Transcript HE技术操作规范(2)
HE技术操作规范 广医附一院 病理科 第一步：固定 固定能防止组织自溶及腐败，尽量保持组织原貌 固定液通过以下机制稳定蛋白： – 相互交联：甲醛与蛋白质交联 – 蛋白沉淀：蛋白变性沉淀 合理固定很重要，为了： • 防止组织在处理中受损 • 经处理组织能易于切片 固定不当的后果 固定不当会导致手工及自动IHC及ISH检测结果 出现片状或不正常染色，从而影响免疫组化检测 结果判定 固定不全过程 – 交联过程发生较慢，很易逆转 – 若固定时间过短，会发生交联不全，组织将被下一步 的乙醇固定 – 经乙醇沉淀的蛋白其抗原结构会改变，因而不适用于I HC及ISH检测 固定过度 – 固定时间过长可能导致假阴性检测结果 – 过度多聚化阻止了抗原暴露，因而影响抗原修复 影响固定的因素 组织类型 从标本手术切除至开始固定的时间 待检标本的体积及厚度 固定液类型 （10%福尔马林） 固定液与组织体积比 （至少10：1） 固定的时间 温度 从标本离体到开始固定的时间 为防止组织自溶，待检组织从手术离体至开始固 定之间的时间应尽可能短 – 乳腺癌最多 1小时 – 胃癌应控制在 20–30 分钟内 固定液种类 推荐10%中性缓冲福尔马林（NBF）作为乳腺 癌及胃癌组织的固定液（IHC或ISH） – 10% NBF等同于4%甲醛溶液 – 交联简单的固定液 应使用新鲜福尔马林溶液，福尔马林贮备液应： – 定期更换 （最多贮存6个月） – 室温贮存 – 标记生产日期或稀释浓度以及过期日期固定不当会导 致手工及自动IHC及ISH检测结果出现片状或不正常 染色，从而影响免疫组化检测结果判定 固定时间 乳腺组织 – 用于HER2检测的手术切除组织样本(IHC或ISH检测)， 一般固定6–48小时 胃组织 – 手术切除及活检组织样本，一般固定8–48小时 固定时间取决于待检组织类型--组织取样手段， 组织厚度及固定液 不同的检测程序应使用优化的相应固定时间 第二步取材 组织块的面积通常为2.0cmX1.5cm，厚度不超 过3.0mm。太大太厚的组织块常会固定不充分， 而影响脱水和制片。 第三步：脱水 目的：因为石蜡不溶于水，所以需从组织中除去 水分 梯度脱水：75%，85%、95%，100%乙醇 若无乙醇，其他溶剂例如异丙醇亦可用于脱水 第四步：透明 因乙醇和石蜡不相溶，所以需用另外一种溶剂 用于透明的溶剂既能同乙醇混溶，又能与石蜡混溶 常用透明剂包括： – – – – 二甲苯 L－苧烯 氯仿 松节油（TO） 使用“透明”该词是因组织会变为透明 第五步：浸蜡 浸蜡过程中，液体石蜡代替透明液以利于进行超 薄切片 推荐使用溶点为56–58oC的新鲜石蜡 应避免浸蜡时间过长 经合理石蜡包埋的乳腺及胃组织在进行切片之前， 可在室温下(20–25oC)无限期地贮存 组织处理仪 影响组织处理的因素 –热 增加浸润速率 – 真空 有助去除: –残余空气 –之前溶剂 – 压力 起搅拌作用 第六步石蜡包埋 将需要切片的面靠近包埋盒 小组织尽量聚集在一起 注意管腔、皮肤等组织的位置 第七步切片 切片机的种类 直推式 轮转式 切片的方式 干切 湿切 切片厚度会影响显色及检测数据分析 – 组织切片厚度标准 3–5 μm. 可用经校准过的超薄切 片机切片 切片需贴在粘合性强的载玻片上 (可使用经多赖 氨酸防脱片处理的玻片)，贴片后将载玻片置于 室温下风干12-24小时或于60℃烘干1小时 – 经多赖氨酸防脱片处理的玻片 – 厂商试剂盒及/或自动化染色平台需配合指定玻片使用 最好在HER2免疫组织化学染色检测前才开始切片 – 如果过早切片，让切片暴露在室温太久，容易造成组织细胞抗原 性受损 – 应尽可能在切片后两星期内进行染色 – 切片最长保存期为4-6星期 切片应从以下细胞组织区域提取 – 乳腺内的侵袭性癌细胞组织 – 食管及胃交界癌的代表性癌细胞组织 例如混合癌中的胃腺癌组织区域及非坏死或无感染区域 第八步捞片 用玻片从冷水盆上捞起蜡片，后把蜡片放在50℃ 上清水上展平并捞起切片 第九步烤片 常用温度60-70℃ 烤片时间：最少30分钟 57 ℃过夜 温度过高、时间过长会导致蛋白变性 温度过低、时间过短烤片不充分、石蜡不溶，拖 拉不彻底 第十步脱蜡至水 用二甲苯(或二甲苯代替品)为石蜡切片脱蜡，再 用无水乙醇梯度稀释液回水 石蜡必须彻底清除，否则将影响染色，减低特异 性染色及提高非特异性背景染色 步骤 取一黏有石蜡切片的载玻片，在室温下依序作以下操作： 1. 放在二甲苯I中浸泡10分钟 2. 放在二甲苯II中浸泡10分钟 3. 放在100%乙醇中浸泡两次，每次30秒 4. 放在95% 乙醇中浸泡两次，每次30秒 5. 放在80%乙醇中浸泡一次，每次30秒 6. 放在75%乙醇中浸泡一次，每次30秒 7. 蒸馏水洗 8. 在纸巾上轻敲载玻片沥干多余的缓冲液，用吸水纸抺干 组织周围 第十一步：HE染色（苏木素-伊红染色） 原理 利用细胞内外的酸碱度与苏木素、伊红进行化学 反应；即细胞核（酸性）与碱性苏木素进行反应 形成蓝色；细胞质（碱性）与酸性伊红进行反应 形成红色。 步骤 二甲苯I、II各10min 100%酒精I、II，95%酒精I、II，80%酒精，蒸馏水 各1min。 苏木精染液15min，流水冲洗1.5min。 0.5%盐酸酒精分化5s，流水冲洗1min。 饱和碳酸锂水溶液1min，流水冲洗10min。 1%伊红染液染40s，水洗 。 80%酒精，95%酒精I、II，80%酒精，100%酒精I、 II。 二甲苯I、II各1min 。 第十二步：封片 封片剂：中性树胶、甘油等 重要提示 注意在任何情况下都不能让组织干透 尽量减少封片液用量 染片结果 细胞核成蓝色 细胞质成红色 红蓝对比清晰、切片完整、没刀痕皱褶等 HE染色的关键 固定 脱蜡 染色：苏木素染色时间 0.5%的盐酸酒精分化 伊红染色 脱水情况等 感谢大家的聆听！