Transcript m/z - MALDI ToF

Spektrometria mas MALDI-TOF/TOF
Kazimierz Dąbrowski
Katedra Chemii i Technologii Polimerów
Wydział Chemiczny PW
Warszawa, 16.04.2012
Najważniejsze odkrycia w historii spektrometrii mas
Rok
1911
1918
1930
1942
1946
Odkrycie
Zbudowanie pierwszego spektrometru mas
Opracowanie źródła jonów EI
Zastosowanie spektrometrii mas w chemii organicznej
Pierwszy sprzedany spektrometr mas
Analizator czasu przelotu (TOF)
Nazwiska badaczy
Joseph John Thomson
Arthur Jeffrey Dempster
R. Conrad
Consolidated Energy Corporation
William E. Stephens
1953
Spektrometr o podwójnym ogniskowaniu
E. G. Johnson i A. O. Nier
1953
1958
Kwadrupolowy analizator masy
Połączenie spektrometru mas z chromatografem gazowym (GC)
W. Paul i H. Steinwedel
1966
Sekwencjonowanie peptydów przy pomocy spektrometru mas
1966
1968
1981
Jonizacja Chemiczna (CI)
Jonizacja przez Elektrorozpylanie (ESI)
Metoda jonizacji przez bombardowanie szybkimi atomami (FAB)
Opracowanie metody jonizacji przez desorpcję laserem przy udziale
matrycy – MALDI (Nagroda Nobla z Chemii w 2002 roku)
1983
1984
Pułapka jonowa
1984
Wykorzystanie elektrorozpylania (ESI) do analizy biopolimerów
(Nagroda Nobla w 2002 roku)
K. Biemann, C. Cone, B. R. Webster i
B. P. Arsenault
B. Munson i F. H. Field
Malcom Dole
Michael Barber
Koichi Tanaka, Michael Karas i Franz
Hillenkamp
G. C. Statford, P. E. Kelly, J. E. P.
Syka, W. E. Reynolds i J. F. J. Todd
Gall Lydia (ZSRR), John Fenn (USA)
Podstawowe definicje
Spektrometr masowy – instrument pozwalający na precyzyjny pomiar stosunku masy do ładunku (m/z)
analizowanych substancji.
Rozdzielczość spektrometru – wartość liczbowa informująca o możliwości rozróżnienia na widmie masowym pików o
zbliżonych masach. W przypadku pojedynczego piku wartość określająca dokładność oznaczenia masy cząsteczkowej
(atomowej) substancji analizowanej.
Jeśli spektrometr masowy w danym momencie analizy posiada rozdzielczość R=1000 istnieje możliwość rozróżnienia
pików o m/z=1000 oraz m/z=1001. Dla izolowanego piku rozdzielczość definiuje jego szerokość połówkową, tzn. dla
R=1000 i piku o m/z=1000 stosunek jego wysokości do szerokości w 0,5 wysokości wynosi co najmniej 10
(H/L0,5h>=10)
Jon molekularny – jon obdarzony ładunkiem (ładunkami) powstający w wyniku fragmentacji próbki w źródle jonów
Jon fragmentacyjny – jon powstały w wyniku spontanicznej fragmentacji substancji (np. podczas jonizacji metodą EI)
lub uzyskany techniką tandemowej spektrometrii masowej. Dostarcza informacji o strukturze substancji
analizowanej.
Addukt - jon powstały poprzez przyłączenie do analizowanej substancji np. jonu sodowego
Proteom - PROTEin complement of the genOME (ogół białek kodowanych przez genom)
Dalton - jednostka masy, dokładnie odpowiada 1,0000 na skali mas atomowych
Dekonwolucja - uzyskanie rzeczywistej masy substancji z widma pików wielokrotnie zjonizowanych
Matryca - niskocząsteczkowe związki organiczne absorbujące promieniowanie lasera.
Najczęściej stosowane skróty
EI (Electron Impact) - jonizacja elektronami
MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization) - jonizacja laserem wspomagana matrycą
ESI (Electrospray Ionization) - jonizacja przez rozpylanie w polu elektrycznym
HPLC (High Performance Liquid Chromatography) - wysokosprawna chromatografia cieczowa)
MS/MS (Tandem Mass Spectrometry) - tandemowa spektrometria masowa
TOF (Time of Flight Analyser) - analizator czasu przelotu
PSD (Post Source Decay) - rozpad poza źródłem jonów
m/z - stosunek wartości masy do liczby ładunków
DIOS (Desorption/Ionization on Porous Silicon) - desorpcja/jonizacja na porowatym krzemie
ICP (Inductively Coupled Plasma) - jonizacja plazmą wzbudzoną indukcyjnie
Idea działania spektrometru mas
•
źródło jonów – urządzenie, w którym następuje jonizacja cząsteczek przy użyciu
różnorodnych technik, z których część prowadzi do pękania wiązań chemicznych na
skutek czego dochodzi do ich podziału na mniejsze fragmenty. Inne techniki powodują
tylko naładowanie cząsteczek bez ich fragmentacji,
•
analizator – w którym wcześniej powstałe jony ulegają rozdziałowi na podstawie
stosunku ich masy do ładunku.
•
detektor – urządzenie "zliczające" jony napływające z analizatora.
Jonizacja próbki
Twarda technika jonizacji
Jon molekularny typu [M+.]
Bogate widmo fragmentacyjne
Łagodna technika jonizacji
Pozorny jon molekularny [M+H]+ lub [M-H]Brak fragmentacji
Jonizacja próbki cd.
Jonizacja próbki – lasery używane w technice MALDI
Nitrogen laser:
pro: well structured energy profile
contra: slow (maximum 50Hz)
Nd:YAG laser:
pro: fast (up to 1000Hz)
contra: Gaussian energy profile (non-structured)
Smartbeam/Smartbeam II
(modified Nd:YAG laser):
pro: fast (up to 1000Hz)
pro: well structured energy profile
A. Holle, A. Haase, M. Kayser, J. Höhndorf, Journal of Mass Spectrometry, 41, 705-716 (2006)
Matryce
Procesy zachodzące pod wpływem impulsu
laserowego
Absorpcja promieniowania głównie przez materiał
matrycy.
Odparowanie próbki na głębokość 2-3 l i wyrzucenie
strumienia gazów prostopadle do jej powierzchni.
Dysocjacja termiczna matrycy.
Tworzenie jonów (głównie H+, Na+, K+).
Reakcje jonów z badaną substancją i matrycą. Możliwe
drogi:
- dysocjacja termiczna z utworzeniem pary kation-anion
- oderwanie elektronu
- oderwanie bądź przyłączenie protonu
- przyłączenie kationu bądź anionu
Matryce
Pożądanymi cechami matrycy MALDI są:
•dość niska masa cząsteczkowa, co sprzyja łatwemu odparowaniu, ale wystarczająco
duża, by odparowanie nie nastąpiło przed pomiarem, np. w czasie przygotowywania
próbki;
•rozpuszczalność w rozpuszczalniku kompatybilnym z analitem;
•kwasowość, by ułatwić protonowanie cząsteczek analitu;
•obecność grup polarnych (hydrofilowych) w cząsteczce, co umożliwia rozpuszczanie
matrycy w roztworach wodnych;
•stabilność w warunkach wysokiej próżni;
•wspomaganie jonizacji analitu;
•zdolność intensywnej absorpcji promieniowania UV lasera; zwykle wymóg ten
spełnia związek, posiadający układ sprzężonych wiązań podwójnych C=C (dlatego
często matrycami są pochodne aromatycznych kwasów karboksylowych, często
nienasyconych, np. kwasu cynamonowego).
Matryce
Sinapic acid
Kwas 3-5-dimetoksy-4-hydroksy cynamonowy
SINA
proteiny
Dithranol
1,8-Dihydroksyantracen-9(10H)-on
DIT
polimery
Gentisic acid
Kwas 2-5-dihroksy benzoesowy
DHB
peptydy
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid
Kwas α-Cyano-4-hroksy cynamonowy
CHCA, α-CHCA
Peptydy, lipidy
2-(4-Hydroxyphenylazo)benzoic acid
Kwas 2-(4-hydroksyfenylazo)- benzoesowy
HABA
Peptydy, polimery
2,4,6-Trihydroxyacetophenone
2,4,6-trihroksy acetofenon
THAP
oligonukleotydy
Tryb liniowy
Tryb liniowy
Jak zwiększyć rozdzielczość?
• Pulsed ion extraction – polepszenie ogniskowania jonów
• Optymalizacja przygotowania próbki – homogenizacja
• Użycie reflektronu
Optymalne przygotowanie próbki
Najczęściej stosowane metody nanoszenia próbki (analitu i matrycy) to:
1.
Metoda wysychającej kropli (dried droplet method) – jednowarstwowa:
Przyrządza się osobno roztwór próbki i roztwór matrycy w tym samym rozpuszczalniku, lub – jeśli to niemożliwe
– w dwóch kompatybilnych; niekiedy jeszcze używa się trzeciego roztworu - środka kationizującego, np. soli
metalu (możliwe są różne rozpuszczalniki i stężenie). Wszystkie roztwory miesza się, a uzyskaną mieszaninę
(0,5÷1 μl) umieszcza na płytce MALDI (MALDI target) i pozostawia do wyschnięcia na powietrzu. Wadą tej
metody jest powolne wysychanie próbki, co może prowadzić do rozdzielenia kryształów matrycy próbki i soli
kationizującej.
Modyfikacjami tej metody są: zastosowanie odparowywania próżniowego lub odparowywanie w strumieniu
ultraczystego azotu. W obu przypadkach otrzymuje się drobniejsze kryształy, lepszą rozdzielczość i
powtarzalność oraz intensywność sygnałów.
2.
Metoda cienkiej warstwy (thin-layer method) – dwuwarstwowa:
Roztwór matrycy w odpowiednim rozpuszczalniku (np. dla CHCA – roztwór nasycony w acetonie) nanosi się na
płytkę MALDI i pozwala mu się wyschnąć, otrzymując cienką warstwę matrycy. Następnie 1 μl roztworu analitu
nanosi się na wierzch uzyskanej powierzchni matrycy i suszy.
3.
Nanoszenie przez rozpylanie.
Wariantami tej metody są: osadzanie strumieniem powietrza (air spray deposition) i osadzanie przez
elektrosprej (electrospray sample depositon).
4.
Metoda mieszania ciał stałych (solid/solid sample preparation):
Metoda polega na bardzo dokładnym mieszaniu drobno sproszkowanych matrycy i próbki (bez rozpuszczalnika)
i prasowaniu całości w pastylkę. Stosuje się ją dla niektórych poliamidów, nierozpuszczalnych w pospolitych
rozpuszczalnikach organicznych
Epot = zeU
Ekin = 1/2mv2
zeU = 1/2mv2
v = (2zeU/m)1/2
t = L×(1/2eU)1/2×(m/z)1/2
Tryb reflektronu
Tryb reflektronu
Profil izotopowy
Profil izotopowy
Masa monoizotopowa
Masa średnia
C41H69N13O14S
[M+H]+: 1000.4880
[M+H]+: 1001.1409
C112H164N29O34S2
[M+H]+: 2524.1510
[M+H]+: 2525.8196
C253H363N55O75S
[M+H]+: 5404.6075
[M+H]+: 5407.9984
Kalibracja
tof= tdelay + tacc + tdrift
F=Eq=Ma
d = a/2 tacc2
E = U/d q = z e
tacc = d √(2m/Uze)
tdrift= L √(m/2zeU)
tof=tdelay + d √(2m/Uze) + L √(m/2zeU)
tof=tdelay + (d √(2/Ue)+L √(1/2Ue)) × √(m/z)
t = C0+C1√(m/z)
MALDI–ToF/ToF
Ion path in TOF1 region (linear TOF)
Ion path in TOF2 region (reflectorTOF)
Ion source1 = MALDI ion source
Ion source2 = LIFT re-acceleration cell
PCIS = Timed ion gate
PLMS = Post LIFT meta stable suppressor
MALDI–ToF/ToF
MALDI–ToF w badaniach polimerów
Za pomocą MALDI można wyznaczyć
następujące parametry polimerów:
•
•
•
Mn, Mw, PD
grupy końcowe polimeru
budowę kopolimeru
Montaudo G, J. Polym. Sci. A: Polym. Chem. 34, 1996, 439-447
C
B
A
A9B2C
A8B2C
A9BC
A8B3C
A10B2C
A10BC
A9B3C
A11BC
A7B3C
A6B4C
A8B4C
A7B4C
A10C
A11C
A11C
Polimery polarne: poliwęglany, politlenki olefin
Polikwasy, poliestry, polimery słabo polarne (np. polistyren)
Polisacharydy, teflon, poliolefiny
mass discrimination effect



MALDI mass spectra of a poly(alkylthiophene) fractionated with acetone, hexanes,
methylene chloride, THF, and chloroform
Liu, J.; Loewe, R. S.; McCullough, R. D. Macromolecules1999, 32, 5777 -5785.
Wskazówki dla PT Klientów
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Badane mogą być związki stałe, ewentualnie ciecze nielotne (ciśnienie w komorze pomiarowej < 10-7 Torr).
Do pomiaru używamy zazwyczaj 5 mg substancji. Próbki można dostarczać albo już odważone (proszę podać masę
próbki), lub w większych pojemnikach.
W razie tzw. wyższej konieczności do pomiaru wystarczy: substancji typu biologicznego (np. peptydu) 0,1 - 10 pmol,
polimeru 50 - 200 pmol.
Można również dostarczyć próbkę w postaci roztworu w dowolnym, ale koniecznie lotnym i niekorodującym
rozpuszczalniku (prosimy o podanie stężenia roztworu !)
Możliwy jest pomiar próbki nierozpuszczalnej, ale wówczas musi być ona w postaci możliwie drobnego proszku.
Należy jednak podkreślić, że wyniki takiego pomiaru będą znacznie gorszej jakości, niż próbek rozpuszczalnych.
Kategorycznie odmawiamy przyjmowania podejrzanych, dymiących cieczy zawierających stężone lotne kwasy (np.
HCI, HNO3) oraz substancji korodujących typu POCI3, wolne aminy, fenole, merkaptany itd.
Aby proces tworzenia jonów przebiegał możliwie wydajnie, próbka powinna być jak najczystsza. W szczególności
nie powinna zawierać:
• nadmiaru soli nieorganicznych z grupy litowców i miedziowców,
• detergentów !!!,
• buforów, zwłaszcza fosforanowych,
• substancji silnie alkalizujących (reagują z matrycą),
W przypadku polimerów, co do których zachodzi podejrzenie, że mogą zawierać frakcje znacznie różniące się masą
cząsteczkową ( np. Mn = 1 500 i Mn = 30 000) niezbędne jest wstępne rozdzielenie próbki na frakcje.
Prosimy o podanie spodziewanej masy cząsteczkowej, bądź przynajmniej zakwalifikowanie próbki do jednego z
następujących przedziałów: < 5000; 5000-20000; > 20000
Do badanej próbki (lub grupy próbek) prosimy dołączyć „Zlecenie wykonania badania MALDI-ToF” (druk dostępny
na stronie: www.ch.pw.edu.pl/~maldi )
Polecana literatura
• M. Karas, D. Bachmann, F. Hillenkamp; Analytical Chemistry,
57, 2935-2939 (1985)
• K. Tanaka, H. Waiki, Y. Ido, S. Akita, Y. Yoshida, T. Yoshida;
Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2, 151-153
(1988)
• R. C. Beavis, B. Chait, K.G. Standing; Rapid Communications
in Mass Spectrometry, 3, 233-237 (1989)
• M. Karas, M. Glückmann, J. Schäfer; Journal of Mass
Spectrometry, 35, 1-12, (2000)
• R. Zenobi and R. Knochenmuss; Mass Spectrometry Reviews,
17, 337-366 (1998)
• G. Montaudo, M. S. Montaudo, and F. Samperi, “ Mass
Spectrometry of Polymers ”, ed. G. Montaudo and R. P.
Lattimer, 2002 , CRC Press, Boca Raton, FL, 419.
Dziękuję za uwagę…