Transcript 维生素的测定
第十一章 维生素的测定 §11.1 概述 §11.2 脂溶性维生素的测定 §11.3 水溶性维生素的测定 第一节 概述 一、维生素简介 维生素共同特点： 这些化合物或其前体化合物都在天然 食物中存在；它们不能供给机体热能。也 不是构成组织的基本原料，主要功用是通 过作为辅酶的成份调节代谢过程，需要量 极小；它们一般在体内不能合成，或合成 量不能满足生理需要，必须经常从食物中 摄取；长期缺乏任何一种维生素都会导致 相应的疾病。 二、维生素分类 脂溶性维生素： VA 、VD 、VE 、VK 水溶性维生素： B族维生素 、 VC 生物鉴定法 三、维生素的测定方法 微生物法 化学法 仪器法 第二节 脂溶性维生素的测定 VA、VD、VE、与脂类物质一起存在于食物 中，摄食时可吸收，可在体内积贮。 脂溶性维生素具有以下理化性质： 1．溶解性：脂溶性维生素不溶于水，易溶于 脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有机溶剂。 2．耐酸碱性：维生素A、D对酸不稳定， 对碱 稳定，维生素E对碱不稳定，但在抗氧化剂存在 下或惰性气体保护下，也能经受碱的煮沸。 3. 耐热性、耐氧化性： 耐热性 VA 好，能经受煮沸 氧化性 易被氧化 （光、热 促进其氧化） VD 好，能经受煮沸 V E 好，能经受煮沸 不易被氧化 在空气中能慢慢被化 （光、热、碱促进其氧化） 根据上述性质．测定脂溶性维生素时，通常： 皂化样品 水洗 有机溶剂 提取 浓缩 溶于适当的溶剂 测定 维生素A 的功能： 维持正常视觉; 维持上皮的正常生长与分化; 促进生长发育; 抑癌作用; 维持机体正常免疫功能。 维生素A存在于动物性脂肪中，主要来源于肝 脏、鱼干油、蛋类、乳类等动物性食品中。植物性 食品中不合VA，但在深色果蔬中含有胡萝卜素，它 在人体内可转变为VA，故称为VA原。 国际单位：IU （International Unit) 1 IU = 0.3μg VA = 0.025 VD = 1.79 μgβ-胡萝卜素 = 3 μg VB 一、比色法测定VA 的含量 （一） 原理 VA 在三氯甲烷中与三氯化锑相互作用， 产生蓝色物质，其颜色深浅与溶液中所含 VA的含量成正比，在 620nm波长下测定其 吸光度。 （二）测定方法 1 ．样品处理 1）皂化法 皂化 提取 称样 三角瓶 加热回流30min 分液漏斗 50%KOH，乙醇 乙醚洗皂化瓶 洗液并入分液漏斗、分层 水层反复用乙醚抽提，至无VA 醚层不再使SbCl3—CHCl3溶液呈蓝色 洗涤 合并醚层 20mL 0.5mol/L KOH洗涤 水洗 水洗(至不呈碱性) pH试纸或酚 酞指示剂 除去醚溶性酸皂 浓缩 水浴 醚液经无水硫酸钠滤入三角瓶 减压抽干 三氯甲烷 蒸馏至剩约5mL乙醚 研磨至样品中水分完全被 吸收，并均质化。 2) 研磨法 研磨 称样 研钵（盛有无水硫酸钠） 使样品中V A 溶于乙醚 提取 乙醚，振摇抽提 静置或离心澄清 70-80℃水浴中抽气蒸干 取2-5mL 具塞锥形瓶 比色管 立即加lmLCHCl3溶解 2．标准曲线的绘制 吸取VA标液 1mL标液 容量瓶 比色杯 CHCl3定容 乙酸酐l滴 620nm处，l0mLCHCl3加1滴乙酸酐调零 迅速加9mLSbCl3- CHCl3溶液，6s内测A SbCl3有腐蚀性，不能 粘在手上。SbCl3与水 能生成白色沉淀，不 能碰到水，所以加入 乙酸酐脱水。 SbCl3与VA生成的蓝色 物质很不稳定，要在 6S内完成测定，否则 蓝色反应逐渐消失， 使结果偏低。 3．样品测定 样品空白液： 样品液： 1mLCHCl3 1mL样液 1滴乙酸酐 1滴乙酸酐 以下同标准曲线的制作，分别 测样品空白液和样液的A （三）计算 - 0 式中： X―样品中VA含量，mg/100g（如按国际单位 1IU = 0.3g VA) ―由标准曲线上查得VA的含量， g/mL ; m ―样品质量，g ; V 一提取后加三氯甲烷定容的体积， mL 。 第三节 水溶性维生素的测定 水溶性维生素B1、B2和C，广泛存在于动植物组织 中，饮食来源充足。但是由于它们本身的水溶性质， 除满足人体生理、生化作用外，任何多余量都会从尿 中排出。为避免耗尽，需要经常地由饮食来提供。 水溶性维生素的性质： 易溶于水，而不溶于苯、乙醚、氯仿等大多数 有机溶剂。在酸性介质中很稳定，既使加热也不破 坏；但在碱性介质中不稳定，易于分解，持别在碱 性条件下加热，可大部或全部破坏。它们易受空气、 光、热、酶、金属离子等的影响； 维生素C对氧、铜离子敏感，易被氧化。 四、维生素C的测定 维生素C有抗坏血病的作用，所以又称作抗坏血 酸。维生素C广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、 蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、柿子叶、猕猴桃、柑 桔等食品中含量尤丰富。 提取剂： 草酸、草酸-乙酸、偏磷酸-乙酸溶液 草酸价廉，使 用方便，对VC 有很好的稳定 作用。 偏磷酸本身不稳定，与水结合逐 渐变成磷酸，只能保存 7-10d ， 且价格较贵、溶解费时，但它能 沉淀蛋白质、澄清提取液，适合 于蛋白质含量高的样品。 还原性： 食品分析中的所谓总抗坏血酸是指抗坏血酸和 脱氢抗坏血酸二者的总量，不包括 2 , 3 -二酮 古乐糖酸和进一步的氧化产物。 方 法: 测得的都是抗坏血酸和 脱氢抗坏血酸的总量 靛酚滴定法、苯肼比色法、荧光法和HPLC法等 测的是还原型抗 坏血酸，简便， 也较灵敏，但特 异性差，样品中 的其他还原性物 质（如 Fe2+、 Sn2+、 Cu+等） 干扰，结果往往 偏高。 受干扰 的影响 较小， 准确度 较高。 可同时测得抗 坏血酸和脱氢 抗坏血酸的含 量，具有干扰 少、准确度高、 重现性好、灵 敏、简便、快 速等优点，是 目前最先进的 方法。 一）荧光法 样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化生成脱氢 型抗坏血酸后，与邻苯二胺（ OPDA ）反应生成 具有荧光的喹喔啉，其荧光强度与脱氢抗坏血酸的 浓度在一定条件下成正比，以此测定食物中抗坏血 酸和脱氢抗坏血酸的总量。 活性炭对抗坏血酸的氧化作用,是 二）苯肼比色法 基于其表面吸附的氧进行界面反 应, 加入量过低, 氧化不充分，结 果偏低, 加入量过高，对抗坏血 （一）原理 酸有吸附作用, 结果也偏低. 样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化后成 脱氢抗坏血酸，再与 2 , 4 -二硝基苯肼作用，生 成红色脎，其呈色强度与总抗坏血酸含量成正 比，进行比色测定。 对无色或已脱色样品，也可用溴液作氧化 剂。还可用2，6-二氯靛酚作氧化剂 。 三）靛酚滴定法 1 ．原理 还原型抗坏血酸可以还原染料 2 , 6-二氯靛酚。 该染料在酸性溶液中呈粉红色（在中性或碱性溶液 中呈蓝色），被还原后颜色消失。 2 ．操作步骤 样品中如有还原性的Fe2+、Sn2+、 1) 样品制备 称样 Cu+等时，会使结果偏高。在提取时， 可加人 EDTA 等鳌合剂。 鲜样加1:1 2％草酸打成匀浆， 干样则加1％草酸磨成匀浆 用1％草酸定容至 l00mL 过滤 也可在偏磷酸-乙酸溶液中提取（见荧光法） 2) 滴定 吸取滤液5-10mL 快速加入 2, 6 -二氯靛酚 直至红色不立即消失 同时做空白 50mL三角瓶 然后一滴一滴加， 至粉红色15 s 内 不消失为终点 3 ．结果计算 式中：x ― 样品中还原型抗坏血酸含量， mg/100g ; V―滴定时样液消耗染料的体积， mL ; V0―空白滴定时消耗染料的体积， mL ; ―用标准还原型抗坏血酸溶液标定染料溶液所 得出1mL染料溶液相当于抗坏血酸的量，mg/mL ; m―滴定时所取滤液中含有样品的质量，g 。 皂化瓶内混合物 水洗 乙醚洗 分液漏斗1号 提 取 振摇，静置，分层 醚层 水层 分液漏斗2号 振摇，静置，分层 醚层 水层 分液漏斗3号 分液漏斗1号 振摇，静置，分层 醚层 水层 水洗 分液漏斗1号 振摇，静置，分层 水层 醚层 KOH溶液洗 振摇，静置，分层 洗 涤 KOH溶液层 醚层 水洗 振摇，静置，分层 水层 醚层 水洗 振摇，静置，分层 水层 醚层 分液漏斗醚层 乙醚洗涤 无水硫酸钠 浓 缩 水浴蒸馏 减压抽干 氯仿定容（5mL)