Izolovanje_enzima.ppt
Download
Report
Transcript Izolovanje_enzima.ppt
Izolovanje i prečišćavanje enzima
• Zašto izolujemo enzime?
• Strategija prečišćavanja
- maksimalna prečišćenost
- maksimalni prinos
- maksimalno sačuvana aktivnost
Izvor enzima
- obilnost
- dostupnost (ekonomska, geografska, etička)
- komparativne studije (izoenzimi)
- lokalizacija
Ekstrakt (homogenizacija, ili prečišćavanje organela
+ homogenizacija)
Sirovi preparat (large-scale separacija)
Čist enzim (small-scale separacija, ili afinitetna
hromatografija direktno iz ekstrakta)
Faze u izolovanju
• Zahtevi za čistoćom se definišu prema konačnoj upotrebi preparata
1. vrlo visoka (99 % i više) terapeutska primena, in vivo studije
2. umereno visoka (95-99 %) x-ray kristalografija, karakterizacija fizikohemijskim metodama
3. umerena izolovanje antigena za proizvodnju antitela, N-terminalno
sekvenciranje
-
Identifikujte ključne nečistoće
Proverite stabilnost enzima (pH, jonska sila) i u skladu sa tim osmislite
strategiju izolovanja i prečišćavanja
Ukoliko niste zadovoljni čistoćom preparata, uključite nove korake
Kontaminante koji mogu da inaktiviraju enzim, ili ga denaturišu,
potrebno je ukloniti (ili inaktivirati npr. proteaze) što ranije iz smeše
(najbolje već u prvom koraku).
Osobine proteina koje se koriste
tokom prečišćavanja
• Naelektrisanje
• Veličina
• Hidrofobnost
• Bioprepoznavanje
Jonoizmenjivačka
hromatografija (IEX)
Gel filtracija (GF)
Hidrofobna hromatografija
(HIC), RPC
Afinitetna hromatografija
Enzimi dobijeni rekombinantnom tehnologijom
• Neke proteine je izuzetno teško izolovati iz prirodnih izvora
• Gen (cDNA) manipulacijom DNK se ubacuje u odgovarajući vektor
• Vektor se ubacuje u odgovarajući sistem za ekspresiju (proizvodnju):
bakterijski, biljni, insektni, sisarski.
• Manipulacijom na nivou cDNA, rekombinantni protein može da dobije
ekstra aminokiseline, ili čitave proteine (GST), u vidu fuzionog
produkta, koji ne utiču na aktivnost, ili 3D, ali mogu da olakšaju
postupak izolovanja (His tag).
• Koliko je protein dobijen rekombinantnom tehnologijom sličan
(identičan) prirodnom proteinu?
• Karakterizacija...
• Primena...
Primer postupka prečišćavanja rekombinantnog
enzima
Deacetoksicefalosporin C sintetaza (rDAOCS) je enzim osetljiv na kiseonik. Protein je “overexpressed” u
rastvornoj formi u citoplazmi E. coli. U prvom koraku, ćelije su lizirane mehaničkom silom. Pufer za
lizu je sadržavao inhibitore proteaza, pored ostalih komponenti (DTT).
Odredjivanje molekulske mase GF i SDS PAGE
Odredjivanje strukture rDAOCS
Afinitetetna hromatografija
• Enzim – analog supstrata, inhibitor, kofaktor
• Antitelo – antigen, virus, ćelija
• Lektin – polisaharid, glikoprotein, receptor na površini
ćelija, ćelija
• Nukleinska kiselina – komplementarni lanac, histoni, NK
polimeraze, NK vezujući proteini
• Hormoni, vitamini – receptor, transportni protein (nosač)
• Glutation – Glutation-S-transferaza ili GST fuzioni
proteini
• Joni metala – Poli(His) fuzionisani proteini, proteini bogati
His, Cys, Trp ostacima na površini
Protein
Vrsta kolone
GST fuzionisani proteini
GSTrap FF
Albumin i enzimi koji vezuju nukleotide
HiTrap Blue HP
Protein i peptidi sa izloženim His, Cys ili
Trp ostacima (kao i (His)6 fuzionisani
proteini
HiTrap Chelating HP
DNK vezujući proteini i koagulacioni
faktori
HiTrap Heparin HP
Tripsinu slične proteaze (Faktor Xa,
trombin i tripsin)
HiTrap Benzamidine FF
Prečišćavanje enzima: onovni problemi i postavke
Neophodan je odgovarajući test enzimske aktivnosti
Odgovarajući test za odredjivanje koncentracije proteina
Definicije: specifična aktivnost, prinos, stepen prečišćenja, broj izmena
Dnevnik postupka izolovanja i prečišćavanja (zapremina, conc., akt.)
Izbegavati one korake koji daju slab prinos i mali porast u čistoći
Neke osnovne definicije:
- Jedinica aktivnosti (1 U): Ona količina enzima neophodna za katalizu reakcije
transformacije 1 mikromola supstrata po minuti pri standardnim uslovima*.
- 1 Katal – 1 mol supstrata u 1 s
Primer: Ako 0,1 mg/mL enzima katalizuje konverziju 10 mikromola substrata po minutu, tada u 1 mL ima 10 jedinica
aktivnosti. Specifična aktivnost ovog rastvora će biti 100 U/mg proteina.
*Standardni uslovi: oni koji odgovaraju datom enzimu (pufer, prisustvo kofaktora etc).
Odnosno, kad god je moguće:
Temperatura 30 oC
pH optimum za dati sistem Enz-Sub
Koncentracija substrata na 10x poluzasićenja substratom (10 Km)
Brzina: promena koncentracije reaktanata u vremenu.
Reakciona brzina koja se odredjuje u kinetičkim eksperimentima odgovara
početnoj brzini reakcije (vi, vo).
Sprečava se efekat povratne reakcije, inhibicija proizvodom se svodi na
minimum.
- Poluzasićenje
Brzina enzimske reakcije postiže zasićenje kada je koncentracija substrata
toliko visoka da su sva aktivna mesta zauzeta (maksimalna brzina – Vmax).
Poluzasićenje enzima substratom je ona konc. substrata kada se postiže 50
% Vmax (Km – merilo afiniteta enzima za odgovarajući substrat)
Poznavanje vrednosti Km za dati sistem je moguće ukoliko se poznaje Vmax ili
nakon serije eksperimenata za odredjivanje brzine za različite konc. substrata i
»fitovanja« tih podataka u jednačinu koja opisuje oblik ove krive prema
nepoznatim vrendostima (Km i Vmax).
Koju jednačinu koristiti...
-
Nekoliko hemijskih kinetičkih modela
daje slične jednačine oblika: Y = aX/(b+X)
Analitika proteina
Elektroforetske tehnike
-
Nativna elektroforeza
Elektroforeza u prisustvu uree
SDS PAGE
Gradijentni gelovi
Izoelektrofokusiranje
Dvodimenzionalne elektroforeze
Kapilarna elektroforeza
SDS PAGE proteina ekstrakta ploda kivija
(levo neredukujući uslovi, desno redukujući)
Detekcija nakon elektroforetskog razdvajanja
-
Proteini (CBB, Ag)
Glikoproteini (Šifovo bojenje)
Antigeni (uz odgovarajuće antitelo, najčešće nakon transfera na membranu – imunoblot)
Enzimi: kao i nakon hromatografskih razdvajanja, uglavnom podrazumeva nativne uslove tj.
tehnike separacije koje zadržavaju korektnu tercijernu strukturu proteina/enzima
Detekcija enzimske aktivnosti nakon elektroforetskog razdvajanja
Sa solubilnim supstratom – podrazumeva prethodnu eluciju proteina iz gela (zametna
i neprecizna tehnika)
Sa precipitirajućim supstratom koji daje proizvod koji se može detektovati (u gelu ili
na membrani) – enzim nativan ili renaturisan
Tehnika zimograma (za proteolitičke enzime)
-
Aktinidin detektovan bojenjem CBB-om, nakon 2D PAGE
u različitim uzorcima ekstrakta ploda kivija.
Aktininidin razvojen 2D PAGE i detektovan tehnikom zimograma