Transcript Dolo*itev porazdelitvenega koeficienta amfifilnih molekul

Vpliv porazdelitvenega
koeficienta amfifilnih
molekul na kontrast pri
flourescenčni
mikroskopiji
Avtor:Boštjan Kokot
Mentor: prof. dr. Janez Štrancar
Somentor: dr. Tilen Koklič
Zakaj flourescenčna
mikroskopija?
Flourescenca
• Molekula absorbira svetlobo ene
valovne dolžine in odda svetlobo
daljše valovne dolžine(Stokesov
premik).
• Vidna svetloba λ=400-700nm
• Flourescenca možna tudi pri UV/IR
Diagram Jablonskega
Stokesov premik
Postavitev osnovnih elementov za flourescenčne poksuse
2
1
Zakaj bi se sploh lotili teme
porazdelitvenega koeficienta?
𝑉
𝑛2
𝑛1𝑉
𝑛1𝑚
Kaj vpliva na to da je molekul
na nekem mestu več?
• Zaradi medatomskih in medmolekulskih interakcij:
• Hidrofilnost
• Hidrofobnost
• Amfifilnost
• Glede na zgradbo molekul:
•
•
Lastnosti atomskih skupin
Zaporedje atomskih skupin
• Hidrofilna (polarna) molekula
•
Dolžina molekule
• Hidrofobna (nepolarna) molekula
• Amfifilna molekula
Amfifilne molekule
Hidrofilna
glava
Hidrofoben
rep
• So večinoma slabo topne v vodi
• Namesto čistih raztopin tvorijo
koloidne dipserzije
• So površinsko aktivne molekule
• Pri večjih koncentracijah v snovi
tvorijo agregate
Amfifilni označevalci
• Hidrofilna glava
• Hidrofoben rep
Agregati amfifilnih molekul
• Micela
• Ravni dvosloj
• Liposomi
Enolamelarni vesikli
Večlamelarni vesikli
Liposomi so preprost
model za celično
membrano
Prosta energija
• Razlike prostih entalpij G ‚poganjajo‘ transport snovi.
G = 𝑝𝑉 + 𝐹
• Prosta energija in prosta entalpija sta pri urejanju bioloških
sistemov enakovredni, ker je pV konstanten:
∆𝐺 = 𝐺1 − 𝐺2 = 𝐹1 − 𝐹2 = ∆𝐹
• Prosta energija ureja sistem – določa ravnovesno stanje.
∆𝐺 = 0 = ∆𝐹
Za ravnovesni sistem.
𝐹 = 𝐸 − 𝑇𝑆
Dvofazni sistem v ravnovesju
Oznake:
ΔE – energijska razlika v obeh prostorih
Nk – število konformacij
ζ – razmerje velikosti konformacijskih prostorov
c – koncentracija
Kj – porazdelitveni koeficient
j – štejemo po vseh molekulah v sistemu
Δ𝐹 = 0 za fazi v ravnovesju
𝐸 − 𝑇𝑆
1
= 𝐸 − 𝑇𝑆
2
𝐸𝑗,1 + 𝑘𝐵𝑇log 𝑐𝑗,1 𝑁𝑘 𝑗,1
=
𝐸𝑗,2 + 𝑘𝐵𝑇log 𝑐𝑗,2 𝑁𝑘 𝑗,2
𝑗
𝑗
log
𝑐𝑗,2
𝐾𝑗 =
𝑐𝑗,1
𝑗 𝑐𝑗,1 𝑁𝑘 𝑗,1
𝑗 𝑐𝑗,2 𝑁𝑘 𝑗,2
𝑗
=
𝑗 𝐸𝑗,2
−
𝑘𝐵 𝑇
𝑐𝑗,2 𝑁𝑘 𝑗,2
= 𝑒−
𝑐𝑗,1 𝑁𝑘 𝑗,1
𝑗 𝐸𝑗,1
𝑗 ∆𝐸𝑗
𝑘𝐵𝑇
𝜁𝑗 =
𝑗
𝐾𝑗 𝜁𝑗 =
𝑗 ∆𝐸𝑗
− 𝑘 𝑇
𝑒
𝐵
𝑁𝑘 𝑗,2
𝑁𝑘 𝑗,1
Ocena koeficienta za maščobno
molekulo v vodi
• Imamo 1 molekulo maščobe (MM)
• Obkoržena je z molekualmi vode
• j teče od 1 do 𝑛𝑉 + 1 kolikor je molekul v sistemu
𝑗
𝐾𝑗 𝜁𝑗 =
𝑗 ∆𝐸𝑗
− 𝑘𝑇
𝑒
𝐾𝑝 =
𝑛
∆𝐸𝑝 + 𝑉 Δ𝐸𝑉
2
−
𝑘𝑇
𝑒
𝜁𝑝 𝐾𝑉 𝜁𝑉
𝜁𝑉 - razmerje velikosti konformacijskih prostorov vode
𝐾𝑉 - porazdelitveni koeficient vode
Δ𝐸𝑝 - energijska razlika MM
𝜁𝑉 𝐾𝑉 Δ𝐸𝑝
Δ𝐸𝑉
Δ𝐸𝑉 - energijska razlika vode
2 2
0
-0,1 eV
𝜁𝑝 - razmerje velikosti konformacijskih prostorov MK
𝑛𝑉 - število molekul vode
𝑛𝑉
𝜁𝑝
𝑛𝑉 Kp
106
30
102
107
25 10−1
106
25
1
105
35
105
Porazdelitveni koeficient
𝐾𝑝 =
𝐾𝑝 =
𝑐1𝑚
𝐶 𝑉
1
𝑛1𝑚 𝑉1𝑉
𝑉1𝑚 𝑛1𝑉
Indexi
m, 1 - koncenctracija MM v
membrani
V, 1 – koncentracija MM v vodi
𝑛1𝑚 𝑉1𝑉
= 𝑣 𝑚
𝑛1 𝑉1
• 𝐾𝑝 dosega vrednosti:
- med 1 in 1000 za maščobne molekule (MM)
- ≪ 1 za hidrofilne molekule
𝑉1𝑉
𝑛1𝑉
𝑉1𝑚
𝑉2𝑉
𝑛1𝑚
𝑛2𝑉
• Kakšen bo kontrast pri Kp=100?
𝑛1𝑚
𝑛1𝑣
=
𝑉1𝑚
𝐾𝑝 𝑉 𝑉
1
3
≅ 1 piksel z membrano
4nm
160 nm
𝑝𝑖𝑘𝑠𝑒𝑙 𝑧 𝑚𝑒𝑚𝑏𝑟𝑎𝑛𝑜
𝑛1𝑚 + 𝑛1𝑉 3 + 1
𝐾𝑜𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑡 ∝
=
≅
=4
𝑝𝑖𝑘𝑠𝑒𝑙 𝑏𝑟𝑒𝑧 𝑚𝑒𝑚𝑏𝑟𝑎𝑛𝑒
𝑛2𝑉
1
Primerjava kontrastov
Problemi pri uporabi takih
molekul-npr. kontrast slik
• Več faz med katerimi prehajajo amfifilne molekule:
-Kot primer prenasičenost raztopine z amfifilnimi molekulami:
tvorba micel in drugih agregatov
• Močna/šibka hidrofobnost/hidrofilnost amfifilnih molekul
- Šibka hidrofilnost (hiter prehod v vse notranje membrane)
- Visoka hidrofilnost (amififil ostane na površini membrane)
- Močan hidrofilen in hidrofoben del na isti molekuli, povzroči
raztapljanje membrane
 Retultat : slabo kontrast pri flourescenčni mikroskopiji
Problem – tvorba agregatov
• Maščobne
molekule v večih
fazah
• Micele, liposomi,
monomeri
• Že pri dveh fazah
dobimo sistem
sklopljenih
diferencialnih
enačb
K1
K2
4nm
160 nm
Povzetek
•
•
•
•
•
•
Osnove flourescnce
Kaj je kontrast
Amfifilne molekule: hidrofobnost, hidrofilnost
Zaradi te narave, tvorba agregatov
Definicija porazdelitvenega koeficienta
Energijsko/entropijsko delikatno ravnotežje preprostega
sistema maščobna molekula-voda
• Primerjava slike dveh kontrastov
• Problem tvorbe agregatov (micel) pri kontrastu, ko slikamo s
flourescenčno mikroskopijo
Hvala za vašo pozornost. 
Meritev porazdelitvenega
koeficienta_backup
• Opazovanje enega značilnih
parametrov fluorescence, ko
eksperimentalno
spreminjamo koncentracijo
maščobne faze v sistemu
• Kvantni izkoristek,
absorpcija, anizotropija,
življenski čas fluorescence,…
• Enačba na desni predstavlja
odvisnost parametra od
spreminjanja koncentracije
𝑛
γ-molarni volumen lipida: γ𝐿 = 𝑉𝐿
𝐿
[L]-koncentracija fosfolipida
p-spreminjajoči se parameter (A, φ, τ,…)
Z nekaj truda do boljše slike