Transcript 免疫组织化学技术
免疫组织化学技术 陈 芸 第一节 免疫组织化学技术 免疫组织化学（Immunohistochemistry） 或免疫细胞化学 （Immunocytochemistry）是利用抗原 抗体特异性结合的原理，主要用标记抗 体追踪定位抗原，以确定组织和细胞中 的某种化学物质。 免疫组织化学的基本原理，是用标记物或 显色物标记的抗体检测组织或细胞内的抗 原，用于疾病的诊断或研究。 新鲜组织的冻存 新鲜组织离体后应及时冻存，如需送至其他 实验室冻存可先置于4℃生理盐水中，但时 间不宜超2～6过小时。制备冻块的原则是 低温及速冻。速冻的目的是使抗原迅速固定 和防止冰晶形成，冰晶形成将破坏细胞结构。 低温速冻的方法有：丙酮–干冰法、液氮法。 石蜡包埋的组织固定及脱水包埋 用于石蜡包埋的组织及时取材后应立即置于 适当的固定液中，组织块不宜过大，以免固 定剂及其以后处理过程中液体不宜穿透组织， 一般为1×1×0.3cm大小。 固 定 对固定液的要求是：①能保存抗原的完整性， 防止抗原的弥散；②不影响抗原–抗体反应； ③保留良好的组织形态和结构；④检测不同 的抗原要求不同的固定液，应根据定位的抗 原分子大小，结构和性质而选择合适的固定 液。 10%中性缓冲福尔马林液 40%甲醛10ml，0.01mol/L pH7.4的 PBS90ml 影响固定的因素 固定时间 固定时间过短将影响抗原的固定 和细胞形态，过长能引起抗原遮盖或抗原 变性，因而要选择一合适的固定时间。 固定温度 一般固定剂的固定作用随温度升 高而加强，固定的温度以室温最为常用。 固定的注意事项 组织标本慎防干涸，应尽快地放入固定液固 定；组织块不大于2cm2，厚0.5cm；固定 液量一般不少于200毫升；固定后组织标本 应彻底冲洗以去除过量的固定液。 组织的脱水、透明、浸蜡和包埋 组织切片 载玻片的处理 ﹙1﹚载玻片的清洁 新载玻片常附有油质， 故必须经清洁液浸泡，流水 漂洗后用蒸馏水清洗，然后浸泡于95﹪酒 精内，再用绸布擦干备用。 ﹙2﹚黏附剂 为了确保染色过程不脱片， 清洁后的载玻片宜涂黏附剂。涂黏附剂后玻 片可置65℃恒温箱内干燥过夜后备用。 冰冻切片 石蜡切片 免疫组织化学染色 内源性酶和内源性生物素的阻断 内源性过氧化物酶主要见于红细胞的血红 蛋白，中性粒细胞内的髓过氧化物酶及单 核细胞，嗜酸性细胞和组织内的过氧化物 酶。 阻断剂：3% H2O2–甲醇液，10～15分 钟 内源性碱性磷酸酶 内源性碱性磷酸酶主要见于中性粒细胞和内 皮细胞。 阻断方法是应用1M左旋咪唑。 内源性生物素 有些脏器（如肝、胰腺及肾）的细胞含有 多量的生物素或类生物素物质，它们能与 卵白素反应。 非特异性背景染色 第一抗体前加与制备第一抗体相同动物的非 免疫血清，封闭组织上带电荷集团而除去与 第一抗体非特异性结合 增强特异性染色的方法 蛋白酶消化法 其作用是暴露抗原，增加组织和细胞的通 透性，以便抗原与抗体最大限度的结合， 增强特异性染色和避免非特异性染色。常 用的有胰蛋白酶、胃蛋白酶、琏蛋白酶等 合适的抗体稀释度 抗体的浓度是免疫染色的关键，如果抗体浓 度过高，抗体分子多过于抗原决定簇，可导 致抗体结合减少，产生阴性结果。此阴性结 果并不一定是缺少抗原，而是由于抗体过量， 这种现象类似于凝集反应中的前带效应 （prozone effect） 抗体稀释度应根据：①抗体效价高，溶液中 特异性抗体浓度越高，工作稀释度越高；② 一般讲，应用的抗体稀释度越大，温育时间 越长；③对于抗体中非特异性蛋白的，只有 高稀释度时才能防止其非特异性背景染色； ④稀释用缓冲液的种类，标本的固定和处理 过程等也可以影响稀释度，所以合适的稀释 度应根据具体情况测定。 温育时间 大部分抗体温育时间为30～60min，必 要时可4℃过夜（约18h）。温育的温度常 用37℃，也可在室温中进行，对抗原抗体 反应强的以室温为佳 热诱导的抗原修复 抗原修复（antigen retrieval；AR）是以高温 高压对常规固定石蜡切片进行抗原修复处理， 可以提高抗原抗体阳性检测率，同时也会出 现假阳性 。现已广泛应用于免疫组织化学各 领域的研究。 热诱导的抗原修复应注意的问题： 热处理后应注意自然冷却。 热处理液不要让其煮干。 不要任何抗原的检测都使用该方法。 一批抗原的检测其温度和时间一定保持一致。 形态学结构的改变：一般经高温修复后胞浆无明显的破 坏，而对细胞核的影响较大，会出现核破裂，苏木素淡 染等现象。而经酶水解的切片，其细胞浆破坏要视消化 时间而异，但核的破坏较轻。 如果在常用的缓冲液中无法实现抗原修复，或经 修复后抗原定位发成改变，可改用一些不常用的 缓冲液，或加一些螯合剂，如EDTA和EGTA等可 改尚某些抗原的修复。 呈色反应条件 底物的浓度 底物的浓度是决定酶反应速度 的重要因素之一。在酶速反应之初，增加底 物浓度能加快反应速度。如H2O2作为过氧 化物酶形成有色终末产物的底物，若浓度较 大将使显色反应极快，而致背景加深。而且 过量的H2O2将产生底物抑制的酶动力现象。 而抑制酶与底物形成复合物。 底物溶液的pH值 酶与底物的反应同底物的 电离状况有关。底物的带电状态决定于pH 值。因此pH值的调节对于底物的最适电离 状况十分重要。另外，酶在其最适pH值时 活性表现最大而稳定。因此应按酶和底物的 最适pH值配置底物反应溶液。 最适温度 常用的温度为15～37℃。 反应时间 酶与底物的呈色反应的快慢有所 不同。辣根过氧化物酶在适合的条件下为 5～15分钟。一般可在显微镜下观察，当特 异性染色清楚而背景清晰时可终止反应。 复 染 根据所用的底物溶液而选择复染液 DAB 有色终末产物不溶于酒精和有机溶剂， 可用醇性染料复染、脱水，有机溶剂透明和封 固。复染过程：a、漂洗切片以除去未反应的 底物；b、Harris苏木素复染；c、流水洗涤； d、1%盐酸酒精分化；e、流水冲洗，温水蓝 化；f、梯度酒精脱水；g、二甲苯透明；h、 中性树胶封固。 AEC和氯-萘酚：有色终末产物溶于酒精和 有机溶剂，不能在醇性试剂中复染、脱水， 并应用水溶剂封固。复染过程：a、漂洗切 片以除去未反应的底物；b、Mayers苏木素 复染；c、流水冲洗，温水蓝化；d、湿润情 况下水性封片剂封固。AEC易氧化引起退色， 故封片时应避免气泡进入。应避免使用含有 聚乙烯醇的封固剂，因为一段时间后其能溶 解可溶性有色终末产物。 对 照 常用的对照方法包括：①阳性对照；②阴性 对照；③阻断试验；④替代对照；⑤空白对 照；⑥自身对照；⑦吸收试验。 阳性对照 用已知抗原阳性的切片做对照，与待检标本 同时进行免疫组织化学染色，对照切片应呈 阳性结果，称为阳性对照。证明全过程均符 合要求，尤其当待检标本呈阴性结果时，阳 性对照尤为重要。 阴性对照 用确认已知不含抗原的标本作对照，应呈 阴性结果，称为阴性对照，是阴性对照的一 种。其实替代、空白、阻断、吸收试验都属 阴性对照。当待检标本呈阳性结果时，阴性 对照就更为重要，用以排除假阳性。 染色结果的判断 阳性细胞染色分布有三种类型：①胞浆；②细胞核；③ 细胞膜表面。大部分抗原见于细胞胞浆，根据抗原含量 染色可见于整个胞浆或部分胞浆。 阳性细胞分布可见于灶性和弥漫性。 不是所有的细胞都含有同等数量的抗原，所以染色强度 不一。如果缺乏细胞间的不一致，染色常提示其反应为 非特异性染色。 阳性细胞染色定位于单个细胞，且与阴性细胞互相交杂 分布；而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一 片细胞。 切片边缘、刀痕或皱折区域，坏死或挤压细胞趋不能用 于判断阳性细胞，常表现为相同的染色强度。 染色失败的原因 所染的全部切片均为阴性结果，包括阳性对 照在内，原因可能是：①染色未严格按操作 步骤进行；②漏加一种抗体，或抗体失效； ③缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性； ④底物中所加H2O2量少或失效；⑤复染或脱 水剂使用不当。 所有切片均为弱阳性反应：①切片在染色过 程中抗体果农，或干燥了；②缓冲液配置中 未加氯化钠和pH不准确，洗涤不彻底；③使 用已变色的呈色底物溶液，或呈色反应时间 过长；④抗体温育时间过长；⑤H2O2浓度过 高，成色速度过快；⑥粘附剂太厚。 所有切片背景过深：①为用酶消化处理切片； ②切片或涂片过厚；③漂洗不够；④底物呈 色反应过久；⑤蛋白质封闭不够或所用血清 溶血；⑥使用全血清抗体稀释不够。 .阳性对照良好，检测性标本呈阴性反应，固 定和处理不当是最常见的原因。