Transcript Production de métabolites secondaires par biologie

Sylvie Lautru
Les métabolites secondaires
•
Petites molécules produites par les plantes et les microorganismes
– plantes
Papaver somniferum
Codéine
– micro-organismes
Penicillium notatum
Pénicilline
•
Non indispensables à la survie dans les conditions de laboratoire
•
Des fonctions biologiques encore peu connues mais très variées
•
Diversité des structures chimiques et des activités biologiques
Morphine
Quelques exemples
Antibactériens
HO
HO
H2 N
H
N
H
OH
OH
OH
O
S
O
OHC OH
N
O
COOH
NHMe
H 2N
O
O
O
Me
Me
HO
NH
O
HO
H
NH
HN
Benzylpenicilline
HO
OH
NH
N
H
NH
O
NH2
(chélateur de fer)
O
O
Cl
O
O
Cl
OH H
N
O
O
HO2C
OH
Sidérophore
OH
OH
O
H
N
N
H H
NHMe
N
H
O
O
NH2
OH
Streptomycine
HO
Vancomycine
OH
Desferrioxamine
Immunosuppresseurs
Anticancéreux
MeO
MeO
H
O
O
O
H
O
OH
O
MeN
N
O
MeN
O
H
OMe
H
O
Me
N
OH
O
N
H
HO
N
Me H
O
AcO
NMe
O
O
NH
O
O
H
N
O
N
Me
O
H
N
OH
OMe O
OH
O
OH
OH
O
NMe
O
O
O
OH
OH
O
O
H
O OAc
O
Taxol
OH
Tacrolimus (FK 506)
O
H
N
Cyclosporine
Structures rouges: peptides; bleues: polycétides; violettes: aminoglycosides; noires: terpènes; vert: autres
O
O
NH2
OH
Daunorubicine
Quelques exemples
Anticholestérol
Lovastatine
Antidiabétique
Antiparasitique
Ivermectine
Herbicide
Bialaphos
Acarbose
Structures rouges: peptides; bleues: polycétides; violettes: aminoglycosides; noires: terpènes; vert: autres
Méthodes classiques de production
Fermentation
Microorganismes
Extraction/
purification
Produits
naturels
Pénicilline G
Hémi
synthèse
Analogues
de produits
naturels
Amoxicilline
Difficultés potentielles: rendement, disponibilité de la matière première…
La biologie synthétique
Biologie synthétique: design et ingénierie de systèmes biologiques ainsi que le
re-design de systèmes biologiques existants (naturels).
La biologie synthétique
Biologie synthétique: design et ingénierie de systèmes biologiques ainsi que le
re-design de systèmes biologiques existants (naturels).
Pour la synthèse de métabolites secondaires: design et ingénierie de
voies de biosynthèses ainsi que le re-design de voies de biosynthèses
existantes (naturelles).
Re-design de voies existantes
Extraction/
purification
Produits
naturels
Armoise annuelle
(Artemisia annua)
Artémisinine
Reconstitution d’une
voie de biosynthèse de
l’acide artémisinique
Levure
(Saccharomyces cerevisiae)
Photochimie
Acide artémisinique
Re-design de voies existantes
Paddon and Keasling (2014) Nature Reviews Microbiology 12:355
Re-design de voies existantes
Refactoring the Silent Spectinabilin Gene Cluster Using a Plug-and-Play Scaffold
Re-design de voies existantes
 Utilisation d’hôtes hétérologues: nécessité d’optimiser l’usage des
codons
 Certaines enzymes auxiliaires ou précurseurs présents chez l’hôte
naturel peuvent être absents chez l’hôte hétérologue
 Optimisation de la production: recours à la biologie des systèmes
pour faire des modèles de réseaux métaboliques et optimiser les
flux de métabolites
Reprogrammation et manipulation de voies
de biosynthèse
Fermentation
Produits
naturels
Hémi
synthèse
Analogues
de produits
naturels
Synthèse
chimique
Mutasynthèse
Précurseurs
non naturels
Biosynthèse
combinatoire
Microorganismes
Délétion de
gènes
Ensemble de gènes ou de groupes
de gènes de biosynthèse
Groupe de gènes de biosynthèse
Les synthétases de peptides non
ribosomiques
synthétase 1
synthétase 2
module 2
module 1
A
PCP
H3N
E
COO
R1
C
A
H 3N
PCP
module 3
C
A
COO H3N
R2
PCP
COO
R3
module 4
C
A
H 3N
PCP
COO
R4
module 5
C
A
H3 N
PCP
TE
COO
R5
NRPS: méga-complexes enzymatiques organisés en modules (un
module par acide aminé incorporé) eux-mêmes divisés en domaines
La gramicidine S synthétase, une NRPS
modèle
synthétase 1
synthétase 2
module 2
module 1
Phe
PCP
E
C
Pro
PCP
C
Val
C
PCP
Orn
SH
SH
SH
module 4
module 3
PCP
module 5
C
Leu
TE
PCP
O
SH
O
NH
O
HN
H2N
O
O
NH
O O
O
NH HN
O
NH
O
N
HN
O
NH
N
O
NH HN
O O
O
NH2
HN
D
O
H2N
N
NH2
La diversité au sein des NRPS
Ox
Cy
F
A PCP
Module
d’initiation
C
Me
A PCP
Module
d’élongation
Cy: domaine d’hétérocyclisation
Me: domaine de méthylation
E: domaine d’épimérisation
Red: domaine réductase
Red
E
C PCP
C
A PCP TE
Module de
terminaison
F: formylation
Ox: oxydation
Comment fabriquer de nouvelles
molécules à partir des NRPS?
module 2
module 1
A
PCP
A
Me
Rajouter des
domaines
optionnels
C
A
PCP
B
module 4
module 3
C
A
PCP
C
A
C
A’
Changer un
domaine A
pour un autre
Changer la
spécificité d’un
domaine A
C’
PCP
module 5
C
A
PCP’
Te’
PCP
Te
D
A’
PCP’
Changer un
module complet
C’
A’
Changer les domaines
COM (changer des
sous unités complètes)
Quelques exemples
- Ingénierie du site actif d'un domaine d'adénylation
Eppelmann et al. (2002), Biochemistry 41, 9718-9726
Quelques exemples
- Remplacement d'un domaine AT par un autre
Erythromycine A
Stassi et al. (1998), PNAS 95, 7305-7309
Vers des produits non naturels
Modification du squelette (échange de
domaines ou modules)
Précurseurs non-naturels
(mutasynthèse)
Modification de la
décoration du squelette
(glycosylation,
hydroxylation…)
Principe de la mutasynthèse
Adapté de Weissman, (2007) Trends in Biotechnology, 25:139
Quelques exemples
Cgc4
Cgc6
Cgc5
3-aminopropionamidine
O
HN
H2N
H
N
O
O
NH
H
N
N
CH3
N
H
N
O
Congocidine
NH
CH3
NH2
HN
H2N
H
N
O
NH
H
N
N
CH3
N
H
N
O
NH
CH3
Fluorocongocidine
F
NH2
Quelques exemples
Gregory et al. (2005), Angew. Chem. Int. Ed. 44, 4757
Les étapes de modifications post-NRPS ou
post-PKS
Blanchard & Thorson (2006), Current Opinion in Chemical Biology 10: 236
Vers la biologie synthétique et la
biosynthèse combinatoire
54 PKS trimodulaires non naturelles
96% produisent le polycétide escompté
Menzella H et al. (2007), Chemistry & Biology 14, 143-151
Résumé & Conclusion
• La biologie synthétique des produits naturels
permet:
– de "re-créer" des voies de biosynthèse naturelle dans des
hôtes hétérologues (production/rendement plus important
que dans l’hôte naturel)
– de synthétiser de nouvelles molécules par biosynthèse
combinatoire et mutasynthèse
• Discipline à l’interface de la biologie et de la chimie,
et pouvant faire appel à des compétences en
mathématiques (modélisation)
Résumé & Conclusion
• Limites actuelles:
– Absence de précurseurs sans l’hôte hétérologue
– Difficulté d’obtenir de bon rendements pour la synthèse de
nouvelles molécules
rôles des spécificités de substrats des enzymes, des
interactions protéines, du transport des
mutasynthons…
Remerciements
Equipe MMA
LC-MS
Jean-Luc Pernodet
Emmanuelle Darbon
Alain Raynal
Corrine Saulnier
Florence Lorieux
Drago Haas
Jerzy Witwinowski
Soumaya Najah
Laura Giudici
CEA/Saclay
Muriel Gondry et son équipe
Robert Thai
Previous members
Audrey Vingadassalon
Priscillia Pierre-Elies
Pierre-Alexandre Mariel
Maud Juguet
François-Xavier Francou
Claude Gerbaud
ActinoGEN
Analyses et synthèses chimiques
University of Warwick
Greg Challis et son équipe Lijiang Song
Christophe Corre
Université Paris Descartes
Luc Demange
Thomas Lombès
Laurent Micouin
ICSN
Jamal Ouazzani et son équipe
Géraldine Le Goff