Transcript Zásady odběru a transportu k mikrobiologickému vyšetření

ZÁSADY ODBĚRU
A
TRANSPORTU
BIOLOGICKÉHO
MATERIÁLU
 Jedním
ze základních pilířů oboru
mikrobiologie je správný odběr materiálu
k mikrobiologickému vyšetření.
 Adekvátní
klinický materiál, jeho následné
vyšetření podle zásad správné laboratorní
praxe a v neposlední řadě jeho odpovídající
klinická interpretace je důležitým zdrojem
diferenciální diagnostiky a vhodného
léčebného přístupu k pacientovi.
Je nutné zdůraznit, že lékařská mikrobiologie
není jen laboratorním oborem, ale i oborem,
který je schopen aplikovat své výsledky do
klinické praxe.
 Mikrobiologické vyšetření ale není pouze
laboratorní záležitostí.

– Jeho prvopočátkem je odběr biologického materiálu,
který je v rukou klinických pracovníků.
– Správně indikovaný a provedený odběr je základním
předpokladem úspěchu mikrobiologického vyšetření.
– Na něj navazuje transport odebraného materiálu do
laboratoře a vlastní mikrobiologické vyšetření.
– Každá z těchto tří složek má svoje specifika a je pro
celkový úspěch stejně důležitá.
Mikrobiologické metody

Odběr materiálu a mikrobiologické vyšetřovací
metody spolu velmi úzce souvisí.

Vyšetřovací metody jsou v tomto vztahu
prioritní a většinou určují způsob odběru.

Obecně lze mikrobiologické metody rozdělit na
přímé a nepřímé.
Přímé mikrobiologické metody
 průkaz
živého či mrtvého
mikrobiálního původce, jeho částí,
povrchových struktur,
charakteristických látek jako jsou
nukleové kyseliny, enzymy, toxiny
a event. produkty metabolismu.
Přímé metody se dále dělí na:
Mikroskopické
 zobrazení původce mikroskopem optickým (různé
druhy barvení) nebo elektronovým.
 Jsou velmi rychlé, většinou ale s nízkou senzitivitou
i specifitou.
 Lze je velmi dobře využít pro průkaz obtížně
kultivovatelných patogenů, vyskytujících se
v dostatečné kvantitě ve vzorku materiálu (např.
anaerobní bakterie) a k získání dalších informací
(např. zánětlivá reakce, poměrné zastoupení
infekčních agens).
Kultivační
 pomnožení
původce ve vhodných
kultivačních půdách nebo tkáňových
kulturách do množství způsobujících
makroskopicky zřetelné projevy.
 Dostatečně
senzitivní
většinou, ale pomalé.
a
specifické,
Imunochemické
detekce původce na základě reakce antigenu se
specifickou protilátkou. Jako antigen se mohou
uplatňovat jak somatické struktury, tak i exogenní
produkty (např. toxiny Clostridium difficile).
Reakce je viditelná makroskopicky (např. aglutinace,
latexová aglutinace) nebo je detekována dalšími
reakcemi (např. imunofluorescence, barevná
enzymatická reakce – ELISA).
Většinou vysoce senzitivní i specifické, rychlé,
v bakteriologii ale omezeně využitelné.
Genetické
průkaz DNA nebo RNA
bakteriálního původce hybridizací
nebo dnes nejčastěji různými druhy
amplifikačních metod.
Vysoce senzitivní, specifické i
rychlé, zatím omezeně využitelné.
Chemické
průkaz chemických látek charakteristických
pro detekovaný mikroorganismus.
Buď se jedná o součásti jejich těl (např.
mastné a mykolové kyseliny) nebo produkty
metabolismu
(např.
průkaz
urey
u
gastroenteritid způsobených Helicobacter
pylori).
Senzitivní, specifické i rychlé metody, jejich
využití je rovněž omezené. Až na výjimky
vyžadují náročné přístrojové vybavení
(plynové
chromatografy,
hmotnostní
spektrometry).
Pokus na zvířeti
V současné době je pro rutinní
diagnostiku využíván velmi málo.
použití je vázáno na
dodržování přísných předpisů o
ochraně zvířat proti týrání.
Jeho
Nepřímé detekce reakcí
makroorganismu na působení
mikrobiálního původce
Ve většině případů se jedná o stanovení protilátek
různých tříd.
 K tomuto účelu se používá široká škála metod od prosté
aglutinace, aglutinace na nosičích, komplement-fixační
reakce až po imunochemické metody, z nichž jsou
nejrozšířenější metody ELISA.
 Nepřímý (serologický) průkaz původce se používá
především tam, kde je kultivační průkaz obtížný nebo
zcela nemožný – nejčastěji ve virologii a parazitologii.

Odběr materiálu základní principy správného odběru

Čas
– u infekcí způsobených mikroorganismy je
velice důležité správně načasovat odběr
materiálu k mikrobiologickému vyšetření.

Místo odběru materiálu
– souvisí s druhem infekčního procesu a jeho
průběhem. Zde se nejvíce projeví erudice a
zkušenosti ošetřujícího zdravotnického
personálu. Správný odběr musí být proveden
lege artis a asepticky – za sterilních kautel.
V
případě bakteriálních infekcí je velmi
vhodné odebrat relevantní materiál ke
kultivaci ještě před zahájením aplikace
antimikrobních přípravků.
 Dalším
důležitým biologickým materiálem je
krev, kterou je nutné odebrat opakovaně
(aspoň 2-3 hemokultury) a to jak pro aerobní,
tak anaerobní kultivaci.
Hemokultivace
doba odběru
Obecné pravidlo
odebrat krev co nejdříve po prvních
klinických příznacích
Více odběrů rozložit v čase
zvětšení pravděpodobnosti zachycení
bakterií
Správné načasování odběru



U pacientek s intermitentní bakteriemií na začátku
vzestupu teplotní křivky, popřípadě 1 hod. před jejím
začátkem. Další 2 - 3 hemokultury je vhodné odebrat
v 30-minutových intervalech.
U pacientek s kontinuální bakteriemií se odebírají 3 - 4
vzorky v 15 – 30minutových intervalech nebo
bezprostředně před podáním antimikrobního léčiva,
pokud je již aplikován.
Při negativním výsledku opakovat hemokultury v
následujících dnech.
případech pacientů s již aplikovanými
antimikrobními přípravky je vhodné
odebrat krev před jejich podáním a použít
hemokultur s inhibitory antibiotik.
V
 Jako
vhodné systémy pro kultivaci krve se
jeví především automatizované
hemokultivační systémy, pracující na
principu detekce zplodin bakteriálního
metabolismu.
Dezinfekce
Místo vpichu
70% alkohol (odmaštění)
jodové desinfekční prostředky
nepoužívat kvarterní amonné soli (ajatin) !
Stěr z místa vpichu !?!
Hemokultivační lahvička
propichovací zátka
70% alkohol
!!! Nepoužívat jodové desinfekční prostředky u lahviček do
automatických systémů - negativně ovlivňuje detekci CO2 !!!
Transportní souprava – musí splňovat následující
základní požadavky:
umožnit odběr vzorku,
zajistit přežívání mikroorganismů do doby, než dojde
ke zpracování vzorku v mikrobiologické laboratoři,
ochránit vzorek před vnější kontaminací,
ochránit vnější prostředí před kontaminací vzorkem,
jednoznačná identifikace vzorku a přenos nezbytných
dat, většinou jsou tyto požadavky řešeny průvodkou
v papírové podobě, může být i elektronický přenos
dat.
Materiál odebíraný
ke kultivačnímu
vyšetření lze
rozdělit do tří
základních skupin:
1. Tekutý materiál - moč, krev, likvor,
hnis, sputum a další tělesné tekutiny či
tkáně v tekutém stavu.
 Odebírají se do sterilní nádoby
v dostatečném množství (min. 0,5–1 ml).
 Velmi důležité je, aby použitá nádoba dobře
těsnila a nemohlo dojít ke kontaminaci
materiálu či naopak okolí a zdravotnického
personálu.
 Pro některé tekutiny (např. moč, krev) jsou
speciální nádoby s kultivační půdou.
2. Tuhý materiál stolice atd.
tkáně,
odběr platí stejná
pravidla jako pro tekutý
materiál.
 Pro
3. Výtěry
Slouží k odběru malého množství materiálu nebo tam,
kde není možné odebrat materiál jiným způsobem.
 Základní výtěrovkou je sterilní špejle nebo drát na
jehož konci je namotán chomáček vaty, která může být
nasycena aktivním uhlím.
 Výtěrovka je uchovávána v plastové zkumavce nebo
plastovém obalu. Před odběrem je vhodné namočit
vatový konec ve sterilním fyziologickém roztoku, aby
se zabránilo vyschnutí a odumření zachycených
bakterií během transportu do laboratoře.
 Sice dražší, ale z hlediska záchytu bakterií výhodnější,
jsou výtěrovky s transportním kultivačním polotuhým
médiem. Tyto výtěrovky není nutné před použitím
zvlhčovat a kultivační půda zlepšuje možnosti přežití
transportu u většiny citlivých a kultivačně náročných
bakterií.

Odběr materiálu
k sérologickému vyšetření

Pro sérologická vyšetření se odebírá 5-10 ml plné
(srážlivé) krve, která se v laboratoři centrifuguje.

Vlastní stanovení protilátek se provádí ze séra.

Pro sérologickou diagnostiku infekčních onemocnění je
velmi důležité sledovat dynamiku titru protilátek.

Je tedy nutné odebírat dva vzorky, druhý s časovým
odstupem 1-3 týdnů.
Základní principy odběru biologického materiálu
k mikrobiologickému vyšetření lze definovat následujícími
body:
1.
2.
3.
4.
5.
Na základě znalosti povahy a průběhu infekčního procesu
odebrat právě ten materiál, v němž se infekční agens nalézá a lze
ho nejsnáze prokázat.
Správná technika odběru vhodnými nástroji a do vhodných
odběrových nádob.
Sterilní způsob odběru, aby nedošlo ke kontaminaci odebíraného
vzorku.
Odebírat materiál pokud možno před podáním antibiotik. Jestliže
léčba již byla zahájena, je nutno na tuto skutečnost laboratoř
upozornit.
Opakovat odběr v případech, kdy jednorázové vyšetření
neposkytuje záruku záchytu mikroba nebo dostatečnou možnost
závěrečné diagnózy. Platí to zejména pro vyšetření sérologická,
ale mnohdy také pro přímý průkaz infekčního agens.
Transport materiálu
Obecně platí, že transport materiálu ke kultivačnímu
vyšetření má být co nejrychlejší. Každá prodleva
zmenšuje možnost diagnostiky, zejména v případě
růstově náročných bakterií.
 Relativně nejlépe vydrží mikrorganismy podmínky a
dobu transportu v tekutém materiálu a v hemokulturách.
Hůře je na tom tuhý materiál a tkáně, které osychají.
Tomu se dá zabránit transportem ve fyziologickém
roztoku, což může vést při malých počtech bakterií
k jejich vyplavení a falešně negativní mikroskopii.
 Nejvíce citlivé na dobu transportu jsou výtěrovky bez
transportního média.


Většina bakterií podílejících se na patogenních procesech
u člověka snáší bez problémů teplotu 4–8 C. Snížení
teploty zpomalí jejich metabolické procesy a bakterie
lépe vydrží nepříznivé podmínky.

Bohužel, některé důležité patogeny jako například
Neisseria gonorrhoeae nebo Neisseria meningitidis
mohou již při této teplotě hynout.

Naopak vyšší teplota (25–30 C) může v prostředí
s dostatkem živin způsobit přemnožení některých
bakterií, které jsou součástí běžné flóry a potlačení
patogenních původců (např. koliformní tyčinky potlačí hemolytické streptokoky).
 Moč
– vzhledem k většinou snadné dostupnosti
tohoto materiálu by jakékoliv skladování nemělo
připadat v úvahu. Při transportu je nutné udržet
pokud možno nízkou teplotu. V moči mohou být
i fyziologicky přítomné bakterie a moč
představuje dobrou kultivační půdu (může
obsahovat glukosu a bílkoviny). Při vyšší teplotě
(např. v letních měsících) dochází už během
dvou hodin k pomnožení event. fyziologicky
přítomných bakterií na vysoké kvantity a k
falešně pozitivním výsledkům.

Hnis, putridní materiál, nekrotické tkáně –
uchovávat při teplotě 4–8 C. Event. přítomné
koliformní bakterie mohou být při vyšší teplotě
příčinou kvasných procesů s tvorbou plynu a
způsobit porušení obalu a kontaminaci jak
odebraného materiálu, tak i okolí tímto
materiálem.

Stolice - uchovávat při teplotě 4–8 C z důvodu
velmi vysokého rizika kvasných procesů a výše
uvedených následků.

Výtěrovky bez transportního média – jakékoliv
skladování podstatným způsobem snižuje
pravděpodobnost záchytu původce. Doba od odběru
materiálu do zpracování v laboratoři by neměla
přesáhnout dvě hodiny.

Výtěrovky s transportním médiem – transportní medium
umožňuje přežívání většiny bakterií, uplatňujících se
v patogenezi bakteriálních infekcí, v závislosti na jejich
odolnosti a růstových vlastnostech. V každém případě
by doba skladování a transportu neměla přesáhnout 24
hodin.
Klinický materiál
Podmínky transportu
Výtěr tamponem bez
transportního média
Jakékoliv skladování snižuje pravděpodobnost záchytu
původce.
Doba transportu by neměla přesáhnout 2 hodiny při 4 oC.
Výtěr tamponem
s transportním médiem
Transportní médium umožňuje přežívání většiny bakterií,
zachovává i jejich původní kvantitativní poměry.
Doba skladování a transportu by neměla přesáhnout 24 hodin
při teplotě 4 °C.
Moč
Vzhledem k většinou snadné dostupnosti tohoto materiálu by
jakékoliv skladování nemělo připadat v úvahu (výjimečně až
18 hodin při 4 oC).
I při transportu je nutné udržet nízkou teplotu. V moči mohou
být v nízkém počtu přítomny bakterie bez klinického
významu. Při vyšší teplotě (např. v letních měsících) dochází
už během dvou hodin k jejich pomnožení na vysoké kvantity a
k falešně pozitivním výsledkům (moč může obsahovat glukosu
a bílkoviny, proto představuje dobrou kultivační půdu).
Sputum
Nutný rychlý transport. Uchováváním při 4 oC by mohlo dojít
k úhynu náročnějších bakterií, při vyšších teplotách
k nežádoucímu pomnožení kontaminující ústní mikroflóry a
zkreslení kvantitativních poměrů.
Hemokultura
U lahviček do automatických systémů Bactec a BacT/Alert
výrobci garantují možnost 24h inkubace při pokojové teplotě
před vložením inokulované lahvičky do přístroje. Nízká
teplota je v těchto případech nevhodná – prodlužuje dobu
následné kultivace a tím i čas detekce pozitivního vzorku.
Likvor
Vzhledem k důležitosti tohoto materiálu je nutný co
nejrychlejší transport do mikrobiologické laboratoře a jeho
okamžité zpracování. Pokud nelze transport realizovat
okamžitě, je možné ho inokulovat do lahvičky pro
hemokulturu a ponechat při pokojové teplotě.
Hnis, punktát, bioptický
materiál
Uchovávat při teplotě 4 °C. Přítomné bakterie mohou být při
vyšší teplotě příčinou kvasných procesů s tvorbou plynu a
způsobit porušení obalu.
Stolice
Uchovávat při teplotě 4 °C z důvodu vysokého rizika
kvasných reakcí.
1. den
pacient
s předpokládanou
infekcí
Schéma časového
průběhu
mikrobiologického
vyšetření
materiál
např. moč, stolice, krev, likvor, hnis
k detekci bakterií nebo jejich exoproduktů
2. den
předběžné
výsledky
k detekci protilátek
mikrobiologická laboratoř
mikroskopické vyšetření
předběžné
hlášení
sérum
kultivace
sérologické testy
rychlotesty (detekce antigenů, produktů metabolismu, genomu atd.)
vyšetření izolovaných bakteriálních kolonií
rychlé
identifikační
testy
provedení biochemických
testů
provedení testů
citlivosti na antibiotika
3. den
vyhodnocení identifikačních testů
a testů citlivosti
bakterií k antibiotikům
prodloužená inkubace
(v případě potřeby, např. kultivace
kvasinek, plísní, anaerobních
bakterií, mykobakterií)
interpretace získaných výsledků
mikroskopických, kultivačních,
identifikačních, se zřetelem na druh materiálu,
konkrétní onemocnění, antibiotickou léčbu,
a event. další faktory
konečný
výsledek
detekce protilátek, event. v případě
párových vzorků, posouzení dynam
tvorby protilátek