Transcript Chapitre V : La chromatographie liquide sur colonne

TD Chapitre 3 : Analyse quantitative
Exercice 1 : Normalisation interne
On veut déterminer par la méthode de normalisation interne la composition massique d’un
échantillon constitué de 4 esters de l’acide butanoïque. Une solution de référence de ces
quatre esters (concentrations massiques connues) conduit aux valeurs suivantes des
coefficients de réponse relatifs de butanoates de méthyle (ME), d’éthyle (EE) et de propyle
(PE) par rapport au butanoate de butyle (BE) :
KME/BE = 0,919 KEE/BE = 0,913 KPE/BE = 1,060
On relève sur le chromatogramme les grandeurs ci-dessous :
N° pic
1
2
3
4
tR (min)
2,54
3,47
5,57
7,34
Composé
Méthyl ester (ME)
Ethyl ester (EE)
Propyl ester (PE)
Butyl ester (BE)
Aire (unités arbitraires)
2340,1
2359,0
4077,3
4320,7
Questions :
1- Déterminez la composition massique de ce mélange par normalisation interne
sans coefficients de réponse
2- Déterminez la composition massique de ce mélange par normalisation interne
avec coefficients de réponse
Exercice 2: Etalonnage interne
Une essence de girofle est un produit naturel constituée de 82 à 95% d’eugénol, 10 à 12% d’acétyleugénol,
12% de -caryophyllène, quelques traces de furfural, de vaniline et d’heptane-2-one. On souhaite doser,
chromatographie en phase gazeuse, l’eugénol contenu dans une essence de girofle. Le dosage est réalisé
étalonnage interne en utilisant la undécan-2-one comme étalon interne. Les données relatives à
expérimentations sont reportées ci-dessous :
Expérience 1 :
Masse d’eugénol pesée : mi = 0,2751 g
Masse d’étalon
m E = 0,1500 g
Analyse de 3 chromatogrammes
N° injection
1
2
3
Surface du pic de l’eugénol Ai
(mV/s)
190 777
189 869
191 291
Analyse des échantillons :
EG-1 :
EG 2 :
Masse d’échantillon pesée : mech = 0,3828 g
Masse d’étalon :
m E = 0,1601 g
Masse d’échantillon pesée : mech = 0,4545 g
Masse d’étalon :
m E = 0,1736 g
Surface du pic de l’étalon AE
(mV/s)
123 890
122 976
124 607
5à
par
par
ces
Analyse de 3 chromatogrammes
EG-1
N° injection
1
2
3
Ai
(mV/s)
235 295
236 709
234 427
EG-2
AE
(mV/s)
140 618
140 791
140 121
Ai
(mV/s)
225 042
226 138
230 691
AE
(mV/s)
146 600
149 931
150 280
Questions :
12-
Quels sont les avantages et inconvénients de l’étalonnage interne ?
Quel est l’objectif de l’expérience 1? Calculer la quantité d’eugénol dans EG-1 et dans EG-2.
Exercice 3 : Etalonnage interne
Soient deux mélanges de 2 substances (A et B). On additionne à chaque prise d’essai une
certaine quantité de l’étalon interne comme indiqué dans le tableau et on note les surfaces de
pic.
Mélange 1
Mélange 2
Masse
Ai
Masse
Ai
(mg)
(mg)
A
M1A
295 092
M2A
212 083
B
M1B
219 025
M2B
306 208
A+B
250,42
228,51
Etalon interne 84,12
225 684
85,98
255 022
Questions :
1- Quels sont les critères de sélection d’un étalon interne ?
2- Pour quel type d’analyse choisit-on l’étalonnage interne ? Enoncez les avantages
et les inconvénients de l’étalonnage interne par rapport à l’étalonnage externe.
3- Calculer les masses et le pourcentage relatif de chaque composé dans chaque
mélange.
Commentaire [AP1]: A placer en
dernier
Exercice 4 :
Un liquide A est composé d’un mélange de 2 solutés : hexane et X à identifier. L’analyse sur une colonne de L =
15 m et de Vm = 3,6cm3 donne 2 pics dont la distance de rétention est indifféremment 65 et 75 mm et de largeur
de pic à la base () respectivement de 2,2 et 2,6 mm. Le débit de gaz vecteur D = 1,2 cm3/min et la vitesse de
défilement de papier ue = 10 mm/min.
1- Calculer le facteur de capacité des deux pics
2- Calculer le facteur de résolution entre les 2 pics.
3- Calculer l’efficacité de la colonne, son efficacité au mètre et la hauteur d’un plateau théorique.
Dans des conditions identiques, l’analyse CPG d’un mélange contenant
- 560 mg d’heptane
- 600 mg d’octane
- 320 mg de pentane
- 750 mg de liquide A
Donne un chromatogramme à 5 pics dont les distances de rétention réduites et les aires sont données dans le
tableau ci-dessous :
d’R (mm)
A (mm2)
Pic 1
24,5
1920
Pic 2
35
2900
Pic 3
45
2100
Pic 4
82
3360
Pic 5
150
3600
On donne les indices de rétention selon KOVATS pour différents solutés dans ces conditions de travail :
- méthyl-2, propanone
530
- Propanol
575
- Méthyl-2, pentane
560
- Pentanone
620
4- Faire l ‘analyse qualitative.
5- Donner la composition pondérale du liquide A :
- en considérant que l’hexane et le soluté X ont même coefficients de réponse.
- en utilisant comme coefficients de réponse des valeurs à déduire des données
Exercice 5 : Dosage d’un soluté dans une matrice complexe
L’éphédrine est un composé pharmaceutique analogue à l’adrénaline, dont l’usage est fréquemment détourné à
des fins de dopage dans le milieu sportif en raison de son effet stimulant. Cette molécule entre donc dans la liste
des produits ciblés lors des contrôles de dopage effectués dans le sport de haut niveau.
Les échantillons analysés dans ce cadre sont soit des urines, soit du plasma sanguin. Dans chacun de ces cas, la
matrice à analyser est particulièrement complexe.
Un échantillon d’urine d’un compétiteur est partagé en 4 fractions de 1mL. 0, 5, 10 et 15µL d’une solution mère
(mélange éphédrine, noréphédrine et méthyléphedrine) à 500µg/mL sont respectivement ajoutés à chacune des
fractions (A1 à A4). Chaque solution est analysée et les aires des pics chromatographiques sont relevées :
A1
A2
A3
A4
éphédrine noréphedrine méthyléphedrine
25032
5360
45807
35670
20945
51451
46003
37078
56451
56965
52576
62095
1- Quelle est la méthode de dosage utilisée, précisez les avantages et les
inconvénients de cette méthode
2- Calculer la masse de l’ajout dans chacune des solutions
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Commentaire [AP2]: Papier semi log 2
decades
3- Tracer sur papier millimétré l’évolution de l’aire du pic chromatographique
mesurée en fonction de la masse de l’ajout (axe de abscisses : -25 à 10µg/L, axe
des ordonnées : 0 à 8000)
4- Expliquer comment peut-on déterminer la concentration initiale de la solution et
le démontrer
5- Quelles sont les concentrations de chaque soluté dans l’échantillon ? Précisez si la
méthode permet de déterminer précisément ces concentrations, justifiez
Exercice 6 : Contrôle du niveau de piquant d’un piment
Les capsaïcinoïdes constituent une famille de molécules à l’origine de la saveur piquante de
certains aliments. La capsaïcine et la dihydrocapsaïcine, qui représentent 80 à 90% des
capsaïcinoïdes contenus dans les piments et poivrons sont représentées ci-dessous :
Les capsaïcinoïdes sont notamment utilisés par l’industrie agroalimentaire pour la préparation
de plats dits « épicés ». La quantité de capsaïcine détermine le niveau de piquant du piment
selon la nomenclature ci-dessous (CODEX STAN 307-2011):
La quantité de piments ajoutée aux préparations alimentaires doit être ajustée en fonction de
leur teneur en capsaïcine. Afin de contrôler le pouvoir piquant des piments utilisés, une
analyse de ces matières premières est réalisée selon le protocole suivant :
Préparation d’échantillon :
125mg de piment sont broyés et extraits par 100mL d’éthanol. Le solvant est évaporé et la
solution ainsi obtenue purifiée sur colonne de silice C18. Le volume de l’extrait est finalement
ramené à 5mL.
Analyse de l’extrait par chromatographie liquide:
Colonne: Shim-Pack® VP-ODS 150x4,6 mm; 5µm
Elution: eau/acétonitrile/acide formique 39/59/2 (v/v/v)
Débit : 1mL/min
Volume d’injection : 20µL
Détection : 280nm
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Pour réaliser cette quantification, des solutions étalon de capsaïcine à 10, 20, 50, 100 et 200
mg/L respectivement sont analysées.
Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau ci-dessous :
solution
Etalon 10mg/L
Etalon 20mg/L
Etalon 50mg/L
Etalon 100mg/L
Etalon 200mg/L
Echantillon
Aire (mAU)
7,30.103
1,36.104
3,25.104
6,40.104
1,27.105
9,55.104
1- En utilisant la relation de base d’analyse quantitative, exprimez l’évolution de
l’aire du pic chromatographique en fonction de la concentration de la solution.
2- Déterminez l’équation expérimentale de la droite d’étalonnage par régression
linéaire.
3- Quel est le coefficient de réponse absolu de la capsaïcine par cette méthode ?
4- Après avoir déterminé la concentration en capsaïcine dans la solution injectée,
déterminez le pourcentage massique de capsaïcine dans le piment étudié.
Afin d’assurer la qualité de la méthode de quantification utilisée. L’opérateur ayant réalisé la
manipulation ci-dessus analyse à 4 reprises un échantillon de piment de référence dont la
teneur en capsaïcine est de 0,172%. L’incertitude de la méthode a été préalablement
déterminée comme étant de +/-0,004%. Les teneurs qu’il mesure sont respectivement de
0,179%, 0,174%, 0,177%, 0,179%.
5- La méthode d’analyse est-elle juste ?
La méthode d’analyse est-elle fidèle ?
Données sur la régression linéaire:
Si les points d’étalonnage sont décrits par une équation de type y  ax  b , on peut
déterminer la pente a et l’ordonnée à l’origine b de la régression linéaire selon les relations
suivantes :
n
Pente : a 
(x
i 1
_
i
_
 x )( yi  y )
n
Ordonnée à l’origine :
_
 ( xi  x ) 2
i 1
_
_
b  y a x
_
_
avec : x la valeur moyenne de la variable x et y la valeur moyenne de la variable y
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