Transcript TD Chapitre 1 : Principes généraux

Module41CA5‐Méthodesséparatives
TDChapitre1:Principesgénéraux
Exercice1:AnalysedecomposésaromatiquesparCLHP.
On étudie la séparation d’un mélange de composés aromatiques (benzène, naphtalène, anthracène) par chromatographie liquide. Les analyses sont réalisées dans les conditions suivantes : 




Phase stationnaire en silice, longueur 25 cm Phase mobile : heptane Débit de la phase mobile variable : 1,5 mL/min ; 1,0 mL/min ; 0,7 mL/min Détecteur UV : longueur d’onde de travail 254nm Vitesse de défilement du papier : 10 mm/min Les chromatogrammes sont fournis en annexe 1. Questions : 1‐ Vérifier sur les chromatogrammes joints, la vitesse de défilement du papier 2‐ Déterminer la distance morte dm. Déterminer la distance de rétention brute de chaque composé. En déduire la distance de rétention réduite pour D = 1,5 mL/min. 3‐ Déterminer le temps mort tm. Déterminer le temps de rétention brute de chaque composé. En déduire le temps de rétention réduit pour D = 1,5 mL/min. 4‐ Déterminer le volume mort de la colonne. Varie‐t‐il en fonction du débit. Justifiez votre réponse. 5‐ Déterminer k’ du benzène à partir des chromatogrammes obtenus pour D = 1,5 mL/min ; D = 1,0 mL/min ; D = 0,7 mL/min. Conclure. 6‐ Déterminer  et R des solutés les moins bien séparés. Anne PIRAM ‐ Josiane MOLINET‐ 41CA5 Page2 Module41CA5‐Méthodesséparatives
Exercice2
Les données suivantes sont obtenues par chromatographie gaz-liquide sur une colonne remplie de
40cm :
Composé tr(min) Méthylcyclohexane Méthylcyclohexène Toluène 10,0 10,9 13,4  (min) 0,76 0,82 1,06 représente la largeur du pic à mi‐hauteur Questions : 1‐ Définir la chromatographie gaz‐liquide. 2‐ Calculez un nombre moyen de plateaux théoriques d’après les données. 3‐ Calculez la valeur de la HEPT. 4‐ Calculez la résolution entre a) le méthylcyclohexène et le méthylcyclohexane b) le méthylcyclohexène et le toluène Commentez les résultats obtenus. 5‐ Si Vs (volume de phase stationnaire) et Vm (volume de la phase mobile) valent respectivement 19,6 et 62,6 mL, et qu’un pic non retenu apparaît après 1,9 min, calculez : a) le facteur de rétention de chaque constituant. b) Le coefficient de distribution de chaque constituant. c) Le facteur de sélectivité entre le méthylcyclohexane et le méthylcyclohexène. Anne PIRAM ‐ Josiane MOLINET‐ 41CA5 Page3 Module41CA5‐Méthodesséparatives
TDChapitre2:Optimisation
Exercice1:
Comparez ces 2 profils chromatographiques sachant que les rapports de phase et les longueurs de ces colonnes sont égaux : Signal du détecteur Colonne 1
Colonne 2
Temps (min) Questions : 1‐
2‐
3‐
4‐
5‐
6‐
Quel composé a le plus grand facteur de rétention ? Quel soluté a le plus grand coefficient de distribution ? Quelle colonne a la plus grande efficacité ? Quelle colonne a les plateaux théoriques les plus petits ? Quelle colonne apporte la meilleure résolution ? Quelle colonne fournit la sélectivité la plus élevée ? Exercice2:LoideVanDeemter
Une solution de 2‐heptanone est injectée sur un chromatographe en phase gazeuse muni d’une colonne WCOT OV1 de dimensions 30mx0,53mm et opérant en mode isotherme. L’opérateur fait varier le débit d’azote parcourant la colonne et relève sur les différents chromatogrammes, les grandeurs suivantes : analyse Débit (mL.min‐1) 1 1,3 2 3 4,0 4 6,6 5 9,9 6 7 19,6 tr HEPT tm u  (min) (min) (cm.s‐1) (mm) (min) 5,00 18,50 0,428 10 2,9 Voir chromatogramme fourni en annexe 1,67 6,17 0,075 30 0,8 1,00 3,70 0,045 50 0,8 0,67 2,47 0,037 75 1,2 0,50 1,85 0,033 0,33 1,23 0,026 150 2,4 N 10350 37500 37500 25000 12500 Questions : Anne PIRAM ‐ Josiane MOLINET‐ 41CA5 Page4 Module41CA5‐Méthodesséparatives
1‐ Déterminez les grandeurs et paramètres chromatographiques de l’analyse 6 : a. Calculez le volume mort de la colonne b. Quel est le débit de gaz vecteur en mL.min‐1? Quelle est alors la vitesse linéaire de la phase mobile dans la colonne chromatographique en cm.s‐1 ? c. Calculez l’efficacité de la colonne dans ces conditions d’analyse, et la hauteur de plateau théorique en mm. 2‐ Déterminez les grandeurs et paramètres chromatographiques de l’analyse 2 (chromatogramme fourni en annexe): a. Mesurez les valeurs de dm, dr, et . b. Déterminez tm, tr, et (min).Vérifiez la cohérence de vos résultats par rapport à l’ensemble des données c. Complétez les données du tableau (u, HEPT, N, Débit). 3‐ Tracez la courbe de Van Deemter sur papier millimétré. 4‐ Déterminez la vitesse optimale de phase mobile conduisant à une efficacité maximale 5‐ Déterminez graphiquement les termes A, B et C de la colonne. Que représentent ces termes ? Exercice3
L’analyse chromatographique de 2 solutés conduit au chromatogramme ci‐dessous, pour lequel la séparation entre les 2 pics n’est pas satisfaisante 1‐ D’après la théorie, quelles grandeurs chromatographiques peut‐on modifier pour améliorer la séparation ? 2‐ Dessinez l’allure du chromatogramme obtenu si le facteur de rétention moyen augmente (pour Net  constants). Commentez. 3‐ Dessinez l’allure du chromatogramme si la sélectivité augmente (pour k’ et N constants). Commentez. 4‐ Dessinez l’allure du chromatogramme si N augmente (pour k’et  constants). Commentez. 5‐ Comment peut‐on augmenter le facteur de rétention en CPG ? 6‐ Comment peut‐on augmenter l’efficacité ? Exercice4:Etudedecas
AnalysedemycotoxinesdanslescéréalesparCPG
Les mycotoxines sont des molécules toxiques libérées par les moisissures. Ces composés peuvent subsister dans les aliments, y compris après disparition des moisissures. Aussi, afin d’assurer la Anne PIRAM ‐ Josiane MOLINET‐ 41CA5 Page5 Module41CA5‐Méthodesséparatives
bonne qualité alimentaire de matières premières (céréales par exemple) il est nécessaire de vérifier que leur concentration ne présente pas de risque sanitaire. L’analyse par chromatographie en phase gazeuse du nivalénol et du déoxynivalénol conduit à la détermination des temps de rétention suivants : -
nivalénol : 3,9 min déoxynivalénol : 4,1 min La colonne chromatographique utilisée présente la même efficacité vis‐à‐vis des 2 solutés : N=8671 Conditions expérimentales : -
Colonne capillaire OPTIMA 1701, ef 0,35µm, 10m x 0,53mm Injection : 1µL Gaz vecteur : N2, 1.2 mL/min Température : 260°C Détecteur : 63Ni‐ECD 1‐
Calculez le volume mort (mL) et le temps mort (min). 2‐
Calculez le facteur de sélectivité entre les 2 solutés analysés 3‐
Calculez la résolution dans ces conditions d’analyse 4‐
Combien de plateaux théoriques seraient nécessaires pour obtenir un facteur de résolution de 1,5. 5‐
Sachant que le laboratoire dispose de colonnes analogues (en termes de diamètre interne et de phase stationnaire) de longueurs 25 et 50m. Quelle colonne faudrait‐il utiliser pour obtenir la séparation du nivalénol et du déoxynivalénol avec une résolution de 1,5 et un temps d’analyse minimal. 6‐
Calculez le temps d’analyse sur cette nouvelle colonne Exercice4:Etudedecas
Extractiondesucresparchromatographieliquidepréparative
Afin d’extraire des solutés d’un échantillon par chromatographie préparative, une étude de la rétention des analytes en chromatographie analytique est réalisée au préalable afin de déterminer les conditions chromatographiques permettant leur séparation (choix de la phase stationnaire et de la phase mobile notamment) Une séparation de 4 sucres par chromatographie en phase liquide analytique a été obtenue dans les conditions expérimentales suivantes : Anne PIRAM ‐ Josiane MOLINET‐ 41CA5 Page6 Module41CA5‐Méthodesséparatives
Colonne : supelcosil‐NH2, 10cmx2,1mm, dp 3,5µm Phase mobile : eau/éthanol/acétonitrile :17/8/75 : v/v/v ; D=0,4mL/min Détecteur : réfractomètre Dans ces conditions d’analyse, le temps mort est de 1,1min Les temps de rétention mesurés sont reportés ci‐dessous : Fructose : 3,2 min Sorbitol : 3,5 min Glucose : 4,2 min Maltose : 8,9 min Est‐il possible de séparer de ces 4 sucres sur une colonne préparative de 4900 plateaux garnie de la même phase stationnaire (on considérera que dans ces conditions les facteurs de rétention sont les même pour les 2 colonnes), en conservant une résolution supérieure à 1,5 ? 1‐
2‐
3‐
4‐
Déterminez les facteurs de rétention pour chacun des solutés ainsi que la sélectivité entre les pics adjacents Identifier les 2 composés « les plus difficiles » à séparer, justifiez A l’aide de la relation de Purnell, calculez la résolution qui serait obtenue sur la colonne préparative Conclure Exercice5:Etalonnageinterne
Soient deux mélanges de 2 substances (A et B). On additionne à chaque prise d’essai une certaine quantité de l’étalon interne comme indiqué dans le tableau et on note les surfaces de pic. A B A+B Etalon interne Mélange 1 Masse (mg) M1A M1B 250,42 84,12 Ai 295 092 219 025 225 684 Mélange 2 Masse (mg) M2A M2B 228,51 85,98 Ai 212 083 306 208 255 022 Questions : 1‐ Quels sont les critères de sélection d’un étalon interne ? 2‐ Pour quel type d’analyse choisit‐on l’étalonnage interne ? Enoncez les avantages et les inconvénients de l’étalonnage interne par rapport à l’étalonnage externe. 3‐ Calculer les masses et le pourcentage relatif de chaque composé dans chaque mélange. Anne PIRAM ‐ Josiane MOLINET‐ 41CA5 Page7 Module41CA5‐Méthodesséparatives
TDChapitre3:Analysequantitative
Exercice1:Normalisationinterne
On veut déterminer par la méthode de normalisation interne la composition massique d’un échantillon constitué de 4 esters de l’acide butanoïque. Une solution de référence de ces quatre esters (concentrations massiques connues) conduit aux valeurs suivantes des coefficients de réponse relatifs de butanoates de méthyle (ME), d’éthyle (EE) et de propyle (PE) par rapport au butanoate de butyle (BE) : KME/BE = 0,919 KEE/BE = 0,913 KPE/BE = 1,060 On relève sur le chromatogramme les grandeurs ci‐dessous : N° pic 1 2 3 4 tR (min) 2,54 3,47 5,57 7,34 Composé Méthyl ester (ME)
Ethyl ester (EE) Propyl ester (PE) Butyl ester (BE) Aire (unités arbitraires) 2340,1 2359,0 4077,3 4320,7 Questions : 1‐ Déterminez la composition massique de ce mélange par normalisation interne sans coefficients de réponse 2‐ Déterminez la composition massique de ce mélange par normalisation interne avec coefficients de réponse Exercice2:Etalonnageinterne
Une essence de girofle est un produit naturel constituée de 82 à 95% d’eugénol, 10 à 12% d’acétyleugénol, 5 à 12% de ‐caryophyllène, quelques traces de furfural, de vaniline et d’heptane‐2‐one. On souhaite doser, par chromatographie en phase gazeuse, l’eugénol contenu dans une essence de girofle. Le dosage est réalisé par étalonnage interne en utilisant la undécan‐2‐one comme étalon interne. Les données relatives à ces expérimentations sont reportées ci‐dessous : Expérience 1 : Masse d’eugénol pesée : mi = 0,2751 g Masse d’étalon mE = 0,1500 g Analyse de 3 chromatogrammes N° injection 1 2 3 Surface du pic de l’eugénol Ai
(mV/s) 190 777
189 869 191 291 Surface du pic de l’étalon AE
(mV/s) 123 890 122 976 124 607 Anne PIRAM ‐ Josiane MOLINET‐ 41CA5 Page8 Module41CA5‐Méthodesséparatives
Analyse des échantillons : EG‐1 : Masse d’échantillon pesée : mech = 0,3828 g Masse d’étalon : mE = 0,1601 g EG 2 : Masse d’échantillon pesée : mech = 0,4545 g Masse d’étalon : mE = 0,1736 g Analyse de 3 chromatogrammes N° injection 1 2 3 EG‐1
Ai (mV/s) 235 295 236 709 234 427 EG‐2 AE
(mV/s) 140 618
140 791 140 121 Ai
(mV/s) 225 042
226 138 230 691 AE (mV/s) 146 600 149 931 150 280 Questions : 1‐
2‐
Quels sont les avantages et inconvénients de l’étalonnage interne ? Quel est l’objectif de l’expérience 1? Calculer la quantité d’eugénol dans EG‐1 et dans EG‐2. Exercice4:
Un liquide A est composé d’un mélange de 2 solutés : hexane et X à identifier. L’analyse sur une colonne de L = 15 m et de Vm = 3,6cm3 donne 2 pics dont la distance de rétention est indifféremment 65 et 75 mm et de largeur de pic à la base () respectivement de 2,2 et 2,6 mm. Le débit de gaz vecteur D = 1,2 cm3/min et la vitesse de défilement de papier ue = 10 mm/min. 1‐ Calculer le facteur de capacité des deux pics 2‐ Calculer le facteur de résolution entre les 2 pics. 3‐ Calculer l’efficacité de la colonne, son efficacité au mètre et la hauteur d’un plateau théorique. Dans des conditions identiques, l’analyse CPG d’un mélange contenant - 560 mg d’heptane - 600 mg d’octane - 320 mg de pentane - 750 mg de liquide A Donne un chromatogramme à 5 pics dont les distances de rétention réduites et les aires sont données dans le tableau ci‐dessous : Pic 1 Pic 2 Pic 3 Pic 4 Pic 5 d’R (mm)
24,5
35 45 82 150 A (mm2) 1920 2900 2100 3360 3600 On donne les indices de rétention selon KOVATS pour différents solutés dans ces conditions de travail : Anne PIRAM ‐ Josiane MOLINET‐ 41CA5 Page9 Module41CA5‐Méthodesséparatives
- méthyl‐2, propanone 530 - Propanol 575 - Méthyl‐2, pentane 560 - Pentanone 620 4‐ Faire l ‘analyse qualitative. 5‐ Donner la composition pondérale du liquide A : - en considérant que l’hexane et le soluté X ont même coefficients de réponse. - en utilisant comme coefficients de réponse des valeurs à déduire des données Exercice5:Dosaged’unsolutédansunematricecomplexe
L’éphédrine est un composé pharmaceutique analogue à l’adrénaline, dont l’usage est fréquemment détourné à des fins de dopage dans le milieu sportif en raison de son effet stimulant. Cette molécule entre donc dans la liste des produits ciblés lors des contrôles de dopage effectués dans le sport de haut niveau. Les échantillons analysés dans ce cadre sont soit des urines, soit du plasma sanguin. Dans chacun de ces cas, la matrice à analyser est particulièrement complexe. Un échantillon d’urine d’un compétiteur est partagé en 4 fractions de 1mL. 0, 5, 10 et 15µL d’une solution mère (mélange éphédrine, noréphédrine et méthyléphedrine) à 500µg/mL sont respectivement ajoutés à chacune des fractions (A1 à A4). Chaque solution est analysée et les aires des pics chromatographiques sont relevées : A1 A2 A3 A4 éphédrine noréphedrine méthyléphedrine 25032 5360 45807 35670 20945 51451 46003 37078 56451 56965 52576 62095 1‐ Quelle est la méthode de dosage utilisée, précisez les avantages et les inconvénients de cette méthode
2‐ Calculer la masse de l’ajout dans chacune des solutions 3‐ Tracer sur papier millimétré l’évolution de l’aire du pic chromatographique mesurée en fonction de la masse de l’ajout (axe de abscisses : ‐25 à 10µg/L, axe des ordonnées : 0 à 8000) 4‐ Expliquer comment peut‐on déterminer la concentration initiale de la solution et le démontrer 5‐ Quelles sont les concentrations de chaque soluté dans l’échantillon ? Précisez si la méthode permet de déterminer précisément ces concentrations, justifiez Anne PIRAM ‐ Josiane MOLINET‐ 41CA5 Page10 Module41CA5‐Méthodesséparatives
Exercice6:Contrôleduniveaudepiquantd’unpiment
Les capsaïcinoïdes constituent une famille de molécules à l’origine de la saveur piquante de certains aliments. La capsaïcine et la dihydrocapsaïcine, qui représentent 80 à 90% des capsaïcinoïdes contenus dans les piments et poivrons sont représentées ci‐dessous : Les capsaïcinoïdes sont notamment utilisés par l’industrie agroalimentaire pour la préparation de plats dits « épicés ». La quantité de capsaïcine détermine le niveau de piquant du piment selon la nomenclature ci‐dessous (CODEX STAN 307‐2011): La quantité de piments ajoutée aux préparations alimentaires doit être ajustée en fonction de leur teneur en capsaïcine. Afin de contrôler le pouvoir piquant des piments utilisés, une analyse de ces matières premières est réalisée selon le protocole suivant : Préparation d’échantillon : 125mg de piment sont broyés et extraits par 100mL d’éthanol. Le solvant est évaporé et la solution ainsi obtenue purifiée sur colonne de silice C18. Le volume de l’extrait est finalement ramené à 5mL. Analyse de l’extrait par chromatographie liquide: Colonne: Shim‐Pack® VP‐ODS 150x4,6 mm; 5µm Elution: eau/acétonitrile/acide formique 39/59/2 (v/v/v) Débit : 1mL/min Volume d’injection : 20µL Détection : 280nm Pour réaliser cette quantification, des solutions étalon de capsaïcine à 10, 20, 50, 100 et 200 mg/L respectivement sont analysées. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau ci‐dessous : Anne PIRAM ‐ Josiane MOLINET‐ 41CA5 Page11 Module41CA5‐Méthodesséparatives
solution Etalon 10mg/L Etalon 20mg/L Etalon 50mg/L Etalon 100mg/L Etalon 200mg/L Echantillon Aire (mAU) 7,30.103 1,36.104 3,25.104 6,40.104 1,27.105 9,55.104 1‐ En utilisant la relation de base d’analyse quantitative, exprimez l’évolution de l’aire du pic chromatographique en fonction de la concentration de la solution. 2‐ Déterminez l’équation expérimentale de la droite d’étalonnage par régression linéaire. 3‐ Quel est le coefficient de réponse absolu de la capsaïcine par cette méthode ? 4‐ Après avoir déterminé la concentration en capsaïcine dans la solution injectée, déterminez le pourcentage massique de capsaïcine dans le piment étudié. Afin d’assurer la qualité de la méthode de quantification utilisée. L’opérateur ayant réalisé la manipulation ci‐dessus analyse à 4 reprises un échantillon de piment de référence dont la teneur en capsaïcine est de 0,57%. L’incertitude de la méthode a été préalablement déterminée comme étant de +/‐0,04%. Les teneurs qu’il mesure sont respectivement de 0,64%, 0,62%, 0,61%, 0,63%. 5‐ La méthode d’analyse est‐elle juste ? La méthode d’analyse est‐elle fidèle ? Données sur la régression linéaire: Si les points d’étalonnage sont décrits par une équation de type y  ax  b , on peut déterminer la pente a et l’ordonnée à l’origine b de la régression linéaire selon les relations suivantes : n
Pente : a 
_
_
 ( xi  x )( yi  y )
i 1
n
_
 ( xi  x ) 2
_
_
Ordonnée à l’origine : b  y  a x i 1
_
_
avec : x la valeur moyenne de la variable x et y la valeur moyenne de la variable y Anne PIRAM ‐ Josiane MOLINET‐ 41CA5 Page12 Module41CA5‐Méthodesséparatives
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TDChapitre4:Chromatographie
liquidehauteperformance
Exercice1:
Les appareils actuels de CLHP peuvent utiliser des colonnes de diamètre interne dc =300µm, pour
lesquelles le débit optimum conseillé est de 4 µL/min.
1-
Montrer par un calcul simple que ce débit conduit pratiquement à la même vitesse linéaire
de la phase mobile que pour une colonne de même type mais d’un diamètre standard de 4,6
mm pour laquelle le débit conseillé est de 1 mL/min.
2-
La séparation d’un échantillon comportant 16 HAP a été effectuée sur une colonne de
type RP-18 (Lc = 25 cm, dc = 300µm). Le débit de la phase mobile (acétonitrile/eau) est de
4µL/min. L’un de ces HAP a un temps de rétention de 48 min. Calculer le volume de rétention
de ce composé. Que peut-on en conclure ?
3-
On dispose de deux colonnes remplies de la même phase stationnaire, l’une a un
diamètre intérieur dc=4,6 mm et l’autre, de 300µm. Les colonnes ont mêmes longueur et taux
de remplissage (Vs/VM). On décide de les utiliser successivement avec le même
chromatographe et dans des conditions identiques, avec les débits conseillés ci-dessus pour
chacune d’elles. On injecte la même quantité d’un même composé dans les deux
expériences.
a- Quand on passe d’une colonne à l’autre, le volume de rétention (ou d’élution) du composé
est-il modifié ?
b- Si la sensibilité du détecteur n’a pas été modifiée entre les deux expériences, l’intensité
du pic correspondant sera-t-elle différente ?
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Exercice2:
On étudie par CLHP la séparation de deux composes A et B avec une colonne de type RP-18. La
phase mobile est un mélange binaire d’eau et d’acétonitrile. On admettra qu’il existe une relation
linéaire entre le logarithme de facteur de capacité et le pourcentage d’acétonitrile du mélange binaire
eau/acétonitrile utilisé. A partir de 2 chromatogrammes obtenus l’un avec pour phase mobile un
mélange eau/acétonitrile 70 /30 (v/v) et l’autre avec un mélange eau/acétonitrile 30 /70 (v/v), les
équations des deux droites sont :
Pour le composé A : log kA = - 6,075 x 10-3 (% MeCN) + 1,3283
Pour le composé B : log kB = - 0,0107 (% MeCN) + 1,5235
a) Trouver la composition de la phase binaire qui conduirait à un facteur de sélectivité de 1.
b) On suppose que pour chaque composé, la largeur du pic correspond sur le chromatogramme
à mi-hauteur est la même et que l’efficacité de la colonne n’est pas modifiée suivant la
composition de la phase mobile. La résolution entre les deux pics est-elle meilleure pour la
phase mobile contenant 70% d’eau ou 30% d’eau ? Montrer l’intérêt pratique du choix
précédent.
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Annexe1
ChromatogrammesrelatifsauTD1–exercice1
Benzène, D=1,5mL/min =254nm Naphtalène, D=1,5mL/min =254nm Anne PIRAM ‐ Josiane MOLINET‐ 41CA5 Page16 Module41CA5‐Méthodesséparatives
Bulle d’air, D=1,5mL/min Anthracène, D=1,5mL/min =254nm Anne PIRAM ‐ Josiane MOLINET‐ 41CA5 Page17 Module41CA5‐Méthodesséparatives
Benzène, D=1,0mL/min =254nm Benzène, D=0,7mL/min =254nm Anne PIRAM ‐ Josiane MOLINET‐ 41CA5 Page18 Module41CA5‐Méthodesséparatives
Mélange benzène/naphtalène/anthracène, D=1,5/min =254nm Anne PIRAM ‐ Josiane MOLINET‐ 41CA5 Page19 Module41CA5‐Méthodesséparatives
Annexe2
ChromatogrammesrelatifsauTD2–exercice2
Un agrandissement du pic chromatographique est proposé page suivante, pour mesurer avec plus de précision les largeurs. Anne PIRAM ‐ Josiane MOLINET‐ 41CA5 Page20 Module41CA5‐Méthodesséparatives
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