)
10 µl hemolysert serum + 540 µl uhemolysert serum
3)
55 µl hemolysert serum + 605 µl uhemolysert serum
4)
120 µl hemolysert serum + 600 µl uhemolysert serum
5)
5000 µl hemolysert serum + 1000 µl uhemolysert serum
22
Figur 8: Bilde av de forskjellige hemolysegradene.
Figur 8 viser et bilde på hvordan de forskjellige hemolysegradene så ut visuelt. Vi kan se en
tydelig fargeforandring ettersom hemolysegraden stiger.
5.3 Resultater forsøk:
Dette er de resultatene vi fikk fra våre forsøk. Disse blir presentert med en graf for begge
forsøkene, med konsentrasjon (U/ml) på y-aksen og serumindex på x-aksen. For
konsentrasjonen har vi også regnet ut nedgang (%) fra første til siste punkt for hver prøve. Vi
har også utført en T-test for avhengige data for hver prøve for å sjekke om det var signifikant
forskjell mellom første og siste punkt.
23
Forsøk 1:
Resultatene vi fikk fra forsøk 1 vises på figur 8.
Figur 8: Graf som viser resultatene for forsøk 1*.
* For prøve 125-83935 tok vi bort hemolysegrad 5 på grunn av for lite prøvemateriale.
Figur 8 viser grafen for hvordan konsentrasjonen forandret seg for de syv pasientprøvene vi
brukte i forsøk 1 når serum index stiger, det vil si når det blir mer hemolyse i prøven. Det
første punktet er uten tilsatt hemolyse og det siste punktet er tilsatt sterkest hemolyse.
24
Forsøk 2:
Resultatene vi fikk fra forsøk 2 vises i figur 9.
Figur 9: Graf som viser resultatene for forsøk 2*.
* For prøve 126-45199 og 126-52972 tok vi bort hemolysegrad 1 på grunn av for lite
prøvemateriale.
Figur 9 viser grafen for hvordan konsentrasjonen forandret seg for de fem pasientprøvene vi
brukte i forsøk 2 når serum index stiger, det vil si når det blir mer hemolyse i prøven. Det
første punktet er uten tilsatt hemolyse og det siste punktet er tilsatt sterkest hemolyse.
25
Tabell for statistiske beregninger gjort for forsøk 1 og 2:
Prøve nummer
Nedgang i prosent (%)
P-verdi
Negativt serum
14,3
0,50
126-17260
25,0
Kunne ikke regne p-verdi
126-45199
11,9
0,11
126-52972
5,0
Kunne ikke regne p-verdi
126-46617
8,0
0,34
125-83935
3,1
0,50
126-13841
12,6
0,35
126-20080
5,9
0,16
126-16852
11,8
0,20
126-20120
4,5
0,13
125-81924
14,3
0,13
125-77442
11,8
0,38
Tabell 7: Tabell over de beregningene som ble gjort for forsøk 1 og 2.
Tabell 7 viser alle nedgang og p-verdi fra de statistiske beregningene på alle pasientprøvene
som vi testet i tillegg til negativt serum. For prøve nummer 126-17260 og 126-52972 kunne vi
ikke regne p-verdi.
26
6.0 Diskusjon
Både kurvekontrollen, negativ kontroll og internkontroll kom innenfor de grensene som var
satt, dermed vet vi at instrumentet fungerer og har analysert rett. Vi kan derfor bruke de
svarene vi har fått. Dersom noen av disse ikke hadde blitt godkjent, kunne vi ikke stolt på at
kalibratorkurven var rett og at instrumentet fungerte som normalt. Da ville det ha blitt satt opp
en ny kalibrering av instrumentet før vi kunne ha analysert våre prøver.
Vi observerer en svak nedgang ved høyere hemolyse. Ut fra teoridelen tidligere i dokumentet
vet vi at det finnes tTG intracellulært i erytrocytter. Ved hemolyse, det vil si ødeleggelse av
erytrocyttene, vil tTG som finnes i disse bli frigitt ut i serum. Dermed kan sirkulerende IgA
antistoff binde seg til antigen på tTG fra erytrocyttene i stede for å binde seg til tTG som
finnes i EliA brønnene. Derfor vil en del av det sirkulerende IgA antistoff, som vi tester for,
ikke være bundet fast til brønnene, og de vil vaskes bort i løpet av prosessen. Resultatet vi får
vil derfor være mindre enn forventet på grunn av at vi ikke har fått med alt av det sirkulerende
IgA antistoffet. På bakgrunn av dette hadde vi forventet en større nedgang enn den som vi har
observert.
Siden vi for alle prøvene observerer en nedgang, og på grunn av at for den negative prøven
viser en nedgang på 14,3 %, vil det være sannsynlig å anta at hemolyse i prøven ikke vil
kunne gi falsk positive svar. Dette stemmer også med teorien om hemolyse og at antistoffene
bindes opp til frigitt tTG.
For alle prøvene var det en viss nedgang i konsentrasjonen. Denne nedgangen lå mellom 3,125,0 %, der halvparten av prøvene lå i området 11,8-14,3 %. Det var kun en prøve som lå over
14,3 %. Denne prøven hadde en nedgang på 25,0 %. Resten av prøvene hadde en nedgang på
under 10,0 %. Fem prøver hadde en nedgang i området 3,1-8,0 %. Nedgangen ses best for de
prøvene med lavere konsentrasjon av anti- tTG. For disse prøvene vil nedgangen ha mer å si
enn for de prøvene med høyere konsentrasjon. Prøver som har en konsentrasjon som ligger i
grensen mellom positiv og negativ prøve vil være de prøvene som rammes mest av eventuell
hemolyse. Før høye konsentrasjoner vil ikke den nedgangen vi har observert gi noen
betydning for svaret.
27
På grunn av at variasjonen som vi observerer i prøvene våre er større enn den variasjonen som
er tillatt for metoden kan vi dermed si at den nedgangen som blir observert skyldes hemolyse
og ikke bare den variasjonen som kan forekomme ved analysering på dette instrumentet. For
en del av prøvene er nedgangen i konsentrasjon så pass liten at den kunne ha kommet av den
variasjonen som forekommer for analysen, men på grunn av at det observeres en nedgang på
alle prøvene, er det sannsynlig at de små nedgangene også skyldes hemolyse.
For de fleste av prøvene kunne vi observere en liten økning ved de lave hemolysegradene før
konsentrasjonen falt. Dette gjentok seg for 11 av prøvene, men noen av disse falt først i
konsentrasjon, for så å stige og falle igjen. Hvorfor dette skjer har vi ikke en forklaring på. Ut
fra teorien vil ikke dette stemme, men på grunn av at dette skjer ved så mange av prøvene
tyder det ikke på at det er feil.
Vi utførte en T-test for avhengige data for å se om det var signifikant forskjell mellom det
første og det siste punktet. På alle, unntatt for de to vi ikke kunne beregne p verdi på, var det
ikke signifikant forskjell mellom det første og det siste punktet. Det vil si at i følge statistisk
analyse kan den nedgangen som ses skyldes tilfeldigheter, og ikke på grunn av hemolyse.
Men på grunn av at vi kun har to paralleller for hvert punkt vil vi ikke kunne stole på
resultatene fra T-testen, og vi kan derfor ikke trekke noen konklusjon ut fra dette. For å kunne
brukt statistiske beregning for å trekke en konklusjon måtte vi ha hatt flere paralleller for
hvert punkt. Av denne grunn mener vi at siden nedgang observeres for alle prøvene, og er en
tydelig trend, skyldes forandringene hemolyse og ikke bare tilfeldigheter. Derfor vil vi kort
diskutere om de forskjellene vi observerer har noen klinisk betydning.
Ut fra disse forsøkene ser vi at det er prøvene som ligger i grensen mellom negativ og positiv
prøve som en eventuell hemolyse i prøvene vil ha en betydning for. For disse prøvene kan
svaret bli for lavt, det vil si gi et falskt negativt svar. Men selv om dette stemmer, vil det i
praksis ikke ha mye å si for pasienten klinisk. Etter å ha tilsatt den sterkeste hemolysegraden
til prøvene ble de visuelt veldig røde. En bioingeniør ville mest sannsynlig avvise en prøve
med så tydelig hemolyse, og dersom prøven ble analysert ville det ha blitt satt inn en
kommentar om at det var hemolyse i prøven, og en anbefaling om å ta en ny prøve. Dermed
ville legen kunne bestille en ny prøve på pasienten som forhåpentligvis ikke hadde hemolyse,
slik at man kan være sikker på svaret. For å gi diagnosen cøliaki vil de kliniske funn i tillegg
til prøveresultatene være av stor betydning. Dermed vil det, selv om en pasient har fått falsk
negativt svar, ikke bli utelukket at pasienten har cøliaki. Om svaret ligger i grensen mellom
28
positiv og negativ prøve kan legen se dette og ta det med i sin vurdering, og eventuelt bestille
en ny prøve dersom han/hun mener svaret er usikkert. Ut fra teorien vet vi i tillegg at ikke alle
pasienter som har cøliaki vil være positiv for IgA, dermed vil ikke en falsk negativ prøve være
nok for å hindre at pasienten ikke får en diagnose. Selvfølgelig vil det ikke være bra hverken
for pasienten eller for laboratoriet å gi ut svar som er falsk negativ, men i akkurat dette
tilfellet vil ikke et slikt svar gi like store konsekvenser som for enkelte andre analyser.
29
7.0 Konklusjon
Ut fra våre forsøk har vi funnet ut at hemolyse vil gi en viss nedgang i analysesvaret når man
benytter seg av metoden a-tissue-transglutaminase IgA, men at denne nedgangen ikke vil ha
store konsekvenser for pasienten på grunn av at nedgangen er for liten til at det vil ha noen
betydning for legen når pasienten skal diagnostiseres for cøliaki.
30
6.0 Referanseliste:
1. Lundin K.E.A., Farstad I.N., Sollid L.M. Cøliaki – nye kliniske erkjennelser og
diagnostiske hjelpemidler. Tidsskr. Nor. Legeforen 2003; 123:3226-9.
2. Frisk og funksjonell. Cøliaki. http://www.friskogfunksjonell.no/cøliaki (1.05.14)
3. Risch N. Assessing the role of HLA – linked and unlinked determinants of disease. Am J
Hum Genet 1987; 40: 1-14.
4. Sollid L.M, Markussen G.,et al.Evidence for primary association of celiac disease to a
particular HLA-DQ alfa/ beta heterodimed. J Exp Med 1989; 169: 345-50.
5. Sollid L.M. Coeliac disease: dissecting a complex inflammatory disorder. Nat. Rev
Immunol.2002; 2:647-55.
6. Kumar V, Abbas AK, Fausto N, Mitchell RN. The oral Cavity and the Gastrointestial Tract.
Robbins Basic Pathology. 8 ed. Philadelfia: Saunders Elsevier; 2007.
7. http://tidsskriftet.no/article/924350, 24.4.2014
8. Dieterich W, Ehnis T, et al. Identification of tissue transglutaminase as the autoantigen of
celiac disease. Nature Med.3,797-801(1997).
9. Qiao SW et al. The adaptive immuneresponse in celiac disease Semin. Immunopathologi
34: 523-540; 2012
10. Trond S. Halstensen, Cøliaki er mye vanligere enn du tror. Indremedisin
http://www.indremedisineren.no/2014/01/coliaki-er-mye-vanligere-enn-du-tror/(20.05.14)
11. Dickey W, Hughes DF, McMillan SA. Reliance on serum endomysial antibody testing
underestimates the true prevalence of coeliac disease by one fifth. Scand J Gastroenterol 2000
Feb; 35(2):181-3.
12. Lagerqvist C, Ivarsson A, Juto P, Persson LA, Hernell O. Screening for adult coeliac
disease which serological markes(s) to use? J Intern Med Sep;250(3):241-8; 2001
13. Spenser J, Isaacson P.G, Mac Donald T.T, Thomas A.J, Walker – Smith J.A. Gamma
/delta T- cells and the diagnosis of celiac disease. Clin Exs Immunol 1991; 85:109 -13.
14. Beninati S., Biacentini M. The transglutaminase family: en overwiew: minireview article.
Amino Acids 2004; 26:367-72.
15. Kiraly R, Demeny M, Fesus L (December 2011). Protein transamidation by
transglutaminase 2 in cells: a disputed Ca2+ dependent action of a multifunctional protein.
FEBS Journal, vol. 278(24): 4717-39.
31
16. Kløck C., Diraimondo T.R, Khosla C. (july 2012) Role of transglutaminase 2 in celiac
disease pathogenesis. Seminar immunopathol 34(4): 513-22.
17. Facciano F., Facciano A., Facciano A.M (2006).The role of transglutaminase 2 and its
substrates in human diseases. Front. Biosci 11:1758-73.
18. K. Mehta, “Mammalian transglutaminases. A family portrait”, intransglutaminases:
Family of Enzymes with diverse Functions, vol.38 of progress in Eksperimental Tumor
research, pp.1-18, Karger medical and Scientific Publishers, 2005.
19. L. Lorand and R.M. Graham, “Transglutaminases: crosslinking enzymes with pleiotropic
functions”, Nature Reviews Molecular Cell Biologi, vol.4, no.2 pp.140-156, 2003.
20. T. Rauhavirta, M. Oittinen, R. Kivisto et al. Are transglutaminase 2 inhibitors able to
reduce gliadin – induced toxicity related to celiac disease? A proof- of- concept study, journal
of Clinical Immunology, vol. 33, no.1, pp.134-142, 2013.
21. Sollid L.M. and Jabri B. Current Opinion in immunology. 2005;17:595.
22. D. Hand, D.Dias, and L.W.Haynes. “Stabilization of collagen – tailed ecytylkolinnesterase
in muscle cells through extracellular anchorage by transglutaminase- catalyzed crosslinking.” Molecular and Cellular Biochemistry, vol. 204, no 1-2, pp.65-76, 2000.
23. C.M. Sollid, O. Molberg, S. McAdam, and K.E.A. Lundin “Autoantibodies in coeliac
disease: tissue transglutaminase guilt by association?” Gut, vol.41, no.6 pp.851- 852, 1997.
24. E. Cordella-Miele, L. Miele, and A. B. Mukherjee, “A novel transglutaminase-mediated
post-translational modification of phospholipase A2 dramatically increases its catalytic
activity,” The Journal of Biological Chemistry, vol. 265, no. 28, pp. 17180–17188, 1990.
25. Jones BA, Calam RR, Howanitz PJ.Chemistry specimen acceptability: a college of
American pathologists Q- probes study of 453 laboratories. Arch Pathol Lab Med 1997;
121(1):19-26.
26. Thomas L. Haemolysis as influence and interferense factor. eJFCC 2003; vol 13 no4:1- 4.
27. Bernes EW, Young DS. General laboratory tecniques and procedures. In: Burtis CA,
Ashwood ER, 4th ed. Tietz Fundamentals of clinical chemistry. Philadelfia, PA: W.B.
Saunders company, 1998:37-38.
28. Gitte Wennecke. Quality assurance. Useful tips to avoid preanalytical errors in blood gas
testing: electrolytes. Oct.2003. http://blodgass org (06.01.12)
29. Phadia 250 Norsk brukermanual, versjon 5.0
30. Kit vedlegg for Cobas 8000, SI2 Serum index gen.2
31. http://www.abdserotec.com/an-introduction-to-elisa.html, 6.5.2014
32
32. http://www.elisa-antibody.com/ELISA-Introduction/ELISA-types/sandwich-elisa,
6.5.2014
33