Mikrobiologické vyšetřovací metody

 Jedním ze základních pilířů oboru mikrobiologie je správný odběr materiálu k mikrobiologickému vyšetření.  Adekvátní klinický materiál, jeho následné vyšetření podle zásad správné laboratorní praxe a v neposlední řadě jeho odpovídající klinická interpretace jsou důležitým zdrojem diferenciální diagnostiky a vhodného léčebného přístupu k pacientovi.

  Je nutné zdůraznit, že lékařská mikrobiologie není jen laboratorním oborem, ale i oborem, který je schopen aplikovat své výsledky do klinické praxe.

Mikrobiologické vyšetření ale není pouze laboratorní záležitostí.

– – Jeho prvopočátkem je odběr biologického materiálu, který je v rukou klinických pracovníků.

Správně indikovaný a provedený odběr je základním předpokladem úspěchu mikrobiologického vyšetření.

– – Na něj navazuje transport odebraného materiálu do laboratoře a vlastní mikrobiologické vyšetření.

Každá z těchto tří složek má svoje specifika a je pro celkový úspěch stejně důležitá.

Mikrobiologické metody

 Odběr materiálu a mikrobiologické vyšetřovací metody spolu velmi úzce souvisí.  Vyšetřovací metody jsou v tomto vztahu prioritní a většinou určují způsob odběru.  Obecně lze mikrobiologické metody rozdělit na přímé a nepřímé.

P římé mikrobiologické metody



průkaz živého či mrtvého mikrobiálního původce, jeho částí, povrchových struktur, charakteristických látek jako jsou nukleové kyseliny, enzymy, toxiny a event. produkty metabolismu.

P římé metody se dále dělí na:

Mikroskopické

   zobrazení původce mikroskopem optickým (různé druhy barvení) nebo elektronovým. Jsou velmi rychlé, většinou ale s nízkou senzitivitou i specifitou. Lze je velmi dobře využít pro průkaz obtížně kultivovatelných patogenů, vyskytujících se v dostatečné kvantitě ve vzorku materiálu (např. anaerobní bakterie) a k získání dalších informací (např. zánětlivá reakce, poměrné zastoupení infekčních agens).

Kultivační

 pomnožení původce ve vhodných kultivačních půdách nebo tkáňových kulturách do množství způsobujících makroskopicky zřetelné projevy.

 Dostatečně senzitivní většinou, ale pomalé.

a specifické,

Imunochemické

 detekce původce na základě reakce antigenu se specifickou protilátkou. Jako antigen se mohou uplatňovat jak somatické struktury, tak i exogenní produkty (např. toxiny

Clostridium difficile

).  Reakce je viditelná makroskopicky (např. aglutinace, latexová aglutinace) nebo je detekována dalšími reakcemi (např. imunofluorescence, barevná enzymatická reakce – ELISA).

 Většinou vysoce senzitivní i specifické, rychlé, v bakteriologii ale omezeně využitelné.

Genetické



průkaz DNA nebo RNA bakteriálního původce hybridizací nebo dnes nejčastěji různými druhy amplifikačních metod.



Vysoce senzitivní, specifické i rychlé, zatím omezeně využitelné.

Chemické

 průkaz chemických látek charakteristických pro detekovaný mikroorganismus.

 Buď se jedná o součásti jejich těl (např.

mastné a mykolové kyseliny) nebo produkty metabolismu (např.

průkaz urey u gastroenteritid způsobených

Helicobacter pylori

).

 Senzitivní, specifické i rychlé metody, jejich využití je rovněž omezené. Až na výjimky vyžadují náročné přístrojové vybavení (plynové chromatografy, hmotnostní spektrometry).

Pokus na zvířeti

 V současné době je pro rutinní diagnostiku využíván velmi málo.

 Jeho použití je vázáno na dodržování přísných předpisů o ochraně zvířat proti týrání.

Nep římé detekce reakcí makroorganismu na p ůsobení mikrobiálního původce

 Ve většině případů se jedná o stanovení protilátek různých tříd.

  K tomuto účelu se používá široká škála metod od prosté aglutinace, aglutinace na nosičích, komplementfixační reakce až po imunochemické metody, z nichž jsou nejrozšířenější metody ELISA.

Nepřímý (sérologický) průkaz původce se používá především tam, kde je kultivační průkaz obtížný nebo zcela nemožný – nejčastěji ve virologii a parazitologii.

Odb ěr materiálu z ákladní principy správného odběru

 Čas – u infekcí způsobených mikroorganismy je velice důležité správně načasovat odběr materiálu k mikrobiologickému vyšetření.

 Místo odběru materiálu – souvisí s druhem infekčního procesu a jeho průběhem. Zde se nejvíce projeví erudice a zkušenosti ošetřujícího zdravotnického personálu. Správný odběr musí být proveden lege artis a asepticky – za sterilních kautel.

 V případě bakteriálních infekcí je velmi vhodné odebrat relevantní materiál ke kultivaci ještě před zahájením aplikace antimikrobních přípravků.  Dalším důležitým biologickým materiálem je krev, kterou je nutné odebrat opakovaně (aspoň 2-3 hemokultury) a to jak pro aerobní, tak anaerobní kultivaci.

Hemokultivace doba odběru

Obecné pravidlo

odebrat krev

co nejdříve

klinických příznacích po prvních

Více odběrů rozložit v čase

zvětšení pravděpodobnosti zachycení bakterií

 Vždy je nutné pečlivě zvážit mikrobiologické nálezy s cílem vyloučit možnou kolonizaci či kontaminaci a správně definovat bakteriální agens, které se s nejvyšší pravděpodobností podílí na vzniku bakteriální infekce.

 Jako velmi důležitá se proto jeví úzká spolupráce mezi ošetřujícím lékařem a mikrobiologem.

Bakteriemie

 Bakteriemii lze charakterizovat jako přítomnost bakterie v krevním řečišti.

 V řadě případů se nemusí nutně jednat o probíhající bakteriální infekci a stav lze charakterizovat jako intermitentní „fyziologickou“ bakteriemii bez asociace s jakoukoliv infekcí makroorganismu.

 Klinicky významná a klinicky nevýznamná bakteriemie.

Transportní souprava – musí splňovat následující základní požadavky:

 umožnit odběr vzorku,  zajistit přežívání mikroorganismů do doby, než dojde ke zpracování vzorku v mikrobiologické laboratoři,  ochránit vzorek před vnější kontaminací,  ochránit vnější prostředí před kontaminací vzorkem,  jednoznačná identifikace vzorku a přenos nezbytných dat, většinou jsou tyto požadavky řešeny průvodkou v papírové podobě, může být i elektronický přenos dat.

Materiál odebíraný ke kultiva čnímu vyšetření lze rozd ělit do tří základních skupin:

1. Tekutý materiál - moč, krev, likvor, hnis, sputum a další tělesné tekutiny či tkáně v tekutém stavu.

   Odebírají se do sterilní nádoby v dostatečném množství (min. 0,5–1 ml). Velmi důležité je, aby použitá nádoba dobře těsnila a nemohlo dojít ke kontaminaci materiálu či naopak okolí a zdravotnického personálu. Pro některé tekutiny (např. moč, krev) jsou speciální nádoby s kultivační půdou.

2. Tuhý materiál stolice atd.



Pro odběr pravidla materiál.

jako platí pro

tkáně,

stejná tekutý

3.

   

Výtěry

Slouží k odběru malého množství materiálu nebo tam, kde není možné odebrat materiál jiným způsobem.

Základní výtěrovkou je sterilní špejle nebo drát na jehož konci je namotán chomáček vaty, která může být nasycena aktivním uhlím.

Výtěrovka je uchovávána v plastové zkumavce nebo plastovém obalu. Před odběrem je vhodné namočit vatový konec ve sterilním fyziologickém roztoku, aby se zabránilo vyschnutí a odumření zachycených bakterií během transportu do laboratoře.

Sice dražší, ale z hlediska záchytu bakterií výhodnější, jsou výtěrovky s transportním kultivačním polotuhým médiem. Tyto výtěrovky není nutné před použitím zvlhčovat a kultivační půda zlepšuje možnosti přežití transportu u většiny citlivých a kultivačně náročných bakterií.

k Odb ěr materiálu sérologickému vyšetření

 Pro sérologická vyšetření se odebírá 5-10 ml plné (srážlivé) krve, která se v laboratoři centrifuguje.

 Vlastní stanovení protilátek se provádí ze séra.

 Pro sérologickou diagnostiku infekčních onemocnění je velmi důležité sledovat dynamiku titru protilátek.  Je tedy nutné odebírat dva vzorky, druhý s časovým odstupem 1-3 týdnů.

1.

Základní principy odběru biologického materiálu k mikrobiologickému vyšetření lze definovat následujícími body: 2.

3.

4.

5.

Na základě znalosti povahy a průběhu infekčního procesu odebrat právě ten materiál, v němž se infekční agens nalézá a lze ho nejsnáze prokázat.

Správná technika odběru vhodnými nástroji a do vhodných odběrových nádob.

Sterilní způsob odběru, aby nedošlo ke kontaminaci odebíraného vzorku.

Odebírat materiál pokud možno před podáním antibiotik. Jestliže léčba již byla zahájena, je nutno na tuto skutečnost laboratoř upozornit.

Opakovat odběr v případech, kdy jednorázové vyšetření neposkytuje záruku záchytu mikroba nebo dostatečnou možnost závěrečné diagnózy. Platí to zejména pro vyšetření sérologická, ale mnohdy také pro přímý průkaz infekčního agens.

Transport materiálu

 Obecně platí, že transport materiálu ke kultivačnímu vyšetření má být co nejrychlejší. Každá prodleva zmenšuje možnost diagnostiky, zejména v případě růstově náročných bakterií.

 Relativně nejlépe vydrží mikrorganismy podmínky a dobu transportu v tekutém materiálu a v hemokulturách.

Hůře je na tom tuhý materiál a tkáně, které osychají.

Tomu se dá zabránit transportem ve fyziologickém roztoku, což může vést při malých počtech bakterií k jejich vyplavení a falešně negativní mikroskopii.

 Nejvíce citlivé na dobu transportu jsou výtěrovky bez transportního média.

 Většina bakterií podílejících se na patogenních procesech u člověka snáší bez problémů teplotu 4–8  C. Snížení teploty zpomalí jejich metabolické procesy a bakterie lépe vydrží nepříznivé podmínky.  Bohužel, některé důležité patogeny jako například

Neisseria gonorrhoeae

nebo

Neisseria meningitidis

mohou již při této teplotě hynout.

 Naopak vyšší teplota (25–30  C) může v prostředí s dostatkem živin způsobit přemnožení některých bakterií, které jsou součástí běžné flóry a potlačení patogenních původců (např. koliformní tyčinky potlačí  hemolytické streptokoky).



Hemokultury

– skladování i transport jsou nejvhodnější při pokojové teplotě. U lahviček do automatických systémů Bactec a BacT/Alert výrobci garantují dobu 24 hodin při pokojové teplotě od inokulace lahvičky po vložení do přístroje. Nízká teplota je v těchto případech nevhodná – prodlužuje dobu následné kultivace a tím i čas detekce pozitivní hemokultury.



Likvor

– vzhledem k důležitosti materiálu by se měl co nejdříve dopravit do laboratoře, která je schopna jej zpracovat. Pro transport je vhodnější pokojová teplota, příliš nízká teplota by mohla negativně ovlivnit kultivaci

Neisseria meningitidis

.



Hnis, putridní materiál, nekrotické tkáně

uchovávat při teplotě 4–8 –  C. Event. přítomné koliformní bakterie mohou být při vyšší teplotě příčinou kvasných procesů s tvorbou plynu a způsobit porušení obalu a kontaminaci jak odebraného materiálu, tak i okolí tímto materiálem.



Stolice

- uchovávat při teplotě 4–8  C z důvodu velmi vysokého rizika kvasných procesů a výše uvedených následků.



Moč

– vzhledem k většinou snadné dostupnosti tohoto materiálu by jakékoliv skladování nemělo připadat v úvahu. Při transportu je nutné udržet pokud možno nízkou teplotu. V moči mohou být i fyziologicky přítomné bakterie a moč představuje dobrou kultivační půdu (může obsahovat glukosu a bílkoviny). Při vyšší teplotě (např. v letních měsících) dochází už během dvou hodin k pomnožení event. fyziologicky přítomných bakterií na vysoké kvantity a k falešně pozitivním výsledkům.



Sputum, bronchoalveolární laváž

teplotě 4–8  C.

přemnožení koliformních bakterií.

- uchovávat při Vyšší teplota může způsobit



Výtěrovky bez transportního média

skladování podstatným způsobem – jakékoliv snižuje pravděpodobnost záchytu původce. Doba od odběru materiálu do zpracování v laboratoři by neměla přesáhnout dvě hodiny.



Výtěrovky s transportním médiem

– transportní medium umožňuje přežívání většiny bakterií, uplatňujících se v patogenezi bakteriálních infekcí, v závislosti na jejich odolnosti a růstových vlastnostech. V každém případě by doba skladování a transportu neměla přesáhnout 24 hodin.

Klinický materiál Podmínky transportu

Výtěr tamponem bez transportního média Výtěr tamponem s transportním médiem Moč Jakékoliv skladování snižuje pravděpodobnost záchytu původce.

Doba transportu by neměla přesáhnout 2 hodiny při 4 o C.

Transportní médium umožňuje přežívání většiny bakterií, zachovává i jejich původní kvantitativní poměry.

Doba skladování a transportu by neměla přesáhnout 24 hodin při teplotě 4 °C.

Vzhledem k většinou snadné dostupnosti tohoto materiálu by jakékoliv skladování nemělo připadat v úvahu (výjimečně až 18 hodin při 4 o C).

I při transportu je nutné udržet nízkou teplotu. V moči mohou být v nízkém počtu přítomny bakterie bez klinického významu. Při vyšší teplotě (např. v letních měsících) dochází už během dvou hodin k jejich pomnožení na vysoké kvantity a k falešně pozitivním výsledkům (moč může obsahovat glukosu a bílkoviny, proto představuje dobrou kultivační půdu).

Sputum Nutný rychlý transport. Uchováváním při 4 k o C by mohlo dojít úhynu náročnějších bakterií, při vyšších teplotách k nežádoucímu pomnožení kontaminující ústní mikroflóry a zkreslení kvantitativních poměrů.

Hemokultura Likvor Hnis, punktát, bioptický materiál U lahviček do automatických systémů Bactec a BacT/Alert výrobci garantují možnost 24h inkubace při pokojové teplotě před vložením inokulované lahvičky do přístroje. Nízká teplota je v těchto případech nevhodná – prodlužuje dobu následné kultivace a tím i čas detekce pozitivního vzorku.

Vzhledem k důležitosti tohoto materiálu je nutný co nejrychlejší transport do mikrobiologické laboratoře a jeho okamžité zpracování. Pokud nelze transport realizovat okamžitě, je možné ho inokulovat do lahvičky pro hemokulturu a ponechat při pokojové teplotě.

Uchovávat při teplotě 4 °C. Přítomné bakterie mohou být při vyšší teplotě příčinou kvasných procesů s tvorbou plynu a způsobit porušení obalu.

Stolice Uchovávat při teplotě 4 °C z důvodu vysokého rizika kvasných reakcí.

1. den pacient s předpokládanou

materiál průběhu

infekcí

např. moč, stolice, krev, likvor, hnis sérum Schéma časového k detekci bakterií nebo jejich exoproduktů k detekci protilátek mikrobiologického

mikrobiologická laboratoř

vyšetření mikroskopické vyšetření kultivace sérologické testy

předběžné hlášení

rychlotesty (detekce antigenů, produktů metabolismu, genomu atd.)

2. den vyšetření izolovaných bakteriálních kolonií předběžné

rychlé provedení biochemických

výsledky

identifikační testů testy provedení testů citlivosti na antibiotika

3. den

vyhodnocení identifikačních testů a testů citlivosti prodloužená inkubace bakterií k antibiotikům (v případě potřeby, např. kultivace kvasinek, plísní, anaerobních bakterií, mykobakterií) interpretace získaných výsledků mikroskopických, kultivačních, identifikačních, se zřetelem na druh materiálu, konkrétní onemocnění, antibiotickou léčbu, a event. další faktory detekce protilátek, event. v případě párových vzorků, posouzení dynamiky

konečný

tvorby protilátek

výsledek