Transcript Biokataliza

Biokataliza se u hemijskoj industriji primenjuje,
kako za proizvodnju specifičnih proizvoda, tako i za
tretman otpada.
Imajući u vidu da su enzimi proteinski molekuli, koji
odgovaraju koloidima, enzimska kataliza se može
svrstati između homogene i heterogene katalize.
Često enzimski molekuli sadrže aktivne metalne
centre po čemu podsećaju na organo-metalne
komplekse u homogenoj katalizi.
Razlika je u tome, što su u slučaju enzima, ligandi
proteinski makromolekuli, pa se oni karakterišu
znatno većim molekulskim masama.
Enzimi su katalizatori sa visokom aktivnošću i
selektivnošću.
Efikasnost enzima u poređenju sa klasičnim
homogenim i heterogenim hemijskim katalizatorima
je 105-107 puta veća.
Osim visoke aktivnosti i selektivnosti, koja pored
hemijske podrazumeva regio- i enantio selektivnost,
glavna prednost enzima je u tome što oni deluju na
niskim temperaturama, u vodenim rastvorima i na pH
oko 7.
Budući da enzimi deluju u blagim uslovima, utrošci
energije su mali.
Zbog visoke aktivnosti i selektivnosti enzimski procesi
se odvijaju brzo, željeni proizvod se dobija u visokom
prinosu jer nema sporednih reakcija koje rezultuju
stvaranjem nepotrebnih proizvoda ili otpada, pa se
može reći da biokataliza ispunjava sve principe zelene
hemije.
Jedan izolovani enzim, obično vrši jednu
transformaciju na supstratu, međutim multienzimski
kompleksi složene strukture, kao i cele ćelije koje
sadrže više enzima deluju kao bi- ili polifunkcionalni
katalizatori, tj. omogućavaju da se tokom nekog
složenog procesa, jedna za drugom odigrava veći broj
transformacija.
Razvoj biotehnologije, odnosno biokatalize je u velikoj meri
doprineo uvođenju biomase kao obnovljive sirovine u hemijskoj
industriji.
Naime, složena struktura biomase koja podrazumeva prisustvo
velikog broja reaktivnih funkcionalnih grupa čini njihovu
primenu kao sirovine u klasičnim hemijskim postupcima
komplikovanom, pa se efikasna i selektivna konverzija prirodnih
proizvoda obično može odigrati samo u prisustvu enzima, kao
prirodnih katalizatora.
Treba, takođe imati u vidu da upotreba biomase kao sirovine u
industriji ne zahteva isključivo primenu biokatalize, kao i da
postoji relativno veliki broj komercijalnih biotehnoloških procesa
u kojima se prerađuju sirovine koje ne potiču od biomase.
Glavni razlozi koji ograničavaju širu primenu biokatalize u
industriji, a odnose se na većinu enzima, su:
- njihova mala stabilnost u uslovima različitim od fizioloških,
- delovanje samo pri niskim koncentracijama supstrata,
- teškoće pri regeneraciji, i
- visoka cena.
Iz navedenih razloga od približno 4000 poznatih enzima, od
kojih je oko 400 komercijalno dostupno, svega četrdesetak
enzima se trenutno koristi u industrijskim procesima.
U enzimski katalizovanim reakcijama u industriji koriste se
cele ćelije, ekstrakti ćelija ili izolovani enzimi.
U cilju smanjenja troškova i lakše regeneracije, cele ćelije ili
enzimi se, kao i klasični hemijski katalizatori, sve češće
primenjuju u imobilisanom obliku, tj. vezuju se za pogodan
čvrst nosač.
Primeri biokatalize u idustriji
Enzimi se kao katalizatori upotrebljavaju u proizvodnji kako
masovnih, tako i „finih“ hemikalija, posebno u farmaceutskoj i
prehrambenoj industriji. Osim toga, oni se koriste za tretman
industrijskog otpada.
Ostalo: proizvodnja alkohola, stočne hrane, aditiva, primena
enzima u organskoj sintezi, analitici, medicini, dijagnostici.
Najvažniji proizvodi dobijeni primenom enzima kao katalizatora i
oblast njihove primene
Proizvodnja akrilamida
Akrilamid je važna sirovina u proizvodnji polimera,
poliakrilamida, koji se koriste u proizvodnje hartije, premaza,
kao punioci i flokulacioni agensi.
Hemijski
postupak
sinteze
akrilamida
podrazumeva
visokotemperaturnu hidrolizu akrilonitrila u prisustvu soli
bakra kao katalizatora.
Glavni problem u ovom procesu je postanak značajne količine
akrilne kiseline, kao sporednog proizvoda, usled dalje hidrolize
akrilamida.
Pored toga, akrilamid se teško odvaja i prečišćava iz reakcione
smese, a nemogućnost regeneracije katalizatora rezultira
stvaranjem značajne količine otpada.
CH2=CH–CONH2
„Nitto“ Chemical Corporation je 1985. godine razvio
biokatalitički postupak proizvodnje akrilamida, koji
podrazumeva hidrolizu akrilonitrila u prisustvu enzima nitrilhidrataze.
CH2
CH
C
N + H2O
Nitril-hidrataza
CH2
CH
CONH2
U procesu se koriste cele ćelija bakterije Rhodococcus
rhodochorous J1 imobilisane na polipropenamidnom gelu.
Dakle, i hemijski i enzimski postupak podrazumeva istu
reakciju, ali se u biokatalitičkom postupku, proces izvodi pod
blagim uslovima, na sobnoj temperaturi, pri pH 7,5 sa
prinosom od 99,99 %.
Pored toga, imobilisani katalizator se lako regeneriše i ponovo
koristi.
Proizvodnja polimera
Lipaze izolovane iz vrsta Canida antartica i Pseudomonas cepacia
katalizuju polimerizaciju slobodnih hidroksi kiselina, njihovih
estara i laktona (ciklični estri koji nastaju intramolekulskom
esterifikacijom hidroksikiselina sa –OH grupom u položaju 4 ili
dalje) u poliestre.
U slučaju laktona, kao monomeri korišćeni su laktoni počev od
butirolaktona do makrolidnih laktona sa šesnaestočlanim
prstenom. Proces se odigrava pod blagim uslovima na
temperaturi oko 60 oC i bez prisustva rastvarača.
Međutim, u ovakvim uslovima stepen polimerizacije je relativno
nizak, tako da masa dobijenih poliestra ne prelazi 10000.
Proizvodi većih molekulskih masa dobijaju se ako se reakcija
izvodi u skupim organskim rastvaračima, što ograničava
komercijalnu primenu.
Poliestri znatno većih molekulskih masa (do 130000) dobijaju
se polimerizacijom diola i dikarbonskih kiselina, ili diola i
diestara dikarbonskih kiselina, katalizovanom lipazama, pri
čemu se reakcija može odvijati i bez prisustva rastvarača.
Enzimi peroksidaze (na primer peroksidaza izolovana iz rena)
u prisustvu vodonik-peroksida katalizuju polimerizaciju parasupsitutisanih fenola.
Povezivanje aromatičnih prstenova odvija se u orto-položajima
u odnosu na fenolnu grupu.
Smatra se da najpre dolazi do oksidacije fenola u orto-difenol,
koji reaguje sa vodonikom iz orto položaja sledećeg molekula
oksidovanog fenola uz eliminaciju molekula vode.
Biokataliza u prehrambenoj industriji
Proizvodnja mleka i mlečnih proizvoda koji ne sadrže laktozu,
zasnovana je na dejstvu enzima β-galaktozidaze, koji
hidrolizuje laktozu u sastavne monomere glukozu i galaktozu.
Biokataliza je nezamenjiva i pri proizvodnji visoko-fruktoznog sirupa
čija godišnja produkcija prelazi 10 miliona tona. Kao polazna
sirovina koristi se skrob iz krompira ili kukuruza. Kiselo katalisanom
(sirćetna kiselina), enzimski katalisanom (dejstvo amilaza) ili
kombinovanom (kiselo-enzimskom) hidrolizom skrob se razlaže do
D-glukoze. Dejstvom enzima glukozo-izomeraze D-glukoza se prevodi
u
D-fruktozu.
Komercijalna
fruktoza
se
proizvodi
u
koncentracijama: 42%, 55% i 90%.
Fruktozni sirup se široko primenjuje u prehrambenoj industriji jer je
relativna slatkoća fruktoznog sirupa veća od glukoznog. Pored toga,
fruktoza daje prijatan miris hrani, ne izaziva karijes zuba, i budući,
da za njeno metabolisanje nije potreban insulin koristi se u
proizvodima namenjem dijabetičarima.
Aspartam je niskokalorični veštački zaslađivač, 200 puta slađi
od saharoze koji se široko primenjuje u prehrambenoj
(niskokalorični napitci, sladoled, kremovi, prelivi i proizvodi za
dijabetičare) i farmaceutskoj industriji.
Po hemijskom sastavu aspartam je dipeptid metilestra Laspartil-L-fenilalanina.
Industrijski, aspratam se proizvodi kuplovanjem Lasparaginske kiseline sa zaštićenom amino grupom u obliku
karbobenzoksi (C6H5CH2OCO-) amida sa metilestrom
fenilalanina u prisustvu enzima termolizina iz bakterije Bacillus
proteolicus/thermoproteolyticus.
Reakcija se odvija u vodenom rastvoru, u blagim uslovima, na
temperaturi 50 oC i pri pH 7-7,5.
Nakon sinteze dipeptida, zaštita amino grupe sa ostatka
asparaginske kiseline se uklanja hidrogenizacijom. Zahvaljujući
selektivnosti termolizina, sa molekula asparaginske kiseline
reaguje isključivo α-karboksilna grupa, što je veoma značajno
jer se izomerni dipeptid koji nastaje reakcijom β-karboksilne
grupe asparaginske kiseline i amino-grupe metilestra
fenilalanina karakteriše gorkim ukusom i veoma teško odvaja
od željenog α-dipeptida.
Pored toga, enzim je potpuno stereoselektivan u odnosu na
metilestar fenilalanina, pa se kao polazna sirovina može koristiti,
ne samo čist L-enantiomer, već i racemska smeša.
Reakcija se izvodi u višku metilestra fenilalanina, jer se u takvim
uslovima aspartam sa zaštićenom amino grupom taloži, i lako
odvaja iz reakcione smeše filtracijom.
Višak neizreagovalog metilestra fenilalanina, koji zaostaje u
filtratu po odvajanju proizvoda, se vraća u proces.
S obzirom da se pri sintezi dipeptida troši samo L-enantiomer
metilestra fenialanina, u slučaju kada je kao polazna sirovina
upotrebljena
racemska
smeša,
filtrat
sa
ostatakom
neizreagovalog estra u kojem dominira D-izomer se pre vraćanja
u proces podvrgava racemizaciji.
L-α-aminokiseline se široko primenjuju u prehrambenoj i
farmaceutskoj industriji.
Komercijalno, aminokiseline se proizvode različitim hemijskim i
enzimskim postupcima.
Međutim, hemijski postupci veoma često nisu stereoselektivni,
tako da se dobija smeša aminokiselinskih enantiomera, što
smanjenje prinos i poskupljuje proces. Najefikasniji način za
odvajanje D i L enantiomera α-aminokiselina zasniva se na
dejstvu enzima aminoacilaza.
U tom cilju racemska smeša aminokiselina se prevodi u N-acetil
derivat, a zatim podvrgava dejstvu enzima. Pri tome N-acetil
derivat L- aminokiseline podleže hidrolizi, dok N-acetil derivat Daminokiseline ostaje intaktan.
Dobijena L-aminokiselina se od N-acetil derivata
aminokiseline odvaja jonskom izmenom ili kristalizacijom.
D-
Nakon odvajanja L-aminokiseline, preostali N-acetil derivat Daminokiseline se podvrgava termičkoj ili enzimskoj (dejstvo
enzima racemaza) racemizaciji i vraća u proces.
Višestrukom racemizacijom i reciklažom neizreagovalog Nacetil derivata D-aminokiseline postiže se visok prinos.
Biokataliza se primenjuje i u
pekarstvu. Dodaju se gljivične amilaze,
-amilaza,
proteaze
i
glukoamilaza, čime se skraćuje vreme
dizanja testa i poboljšava kvalitet
proizvoda.
U proizvodnji piva se koristi
bakterijska -amilaza i proteaze za
ošećerenje skroba neslađenog zrna,
čime se povećava stepen iskorišćenja
sirovina, proces proizvodnje piva je
brži i dobija se bistriji i stabilniji
proizvod. Takođe, biokatalizatori su
nezamenjivi u proizvodnji vina i
voćnih sokova.
Enzimska hidroliza skroba (bakterijske
-amilaze i gljivična glukoamilaza).
U konditorskoj industriji, u cilju
sprečavanja formiranja kristala saharoze
u proizvodima upotrebljava se invertaza,
dok se lipaze koriste za intenziviranje
arome čokoladnih proizvoda.
U proizvodnji mesa i mesnih prerađevina
proteaze-ubrzavaju
sazrevanje
npr.
haringe, morune itd., a meso je mekše i
boljeg kvaliteta.
U industriji mleka koriste se renin, laktaze,
proteaze, lipaze, za proizvodnju sira,
skraćenje procesa zrenja i poboljšanje
ukusa mlečnih proizvoda.
Laka industrija
U obradi kože upotrebljavaju se proteaze
za omekšavanje površine kože i
uklanjanje dlaka. Za razliku od
hemijskih postupaka, na ovaj način
dobija se neoštećena koža.
U proizvodnji detergenata koriste se
subtilizin, alkalne i metalne proteaze,
lipaze, amilaze i celulaze. Primena
enzima omogućava da se proces pranja
efikasno
odvija
pri
nižim
temperaturama, što doprinosi znatnoj
uštedi energije.
U tekstilnoj industriji koriste se za:
Odskrobljavanje (amilaze);
Biopoliranje, biokamenovanje i poboljšanje
opipa tekstilnih tkanina (celulaze);
Uklanjanje voskastih nečistoća (pektinaze,
lipaze i celulaze);
Modifikaciju poliestarskih vlakana (esteraze
i lipaze);
Popravljanje sjaja i mekoće vunenih i
svilenih tkanina (proteaze);
Uklanjanje H2O2 posle beljenja (katalaza).
Proces obrade skraćuje se 7-10 puta.
Biokataliza u faramaceutskoj industriji
Od otkrića antibiotskog dejstva penicilna G, ovo jedinjenje se
proizvodi isključivo biokatalitički i predstavlja proizvod
fermentacije bakterije Penicillium chrysogenum.
6-Aminopenicilinska kiselina koja se dobija iz penicilina G je
polazna sirovina u sintezi penicilinskih antibiotika ampicilina i
amoksicilina.
Najefikasniji način za konverziju penicilina G u 6aminopenicilinsku kiselinu je enzimska hidroliza u prisustvu
enzima penicilin-acilaze.
Za razliku od hemijskog postupka, koji zahteva anhidrovane
uslove i prisustvo organskog rastvarača, biotransformacija se
odvija u neutralnoj sredini i na niskoj temperaturi, što
onemogućava dalju transformaciju reaktivnog proizvoda.
Prva faza u proizvodnji kortizona i sličnih antiinflamatornih
steroida iz progesterona, za kojom sledi nekoliko hemijskih
koraka, je biokatalitička hidroksilacija 11-og C-atoma polaznog
supstrata. Pored toga, dalja konverzija kortizona u prednizon
koja podrazumeva dehidrogenizaciju u položaju 1 prstena A,
takođe je enzimski kontrolisana i odvija se u prisustvu bakterije
Arthobacter simplex.
Sinteza vitamina C (Laskorbinske kiseline) iz Dglukoze predstavlja
jednostavan primer za
demonstraciju značaja,
prednosti i širokih
mogućnosti biokatalize.
Klasičan industrijski
postupak za proizvodnju
vitamina C iz D-glukoze
podrazumeva niz
stupnjeva: 1) redukciju Dglukoze u D-sorbitol u
prisustvu nikla kao
katalizatora; 2) selektivnu
enzimsku oksidaciju
hidroksilne grupe sa C-5
D-sorbitola u prisustvu
Glyconobacter oxydans ili
Acetobacter suboxydans
pri čemu postaje Lsorboza.
3) zaštitu hidroksilnih
grupa sa C-2, C-3, C-4 i
C-6 L-sorboze
prevođenjem u acetal
pomoću acetona u
prisustvu sumporne
kiseline; 4) oksidaciju
primarne alkoholne grupe
zaštićene L-sorboze u
diacetonski derivat 2keto-L-glulonske kiseline
u prisustvu paladijuma
kao katalizatora; 5) kiselu
hidrolizu diacetala u 2keto-L-gulonsku kiselinu i
6) konverziju 2-keto-Lglulonske kiseline u
vitamin C izomerizacijom
i intramolekulskom
esterfikacijom
(laktonizacijom).
Zbog primene sumporne kiseline u procesima građenja acetala
i njegove hidrolize proizvodnja jedne tone vitamina C
rezultira stvaranjem iste količine natrijum-sufata (aceton se
reciklira).
Pod dejstvom enzima genetski modifikovane bakterije Ervinia
herbicola moguća je direktna konverzija D-glukoze u 2-ketoL-gulonsku kiselinu, koja zamenjuje pet faza u klasičnoj
sintezi vitamina C.
Pored toga, otkriveno je da se pod dejstvom enzima laktonaze
iz vrste Zymomonas mobilis, 2-keto-L-gulonska kiselina
prevodi u vitamin C, čime se u poslednjoj fazi sinteze izbegava
upotreba metanola i mineralnih kiselina.
Uprkos otkriću ovih biokatalitičkih procesa, istraživanja u cilju
pronalaženja efikasnog i jeftinog načina za sintezu vitamina C
iz glukoze se nastavljaju.
Nedavno je patentiran postupak za direktnu konverziju
glukoze u vitamin C u prisustvu hidratisanog oksida kobalta
(CoO2xnH2O) kao katalizatora, koji se dobija tretiranjem
kobaltovih soli sa hipohlorastom kiselinom. Mehanizam ovog
procesa nije razjašnjen. Proces se odvija na sobnoj temperaturi,
pri pH 5,5 uz prinos vitamina C od 50 %. Sporedni proizvodi
reakcije, kao što je sorboza se mogu izolovati i reciklirati.
Biokataliza u tretmanu organskog otpada
Hemijski tretman organskog otpada podrazumeva kiselu ili
baznu hidrolizu, sagorevanje pri visokim temperaturama, ili
oksidaciju, koja se često odvija u prusustvu metalnih
katalizatora.
Biološka razgradnja organskog otpada podrazumeva ili njegovu
potpunu degradaciju do ugljen-dioksida, vode i neorganskih
jona, koja je označena kao biodegradacija, ili konverziju
toksičnih jedinjenja u manje toksične ili netoksične proizvode
koja se naziva biotransformacija.
Bioremedijacija je proces u kojem nativni (autohtoni)
mikroorganizmi, gljive i zelene biljke kroz svoju normalnu
životnu aktivnost degraduju i detoksifikuju zagađivače opasne
za zdravlje čoveka i/ili životnu sredinu.
Mikroorganizmi mogu oksidativno metabolisati i aromatične
ugljovodonike. Smatra se da su mikrobi „ovladali“ degradacijom
kompleksnih aromatičnih struktura zahvaljujući činjenici da se
prirodnom evolucijom kod njih morala razviti sposobnost
degradacije sveprisutnih lignina do ugljen-dioksida i vode.
Najrasprostranjeniji
mehanizam
degradacije
aromatičnih
ugljovodonika podrazumeva uvođenje dve hidroksilne grupe u
aromatični prsten (u orto ili para položaju) pomoću enzima
oksigenaza. Nakon toga, uz učešće dioksigenaza dolazi do orto ili
meta cepanja aromatičnog prstena pri čemu postaju supstituisane ili
dikarbonske kiseline.
COOH
[O]
OH
OH
[O]
[O]
COOH
Orto cepanje
CHO
COOH
Meta cepanje
OH
Drugi moguć način podrazumeva stvaranje epoksidnog
intermedijera koji se u prisustvu vode pomoću enzima hidraza
transformiše u diol.
Diol se dalje može degradovati do nezasićene dikarbonske
kiseline. Postale kiseline se lako uključuju u metaboličke puteve i
razgrađuju do CO2 i H2O.
[O]
O
H2O
OH
OH
[O]
COOH
COOH
Fenoli i njihovi derivati su česti sastojci otpadnih voda iz
industrije papira i rafinerija nafte. Imobilisane ćelije
Pseudomonas putida mogu oksidovati fenolna jedinjenja u
karboksilne kiseline pri koncentracijama fenola u vodama do
1,5 g/L. Pri sličnim koncentracijama fenola i pri visokoj
koncentraciji soli u vodi, Candida tropicalis potpuno razlaže
fenole do ugljen-dioksida i vode. Brojna fenolna jedinjenja se
mogu odstraniti iz vodenih rastvora dejstvom imobilisanih
izolovanih enzima lakaze i tirozinaze. Proces podrazumeva
oksidaciju fenola u orto-hinon i dalju spontanu polimerizaciju
hinona u nerastvorni polimer koji se lako uklanja adsorbcijom
ili ceđenjem.
Osim mogućnosti degradacije fenola, imobilisane ćelije
Pseudomonas putida, metabolišu cijanidne jone u vodenim
rastvorima do CO2 i NH3, pri koncentracijama cijanida nižim od
120 mmol/L. Vrsta bakterije Pseudomonas S1 razgrađuje
organske nitrile, kao što su akrilonitril i adiponitril najpre do
odgovarajućih kiselina, koje se dalje metabolišu do CO2 i H2O.
Neke vrste mikroorganizama mogu degradovati hlorovana
aromatična jedinjenja.
Pošto su halogeni derivati, najčešće rezistentniji na degradaciju
od svojih nehalogenovanih prekursora, glavni način remedijacije
podrazumeva njihovo dehalogenovanje koje može biti
hidrolitičko, reduktivno ili oksidativno.
Nijedan od ova tri načina nije opšti mehanizam degradacije
hlorovanih aromata.
Hidrolitičko dehalogenovanje
koje se odvija u prisustvu
bakterija vrsta Pseudomonas
i Arthobacter uglavnom je
uslovljeno
prisustvom
karboksilne
grupe
na
aromatičnom prstenu u para
položaju u odnosu na hlor.
Reduktivno dehalogenovanje
je takođe ograničeno na
relativno mali broj supstrata.
Oksidativno dehalogenovanje je najčešći mehanizam degradacije arilhlorida, koji je zapažen ne samo na mono-, već i na diaromatičnim
supstratima.
Fenolna
jedinjenja
dobijena
oksidativnim
dehalogenovanjem mogu se dalje degradovati na isti način kao i fenoli.
Enzimi
oksigenaze
različitih
mikroorganizama
konvertuju
polihlorovana
aromatična
jedinjenja
u
odgovarajuće
hlorovane fenole i hinone, koji se
dalje mogu razgraditi u prisustvu
bakterija vrste Pseudomonas.
Međutim, uzrok rezistentnosti i
sveprisutnosti
hlorovanih
aromatičnih jedinjenja u životnoj
sredini ogleda se u činjenici da
enzimske transformacije ovih
jedinjenja u velikom broju
slučajeva
ne
podrazumevaju
uklanjanje halogena.
Tako na primer metabolička transformacija herbicida metolahlora
gljivom Cunninghamella elegans rezultuje postankom nekoliko
proizvoda u kojima halogena funkcija ostaje intaktna.
Biokatalitički procesi primenjuju se i za uklanjanje eksploziva iz
zemljišta i voda. Na primer, brojni mikroorganizmi imaju
sposobnost da potpuno degraduju 2,4,6,-trinitrotoluen (TNT).
Mehanizmi razgradnje su različiti, ali procesi uvek započinju
redukcijom nitro grupa u amino grupe ili reduktivnom
dinitrifikacijom TNT-a u 2,4-dinitrotoluen.
Dakle, brojni mikroorganizmi imaju sposobnost razgradnje
različitih organskih jedinjenja koja su sveprisutna u
industrijskom otpadu. Međutim, treba imati u vidu da je
biodegradacija određenog jedinjenja ili klase jedinjenja znatno
efikasnija kada su ona „sama“ nego kada se nalaze u smeši sa
drugim tipovima jedinjenja, što donekle ograničava njenu
primenu u tretiranju kompleksnog industrijskog otpada.
Biogoriva i bioenergija
