Transcript lp 10 – microb – Antibiograma ii

ANTIBIOGRAMA
Tipuri de antibiograme
DEFINITIE
• Prin antibiograma se intelege testarea
sensibilitatii unei tulpini bacteriene izolate
dintr-un produs patologic fata de diverse
antibiotice.
• Astfel se caracterizeaza capacitatea
acestora de a opri dezvoltarea microbiana
si da informatii pentru selectarea celui sau
celor mai active antibiotice fata de
microorganismul testat.
• Termenii de antibiotic si
chimioterapic se folosesc ca sinonimi.
• Introducerea unui antibiotic in
terapie este o mare responsabilitate
medicala, cerind respectarea unor
conditii bine determinate:
1.
Antibiograma se face dupa stabilirea
diagnosticului etiologic, prin izolarea in
cultura pura si prin identificarea
agentului patogen.
In cazuri de extrema urgenta, se poate
administra un antibiotic (inainte de
efectuarea antibiogramei) dar numai dupa
recoltarea produselor patologice.
2. Tratamentul se realizeaza in functie
de rezultatele date de
antibiograma, alegind antibioticul
cel mai eficace, adica fata de care
bacteria izolata are cea mai mare
sensibilitate.
3.
Antibiograma trebuie repetata daca
tratamentul cu antibiotice este de durata
mai lunga; aceasta deoarece agentul
patogen poate sa cistige rezistenta fata
de antibioticul utilizat.
Apoi in cursul tratamentului datorita
dezechilibrului din populatiile
microbiocenozelor, poate sa se produca o
infectie supraadaugata cu o bacterie din
aceste microbiocenoze.
• Principiul antibiogramei consta in
capacitatea antibioticelor de a impiedica
multiplicarea bacteriana, fenomen cunoscut
ca efect bacteriostatic.
• Unele antibiotice au in anumite
concentratii si proprietatea de a omori
bacteriile: efect bactericid.
Metode folosite pentru
testarea sensibilitatii in vitro
la antibiotice
metode calitative
– metoda difuzimetrica Kirby Bauer - clasica
– metoda cu antibiotic incorporat in mediu
semisolid – kit-ul comercial ATB Biomerieux,
Franta - moderna
• metode cantitative
– metoda dilutiilor in mediu lichid - clasica
– metoda Etest – AB BIODISK , Suedia –
moderna
Metoda
difuzimetrica(Kirby-Bauer)
• Aceasta se efectueaza pe medii solide, in placi
Petri, pe care s-a insamintat in pinza cultura
bacteriana; apoi pe suprafata mediului se dispun
discuri cu antibiotice astfel ca in jurul acestora se
va realiza un gradient de concentratie prin
difuziunea locala a antibioticului ( in imediata
vecinatate a discului realizindu-se o concentratie
mai mare de antibiotic care descreste pe masura
indepartarii de acesta ).
Metoda
difuzimetrica(Kirby-Bauer)
• Metoda difuzimetrica, cu toate ca nu
stabileste concentratia minima
infibitorie (CMI), da informatii
pretioase asupra sensibilitatii speciei
testate fata de antibioticele utilizate
si este folosita mai frecvent in
laboratorele clinice.
Tehnica de lucru
• Mediul de cultura indicat este geloza
Müller-Hinton deoarece are o valoare
nutritiva care permite dezvoltarea optima
a unei mari varietati de bacterii si nu
contine inhibitori ai actiunii unor
antibiotice.
• Pentru bacterii cu necesitati de cultura
speciale, se utilizeaza medii adecvate ( de
ex. pentru Streptococcus pyogenes se
foloseste geloza singe ).
Tehnica de lucru
• Coloniile izolate (5 colonii) obtinute din
produsul patologic, se insaminteaza in
bulion, care se incubeaza la 37 °C ( ~ 5-10
min.), se determina turbiditatea culturii
corespunzatoare etalonului 0,5 McFarland
( cu ajutorul scariiMcFarland cu sulfat de
bariu sau automat pe densitometru ).
Tehnica de lucru
• Se insaminteaza placile in maxim 15 min. de
la etalonare ; se lasa placa insamintata 3-5
min. (niciodata mai mult de 15 min.) pentru
adsorbtia inoculului.
• Se depun discurile cu substante
antibicrobiene la distanta de minimum 15
mm de marginea placii si 30 mm intre
centrele a doua discuri vecine folosind o
pensa sau, mai bine un dispersor automat
de discuri.
Tehnica de lucru
• Se incubeaza placile la 37° C pentru
16-18 ore.
• Control de calitate : testeaza pe alta
placa, in aceleasi conditii , tulpina de
referinta adecvata.
Dispersor de discuri pentru antibiograme, tuburi cu
discuri impregnate cu antibiotice in diferite
concentratii, placa cu agar Müller-Hinton pentru
realizarea antibiogramei difuzimetrice
Citirea si interpretarea
• Se masoara cu sublerul sau cu rigla gradata
in mm , diametrul zonelor de inhibitie
completa , in lumina reflectata, pe fond
negru mat.
• In cazul mediilor transparente se masoara
pe spatele placilor, iar in cazul mediilor cu
singe pe suprafata agarului.
Antibiograme pe mediu
Müller-Hinton
Antibiograma pe geloza
singe
• Aspectul Zonei de
Inhibitie trebuie sa
fie clar si cu contur
net.
• In situatia in care se
observa chiar si o
singura colonie in
interiorul zonei de
inhibitie, se va
considera rezistenta
la acel antibiotic,
indiferent de
diametrul zonei de
inhibitie (vezi figura )
• In caz de urgenta , se poate citi
antibiograma dupa 5-6 ore de incubare, cu
conditia verificarii diametrelor si la 16-18
ore.
• Se verifica daca diametrele zonelor de
inhibitie ale fiecarei substante
antimicrobiene sint cuprinse in limitele
variatiei admise conform tabelelor de
interpretare furnizate impreuna cu
discurile.
INTERPRETARE
• Se interpreteaza astfel : Sensibil S
•
Intermediar I
•
Rezistent R
• in functie de valorile din tabelele de
interpretare.
Metoda cu antibiotic incorporat in
mediu semisolid – kit-ul comercial ATB
Biomerieux, Franta
• Principiu
• Galeria ATB permite determinarea sensibilităţii
microbiene la un set de agenti antibacterieni /
antifungici , incorporate într-un mediu semisolid.
Este alcătuită din 16 perechi de godeuri, din care
2/4 nu conţin antibiotice/antifungice şi sunt
martori de creştere.
• Celelalte perechi de godeuri conţin diferite
antibiotice în cite două concentraţii (c =
concentratie mai mica şi C = concentratie mai
mare) pentru a putea eticheta fiecare tulpină
testată ca fiind sensibilă, intermediară sau
rezistentă.
Metoda cu antibiotic incorporat in
mediu semisolid – kit-ul comercial ATB
Biomerieux, Franta
- Din tulpina de testat este preparată o suspensie
care este transferată în mediul de cultură cu care
este inoculată galeria ATB.
- Rezultatele se citesc vizual sau automat dupa 2448 ore de incubare la 37C.
• Citire si Interpretare
- Dacă nu există creştere la nici o concentraţie
înseamnă tulpină sensibilă, daca exista creştere
numai în godeul cu concentraţia mai mică c
înseamnă sensibilitate intermediară, daca exista
creştere în ambele godeuri (c şi C) semnifică
rezistenţă la respectivul agent antimicrobian.
E-Test
• E -Testul imbina acuratetea testarii cantitative si
simplitatea testarii difuzimetrice cu mare
economie de timp .
• Pe suprafata unei langhete/bandelete de 5 mm/50
mm din plastic inert, neporos, este fixat un
gradient exponential de antibiotic , desicat si
stabilizat, cu 15 dilutii intre 0,016 si 256 µg/ml
sau 0,002 si 32 µg/ml, iar pe cealalta suprafata
este marcata scala de lectura in µg/ml
corespunzatoare CMI .
E-Test
• Pe suprafata unei placi cu mediu agarizat
preinsamintata cu tulpina testata in
conditii standardizate sint depuse radiar
langhetele/bandeletele cu antibiotic.
Dupa incubare corespunzatoare, CMI este
indicata de intersectia dintre zona eliptica
de inhibitie a culturii si scala de gradiente
a langhetei
E-Test
• Desi scump, testul este fiabil, reproductibil si
permite determinarea concomitenta, pe aceeasi
placa, a CMI ale mai multor antibiotice pentru
bacterii aerobe sau anaerobe, supravegherea
pacientilor pe parcursul terapiei antimicrobiene
pentru a surprinde selectarea de clone rezistente
( ex. fata de ampicilina in meningitele determinate
de H. influenzae, testarea pneumococilor fata de
β-lactamine, a enterococilor fata de
aminoglicozide cu depistarea rezistentei cu nivel
inalt, a enterobacteriaceelor producatoare de βlactamaze cu spectru extins ).
Metoda dilutiilor in
medii lichide
• Aceasta urmareste determinarea limitei de
sensibilitate a germenului fata de
substanta data, indicind concentratia de
chimioterapice sau antibiotice necesara
pentru inhibarea dezvoltarii sale. In acest
fel se determina ceea ce se cunoaste sub
denumirea de concentratie minima
inhibitorie ( CMI ).
Tehnica de lucru
• In dilutii crescinde de chimioterapice si
antibiotice facute direct din mediul de
cultura lichid se insaminteaza cantitati
egale din cultura de cercetat, stabilindu-se
dilutia maxima a substantelor in prezenta
careia tulpina este inhibata.
• Pentru fiecare antibiotic se fac dilutii de
pornire.
Tehnica de lucru
• Concentratia initiala pentru penicilina
este 100 UI/ml; cea pentru
streptomicina de 100 µg/ml, pentru
cloramfenicol 50 µg/ml, etc. Mediul
de cultura utilizat este bulionul
glucozat 2% preparat fara peptona
daca se testeaza actiunea
sulfamidelor.
Tehnica de lucru
• Microorganismul testat se cultiva in bulion
glucozat, iar din cultura de 18-20 ore se
face o dilutie de 1/100, care se
insaminteaza in cantitati egale ( cite o
picatura ) in toate dilutiile de antibiotic.
• Pentru dilutii se utilizeaza 10 tuburi,
fiecare se repartizeaza cite 1 ml bulion
glucozat.
Tehnica de lucru
• In primul tub se adauga 1 ml din solutia de
antibiotic. Dupa omogenizare se trece 1 ml in al
doilea tub si asa mai departe pina la tubul 9 de
unde se indeparteaza 1 ml de solutie. Se
insaminteaza tuburile cu cite o picatura din
cultura testata. Tubul 10 este proba martor care
serveste pentru controlul dezvoltarii tulpinii in
mediul utilizat .
• Citirea se face dupa o incubare la 37° C , timp de
18-20 ore.
Citire si interpretare
• Ultimul tub limpede indica limita
sensibilitatii germenului, fata de substante
sau concentratia minima inhibitorie activa
( CMI). Adaugind la mediu un indicator de
ph ( rosu fenol ) se poate reduce timpul de
citire a rezultatelor la 3-6 ore intrucit
virarea culorii mediului in urma modificarii
ph-ului datorita dezvoltarii microbiene ( ph
acid ) apare mai rapid decit tulburarea lui.
•Metoda dilutiilor succesive in mediu lichid
•
Citire si interpretare
Dilutia din ultima eprubeta in care nu exista crestere bacteriana
(mediul este limpede) reprezinta valoarea CMI.
½
¼
1/8
1/16
1/32
1/64
1/128
1/256
1/512
Discutii
• Metoda dilutiilor in medii lichide este
tehnica cea mai precisa de
determinare a sensibilitatii
microorganismelor la antibiotice si
chimioterapice si in plus permite
determinarea concentratiilor
bacteriostatice si bactericide ale
substantelor testate.
Discutii
• Dozarea chimioterapicelor si antibioticelor din
umorile organismului este necesara pentru
evaluarea in vivo a eficientei unui tratament cu
chimioterapice sau antibiotice.
• Astfel se poate stabili daca concentratia
substantei se mentine in umorile organismului la un
nivel activ, permite controlul modului si ritmului de
administrare , ajuta la aprecierea corespondentei
intre eficacitatea in vivo si in vitro a substantei
utilizate, etc.
Discutii
• Aprecierea efectului bactericid prin
metoda dilutiilor se realizeaza astfel: din
ultimele 2 eprubete in care dezvoltarea a
fost inhibata, se insaminteaza cu un inocul
mic, tuburi cu mediu similar, dar fara
antibiotic.
• Lipsa dezvoltarii bacteriene in aceste
tuburi indica efectul bactericid al
antibioticului testat.
Concluzii
• Antibiograma este una dintre cele
mai utile determinari de laborator
care aduce informatii pretioase
privind atitudinea medicului in terapia
cu antibiotice.
Concluzii
• Antibiogramele se vor repeta ori de
cite ori o dicteaza evolutia clinica
dupa tratamentul cu antibiotice si
eventual se vor utiliza asociatii de
antibiotice pentru a obtine un efect
terapeutic mai promt si prevenirea
instalarii rezistentei bacteriei la
antibiotice si chimioterapice.
VITEK 2 Compact Brings Rapid
ID/AST Testing to Labs
• The newest product by bioMérieux Inc,
VITEK® 2 Compact, is expected to bring
these advantages to small and mid-size
laboratories.
• Currently awaiting approval by the Food
and Drug Administration (FDA), the VITEK
2 Compact uses the same technology as
the VITEK 2 to deliver results the same
day, but with a smaller footprint.
• The original VITEK was developed by the
McDonnell Douglas Corp of St. Louis, Mo, for the
aerospace program, but its clinical applications
were realized and developed by what became the
VITEK subsidiary of the company. The product
was sold to bioMérieux, a French company, in
1992, before McDonnell Douglas’ merger with
Boeing.
•
bioMérieux immediately set out to bring the
product to the next level and introduced the
VITEK 2 in 1998. The system was designed to
introduce workflow efficiencies and sophistication
for larger laboratories. In 2001, the company
began development of the VITEK 2 Compact to
offer the technology within a smaller unit.
How It Works
• The VITEK 2 and VITEK 2 Compact use a standard inoculum
to prepare an organism suspension and sophisticated
algorithms to analyze parameters and test conditions. A
variety of susceptibility cards used in the instruments are
available to allow an institution to match the susceptibility
testing to its pharmacy antibiotic formulary.
• Each susceptibility card contains 64 small-volume wells, with
representative antibiotics in each well. The optical system
reads the wells every 15 minutes.
• The new photometric technology in the instrument takes
advantage of advances in optics to detect changes in growth
for each well. The system also can identify an organism’s
phenotype based on the antibiotic susceptibility through
pattern recognition using the Advanced Expert System
(AES).
• According to Donahoe, portions of the setup and process
can be completed by a low-level technologist or technician,
but validation requires a laboratory technologist, though not
necessarily one specializing in microbiology. The AES helps
with verification. “This software package puts a PhD-level
review in the hands of the small lab, which typically lacks
the scientist traditionally needed to run this test,” Donahoe
says.
• The VITEK 2 Compact does not feature as much automation
as the VITEK 2, but it does eliminate a number of manual
steps, allowing consistent handling of the test process as
well as time and cost savings. In addition, the expanded
menu eliminates the need to run extra tests
• Donahoe reports that the mean time for result delivery is
6–8 hours. “Roughly 80% of identification and susceptibility
results are delivered in 6 hours, 90% within 8 hours,” he
says. “This means that nine of ten patients could have their
results in 8 hours or less.”