Transcript 微生物源抗菌肽
抗菌肽物质与预防小猪下痢 (文献综述) 绿康生化股份有限公司 梁超博士 2013年6月20日 上海 1 报告人简介 • • • • 姓名: 梁超 职务: 质量与法规总监 (绿康生化股份) 学历: 博士(美国堪萨斯州立大学) 经历: – – – – 美国建明工业公司 （亚洲区技术总监） 美国雅来大药厂 （中国区总经理） 泰国正大生化集团 （技术顾问 ） 美国微营养公司 (亚太区总经理) • 论文: 30多篇 • 专利: 5件 2 • 抗菌肽是有抗菌活性的肽类化合物(马卫明,2004)。 已有1000多种抗菌肽物质被研究。中文报告多达48000份,而英文论文则接近40万份。 • 有报告指出我国仔猪全年平均发病率46.5%, 因下 痢致死亡率为 10.3%, 是影响中国养猪业发展的重 要因素之一 。 • 本文是抗菌肽物质和小猪下痢有关的文献综述。 3 ( 马卫明, 2004, 中国农业大学博士论文) （ 同时具有抗菌特点及肽结构这两种性质的物质 = “抗菌肽” “肽结构” = 几至几百个氨基酸呈线性或环状聚合物 4 抗菌肽研究概述 (1000多种抗菌肽物质) 生物来源 抗菌肽举例 氨基酸数量 已报道的种类 哺乳动物 防御素类 18 - 42 100多种 Catheliodins 类 140 - 300 600多种 乳铁蛋白 690 50多种 溶菌酶 129 20多种 蛙皮素 14 30多种 铃蟾肽 14 20多种 杆菌肽 12 4种 多粘菌素 9-11 3种 HIV-1抗菌肽 12 1种 植物 植物防御素类 20 - 93 100多种 昆虫 天蚕素类 31 - 39 20多种 昆虫防御素类 30 - 60 100多种 富脯氨酸类 15 – 34 100多种 富甘氨酸类 100 - 200 100多种 两栖动物 微生物 文献 陆婕, 2005 钟雅, 2007 马卫明, 2004 陈绍峰, 2003 朱伶俐,, 2012 Mukesh Pasupuleti, 2009 5 抗菌肽与小猪下痢 • 母猪奶水中的乳铁蛋白 • 肠膜蛋白及其抗菌肽物质 • 微生物源抗菌肽 – 杆菌肽 – 硫粘菌素 • 基因工程抗菌肽 – 溶菌酶 – 天蚕素 • 结论 6 Lactoferrin (乳铁蛋白) •1959年Groves用色谱得到纯的红 色的含铁的糖蛋白 •乳铁蛋白在人乳中的浓度为1.03.2mg/ml，是普通牛乳中的10倍 （牛乳中含量为0.020.35mg/ml）,而人初乳中乳铁蛋 白可达6-14mg/ml. 一般推测, 其他 哺乳动物的初乳中的乳铁蛋白也 很高 •乳铁蛋白对铁离子的吸附性超强, 一般认为它可以夺走细菌生长所 需的铁质而抑制细菌的生长，达 到防治下痢的效果。 7 8 铁离子对母猪奶水中下痢细菌生长的影响 102 * 1.25 O157 E. coli Klasing & Knight, 1979 * Fe * Fe 1.5 Fe Growth in 12 hrs (Colony forming units) 104 Clostridium perfringens Salmonella typhimurium LF = 乳铁蛋白 ( 卢蓉蓉 等, 2008) 10 ( 杨安树 等, 2007) 11 ( 黎观红, 等, 2009 ) 12 ( 侯振平 等, 2011 ) 13 乳铁蛋白的转基因表达 • Liang 等(1993) 报道了人 乳铁蛋白在啤酒酵母中的表达, 然后通过酵母转化酶分泌信号序列将重组人乳铁蛋白 分泌至细胞外, 产率为 15 -20 mg/L。 • Ward 等(1992)把合成乳铁蛋白的遗传信息转移到曲霉 菌中, 然后在适宜条件下进行培养, 从而实现了乳铁蛋 白的优化生产, 这是通过发酵大量生产乳铁蛋白的重大 突破。 14 • 围产期中，提高母猪健康，保证乳铁蛋 白数量和质量 • 在母猪产前14天至产后21天，母猪饲料 中添加 250ppm MDAB(必恩迪), 能有效防 治由产气荚膜梭菌引起的乳猪肠炎 。 （美国 FDA法规 ， 21 CFR Ch. I § 558.76, ) 15 小结 1 • 猪母乳含有丰富的乳铁蛋白, 是预防仔猪下 痢的“抗菌肽”最佳来源 • 在母猪围产期(产前-产后)的母猪饲料中使用 抗菌肽产品能减少仔猪下痢现象, 有可能是 母猪健康保证了奶水质量和乳铁蛋白抗菌 肽含量的结果 16 抗菌肽与小猪下痢 • 母猪奶水中的乳铁蛋白 • 肠膜蛋白及其抗菌肽物质 • 微生物源抗菌肽 – 杆菌肽 – 硫粘菌素 • 基因工程抗菌肽 – 溶菌酶 – 天蚕素 • 结论 17 猪小肠中抗菌肽研究成果举例 研究者 年代 抗菌肽 分子量 Lee 1989 Cecropin P1 3339 Da Agerberth 1991 PR-39 4719 Da Andersson 1995 NK-lysin 8924 Da 周洪福 1995 乙酸提取物 马卫明 2004 乙酸提取物 5972 Da （马卫明， 2004,中国农业大学博士论文) 18 ( 赵燕飞 等, 2005 ) 19 ( 王春维,2005 ) 20 ( 徐军等, 2006 ) 21 肠膜蛋白对教槽料的影响 肠膜蛋白 ( 司马博锋 等, 2011) 22 小结 2 • 猪肠膜抗菌肽开发还处于研究阶段. 使用猪肠膜 粉(加工后副产品)作为肠膜抗菌肽来源养猪对防治 仔猪下痢有一定的效果 • 直接使用肠膜粉(抗菌肽)存在生物安全问题 • 通过基因工程菌生产肠膜抗菌肽仍需研究 23 抗菌肽与小猪下痢 • 母猪奶水中的乳铁蛋白 • 肠膜蛋白及其抗菌肽物质 • 微生物源抗菌肽 – 杆菌肽 – 硫粘菌素 • 基因工程抗菌肽 – 溶菌酶 – 天蚕素 • 结论 24 细菌源抗菌肽的比较 品种 产生菌 停药期 抑菌机理 抗菌谱 FDA法规 用药成本 杆菌肽 地衣芽孢菌 0 细胞壁合成 G+ + 低 硫粘菌素 多粘杆菌 7 细胞膜合成 G- - 低 维吉尼霉素 链霉菌 1 蛋白质合成 G+ + 较高 恩拉霉素 放线菌 7 细胞壁合成 G+ - 中等 那西肽 放线菌 3 蛋白质合成 G+ - 中等 地衣芽孢菌是全球几十个国家所批准使用的益生菌（直饲微生物） FDA法规尚未批准硫粘，恩拉和那西肽作为饲料中长期添加的药物 25 杆菌肽与硫粘菌素简介 抗菌肽名称 杆菌肽 硫粘菌素/多粘菌素 化学性状 地衣芽孢杆菌 多粘芽孢菌 抗菌谱 革兰氏阳性细菌 革兰氏阴性细菌 作用机理 •抑制细菌细胞壁合成 •破坏细菌细胞膜 •中和细菌内毒素 化学结构 26 杆菌肽的抑菌机理及其与其它抗菌素的区别 ( Smith & Weinberg, 1962) 27 杆菌肽对动物结肠中产气荚膜梭菌 的抑制作用 杆菌肽 (ppm) 动物结肠中产气荚膜梭菌 (CFU/g 肠糜） 病源菌减少倍数 0 800,000 0 1 790,000 1:1 6 4,000 200:1 17 500 1600:1 55 300 2666:1 ( Stutz, et al., 1983) 28 ( Nurmi & Rantala, 1974 ) 29 两种杆菌肽产品的理化差异 30 美国 FDA关于杆菌肽的法规 ( 21 CFR Ch. I § 558.76, ) 杆菌肽锌 亚甲基水杨酸杆菌肽 (MDAB, 必恩迪) • 肉鸡, 活鸡 和 山鸡的促 •肉鸡, 火鸡 和 山鸡的促生长 (4 to 50 g/ton) . 生长 (4 to 50 g/ton) . •和金霉素配合使用, 治疗细菌性肠炎, 细菌性肺炎和增 生性回肠炎 (50克/吨MDAB + 400克金霉素/吨，连续14 天） •治疗坏死性肠炎 (50 -200 ppm)，猪痢疾（250ppm) •由产气荚膜梭菌引起的乳猪肠炎 （在母猪产前14天至 产后21天，母猪饲料中添加 250ppm) 31 亚甲基水杨酸杆菌肽 • • • • 国家五类新兽药 具有“生产许可证”、“兽药添字文号” 成分确定，效果明确, 暂无耐药菌株 商品名: “必恩迪”( 含量: 15% ) • 该产品的研究报告有: 8000多份 http://scholar.google.com/scholar?hl=zhCN&q=Bacitracin+methylene+disalicylate&btnG=&lr= 32 ( 陈绍峰, 2003 ) , 南京农业大学硕士论文 33 硫粘菌素对内毒素的中和作用 鲎试剂反应 – 呈阴性 ( Cooperstock, M. S., 1974) 34 ( 牛志强, 2011 ) 35 处理 1 组：60 ppm 盐霉素，+ 20 ppm 进口硫酸粘杆菌素 处理 2 组：60 ppm 盐霉素，+ 20 ppm 国产硫酸粘杆菌素 （王宁， 2005 , 中国农业大学硕士论文） 36 （赵志杰等, 2012 ） 37 小结 3 • 杆肽和硫粘是最常使用在仔猪料中的抗菌肽兽药 添加剂, 效果明显和安全 • 由于农业部法规限制,目前在仔猪饲料中的使用受 到影响. 需要研究更好的使用方式(如配伍等) 及探 讨申请预防仔猪下痢的”专用配方” 38 抗菌肽与小猪下痢 • 母猪奶水中的乳铁蛋白 • 肠膜蛋白及其抗菌肽物质 • 微生物源抗菌肽 – 杆菌肽 – 硫粘菌素 • 基因工程抗菌肽 – 溶菌酶 – 天蚕素 • 结论 39 ( 朱伶俐,, 2012 , 江南大学硕士论文 ) 40 溶菌酶抗菌肽(Lys-Pe)对不同菌种的抑菌情况 ( 朱伶俐, 2012 , 江南大学硕士论文 ) 41 ( 溶菌酶制剂由鸡蛋清经盐析、冻干后制成,每毫克含溶菌酶1500单位。 ) ( 邵春荣 等, 1996 ) 42 ( 邱伟海, 2006 ) 43 ( 朱军英, 2009 ) 44 ( 开食料中添加溶菌酶可溶性粉剂（5000IU/mg），每 100kg 饲料中添加 10、5.0、2.5g；传统药物对照组每 100kg 饲料中添加强力霉素 200g；空 白对照组不添加任何药物 ) ( 张锋,2006, 山东农业大学硕士论文) 45 ( 网络资讯 ) 46 小结 4 • 1）转基因溶菌酶的安全性如何保证？ 2）过多的 溶菌酶是否干会扰内源溶菌酶的产生和分泌？ • 部分人体对溶菌酶有过敏现象(付 琴等, 2012) , 是 否有部分仔猪也会有过敏问题 ? 47 天蚕素 • 1975 年瑞典科学家G.Boman 等人从惜古比天蚕 (Hyatophoracecropia)蛹中诱导分离得到一种杀菌肽，并将 其命名为cecropin（天蚕素）。目前已经在多种生物中发 现了大约有 90多 种天蚕素基因。 • 天蚕素抗菌肽 是根据 cecropin A 和 cecropin6D 设计合成的 含 37 个氨基酸残基的杂合肽, 在枯草芽孢杆菌中成功表达 的基因工程产物 • ( 王阿荣, 2011, 内蒙古农业大学硕士论文 ) • 中国知识网上有270多篇关于天蚕素的研究论文 48 天蚕素抗菌肽 在断奶仔猪饲粮中的应用效果 天蚕素抗菌肽由华南农业大学蚕业服装系黄自然教授提供,其活性为4000单位/g。 （温刘发 等， 2001 ） 49 抗菌肽组按 2ml/kg 饲料或 0.5ml/kg 饲料的剂量。抗生素组按强力霉素 150mg/kg 及阿散酸 100mg/kg 的剂量, 混合后饲喂仔猪。 温刘发等， 2007。 《广东蚕业》 41( 1) : 39- 42 50 ( 黄亚东 等, 2002 ) 51 “天蚕素抗菌肽”对断奶仔猪生长性能和 免疫效果的影响 （ 戴求仲, 2012 ) 52 ( 李永新, 2009 ) 53 •试验 I 组: 180 g/t 的天蚕素抗菌肽 •试验 II 组: 250 g/t 的天蚕素抗菌肽 •试验 III 组: 320 g/t 的天蚕素抗菌肽 ( 王阿荣, 2011, 内蒙古农业大学硕士论文 ) 54 ( 杜淑环, 2012 ) 55 小结 5 • 天蚕素抗菌肽的效果是明显的, 但其产品定 位尚不明确: 新兽药? 新饲料原料 ? • 转基因产品的安全性问题 – http://www.safehoo.com/Essay/food/201203/263 364.shtml 56 抗菌肽与小猪下痢 • 母猪奶水中的乳铁蛋白 • 肠膜蛋白及其抗菌肽物质 • 微生物源抗菌肽 – 杆菌肽 – 硫粘菌素 • 基因工程抗菌肽 – 溶菌酶 – 天蚕素 • 结论 57 被用于防治小猪下痢的抗菌肽举例 物质名称 ( 来源 ) 氨基酸 数量 抗菌谱 机理 参考文献 乳铁蛋白(奶) 690 广谱 消除 铁离子 ( 杨安树 等, 2007) ( 卢蓉蓉 等, 2008) 溶菌酶 (鸡蛋清) 129 G+ 水解胞壁 糖甘键 李鹤 等, 2007 天蚕素 (蚕) 39 G- 破膜 王阿荣, 2011 PR-39 (猪小肠) 39 G- 破膜 徐军等, 2006 粘杆菌素(细菌) 10 G- 破膜 陈绍峰, 2003 杆菌肽锌(细菌) 12 G+ 破壁 Stutz, et al., 1983 58 获得免疫与固有免疫的比较 * 获得免疫 固有免疫 仅高等脊椎动物 所有生物 数天 数小时 非常多样化 有限和固定 比初次反应更快 与初次反应一样 对外来病源的记忆 有 无 种系编码 无 有 成分举例 抗体, 抗原, 白细胞， T淋巴细胞，B淋巴细胞 单核细胞, 等 抗菌素,抗菌肽,细胞因子, 补体成分,吞噬细胞, 等 存在 反应启动时间 专一性 对重复感染的反应速度 ( * 以下认知截止到目前而已 !!! ) （Mukesh Pasupuleti, 2009, 瑞典 Lund 大学博士论文 ) 59 基因工程抗菌肽的问题 • • • • • • 活性：基因工程抗菌肽活性不稳定 毒性：有强烈的肾毒性 功能与结构：尚需要研究 体内稳定性：可能被胰蛋白酶水解 耐药性：长期使用也会产生 法规：暂是还没有被“正式批准”作为饲料 （韩文瑜,孙长江， 2009 ） 60 http://gs.people.com.cn/n/2013/0618/c183342-18882163.html 61 预防下痢“抗菌素替代物”分析 类别 有效成分 主要缺点 有机酸 苯甲酸, 山梨酸, 丙酸盐, 需要高剂量 富马酸二甲酯 腐蚀性, 刺激性 植物提取物 大蒜及其提取物, 桂皮提 需要高剂量 取物, 牛至油 资源有限，掺假现象 矿物 硫酸铜， 氧化锌 用工危废物做原材料， 重金属污染(砷和镉) 活菌制剂 枯草芽孢杆菌, 地衣芽孢 使用成本高 杆菌 质量不稳定 酶制剂 各种消化酶 质量不稳定 需要高剂量 效果不明显 其他问题 结论： 暂时还没有能取代正规合法的抗菌素(肽)的“替代物” 62 总结 • 抗菌肽物质用于预防仔猪下痢倍受关注 • 转基因抗菌肽产品是发展方向,但暂时还没有获得 正式的生产许可, 存在法规和安全性风险. • 应重视传统抗菌肽产品的作用, 加强研究,使它们 能发挥更大的作. 63 谢谢您的聆听 ! 64 浦城: “碧水丹山, 珍木灵草 “ ----- 江淹 (444～505)，南朝文学家, 曾做过3年浦城县令 65