Transcript 金纳米粒子 - Nano Discovery Inc.

一个新的技术，发现一个新的世界
NanoDLSay™: 纳米金粒子结合动态
光散射用于化学和生物的检测和分析
July 2012
Copyright Nano Discovery Inc. 2012 www.nanodiscoveryinc.com Tel: 407-770-8954
Email: [email protected]
Part I. 介绍
Part II. NanoDLSay™ 用于蛋白质检测与分析
Part III. NanoDLSay™ 与其他分析技术的比较
Part IV. NDS1200 – 基于 NanoDLSay™技术开发的设备
Part I. 介绍
o NanoDLSay™原理
o 怎样进行 NanoDLSay™
o 应用和案例
o 分析性能和优势
什么是 NanoDLSay™: 通过检测与目标分析物结合的金纳
米离子粒径的变化来检测目标分析物
金纳米粒子 (AuNP)
Y
Y
D = 100 nm
D » 120 nm
D » 130-160 nm
未修饰的金纳米
粒子 AuNP
金纳米粒子免疫探针
金纳米粒子免疫探针结合
一个小分子单体蛋白
Y
D > 130-160 nm
金纳米粒子免疫探针结合
一个大分子复合蛋白
2+
D >> 100-200 nm
2+
2+
2+
金纳米粒子探针通过金属螯合配体
与金属离子目标物结合
一般检测模式：通过结合目标
分析物形成金纳米粒子聚集
D >> 100 nm
金纳米粒子探针通过协调配体的相互作用
与小分子化学物质结合
两种检测模式
I. 个别粒子粒径大小增加
Y
•适合于大分子如：蛋白、复合物和病毒
•适用于动力学结合研究
Y
Y
II. 纳米金粒子聚合物形成
Y
Y
•适用于任何物质，尤其是化学
物质和离子
•提供最好的灵敏度
什么是动态光散射 (DLS):
测量纳米范围的粒径尺寸
散射光
激光束
散射光强度的动态波动
相关函数
NDS1200 Instrument
金纳米粒子特性 (AuNPs)
•
•
•
•
•
特别强的光散射特性
比荧光染料分子强105;
比聚苯乙烯（PS）乳胶颗粒强100倍
检测限很容易达到fM—aM范围
作为一个光学探针，金纳米粒子很容易从样品基质中脱颖而出
B
A
C
PS particle
Serum
AuNPs
Gold nanorods
AuNPs
A：金纳米粒子与血清的暗场光学图像
B：金纳米粒子与聚苯乙烯粒子的暗场光学图像
C：金纳米棒的暗场光学图像
怎样进行 NanoDLSay™?
• 步骤1. 准备金纳米粒子探针
• 步骤 2. 把金纳米粒子探针与样品溶液混合
• 步骤 3. 孵育待检测样品溶液
• 步骤 4. 测量待检测样品溶液的粒径大小
一个典型的实验条件:
1.把40 µL 纳米金粒子探针和 2 µL 样品溶液混合
2.在室温下孵育5-15分钟
3.分析粒径大小得到结果
读出读数: 平均粒径大小 (nm)
平均粒径大小 (nm)
剂量-反应曲线
未知样品
标准曲线
目标物浓度
金纳米粒子的生物共价制备
很容易使用，但是稳定性低；首要选择
1. 直接吸附法
~15 min
柠檬酸金纳米粒子 (100 nm)
(Ted Pella Inc.)
(1 mL AuNP + 5-10 µg 抗体)
2. 共价结合法
~30 min
阻断剂:
牛血清蛋白 (BSA) (2.5
mg/mL)
1. 离心
2. 再分散
复杂但稳定性高
NHS/EDC activation
-NH2 or -COOH
功能配体涂层的金纳米粒子
1. 离心
2. 再分散
蛋白质
病毒
NanoDLSay™
应用
小分子
化合物
DNAs
RNAs
有毒
重金属粒子
案例
Liu X, et al. A One-step homogeneous immunoassay for cancer biomarker
detection using gold nanoparticle probes coupled with dynamic light scattering. J.
Am. Chem. Soc. 2008; 130:2780-2782.
Chun C, et al. A facile and sensitive immunoassay for the detection of alphafetoprotein using gold-coated magnetic nanoparticle clusters and dynamic
light scattering. Chem. Comm. 2011, 47, 11047-11049.
Kalluri JR, et al. Use of gold nanoparticles in a simple colorimetric and
ultrasensitive dynamic light scattering assay: selective detection of arsenic in
groundwater. Angew. Chem. Int. Ed. 2009; 48:9668-9671.
Gao D, et al. An ultrasensitive method for the detection of gene fragment from
transgenics using label-free gold nanoparticle probe and dynamic light scattering.
Anal. Chim Acta 2011; 696:1-5.
Driskell JD, et al. One-step assay for detecting influenza virus using dynamic
light scattering and gold nanoparticles. Analyst 2011; 136:3083-3090.
Wang X, et al. Detection of hepatitis B surface antigen by target-induced
aggregation monitored by dynamic light scattering. Anal. Biochem. 2012, online.
需要更多文献,请访问: www.nanodiscoveryinc.com
Analytical Performance
待测物
灵敏度
动态范围
蛋白质
范围：从ng/mL到 pg/mL
2-3个数量级
DNAs
30 fM
(比SPR和5荧光技术更灵敏5个数量级)
>5个数量级
病毒
(流感病毒)
< 100 TCID50/mL
(比商业诊断试剂盒更灵敏1-2 数量级)
2-3个数量级
有毒金属离子
(铅和砷)
砷: 10 ppt (WHO 可接受的极限: 10 ppb)
铅: 100 ppt (比EPA标准限值低2个数量级)
2-3个数量级
小分子
(腺苷)
7 nM
(比比色法更灵敏5个数量级)
> 4 个数量级
爆炸物
(TNT)
100 pM
2-3个数量级
Notes:
(1) ng-纳克; fg-飞克; fM-飞摩; pM-皮摩; nM-纳摩; ppb-十亿分之一; ppt-万亿分之一; TCID50- 50%
半数组织培养感染剂量 . (2)所有数据均取自发表论文。参考出版物的详细信息列表. (3) WHO: 世界
卫生组织; EPA: 环保局.
Analytical Performance
NanoDLSay™和其他方法检测DNA的比较
标记
方法
检测限
金纳米粒子
比色法
1 × 10-8 mol/L
金芯片
表面等离子体共振
1 × 10-9 mol/L
金/聚苯胺纳米管
电化学阻抗谱
3 × 10-13 mol/L
量子点
阳极溶出伏安法
5 × 10-11 mol/L
ZnS and CdSe 量子点
荧光法
2 × 10-9 mol/L
NanoDLSay™
动态光散色法
3 × 10-14 mol/L
Ref: Gao D, Sheng Z, Han H. An ultrasensitive method for the detection of gene fragment from
transgenics using label-free gold nanoparticle probe and dynamic light scattering. Anal. Chim Acta
2011; 696:1-5.
NanoDLSay™：超高灵敏度
金纳米粒子与病毒
大小
100 nm
~300 nm
散射光强度比
1
~1000‡
数量比（摩尔）
99.9% (10 pM)
0.1% (10 fM)
纯散射光强度
1
1
强度-平均粒径
½ * 100 nm + ½ * 300 nm = 200 nm
‡:根据Mie散射理论计算
从上图可以看出， that with a trace amount of AuNP cluster formation due to
target analyte binding, the intensity-averaged particle size increases
substantially - The origin of high sensitivity of NanoDLSay™
NanoDLSay™优点
o 只需要微量样品 (1-5 µL)
o 几分钟就可以得到结果
o 单步检测程序
o 非常简单和容易操作
o 超高灵敏度
o 重复性好
o 检测成本非常低
Part II. NanoDLSay™ 用于蛋白研究
o 介绍
o 蛋白检测和浓度分析
o 蛋白间相互作用的动力学研究
o 无标记的复合蛋白检测和分析
o 无标记的低聚/高聚蛋白的检测和分析
介绍: 了解传统免疫分析方法的问题
在生物系统里，蛋白质不是单个存在的
蛋白单体
A
复合蛋白
antibody
聚合蛋白
B
X
传统免疫分析方法假设蛋白是单
独存在为前提的
传统的免疫分析方法无法检测
复合蛋白
NanoDLSay™: 可以检测以多种形式存在的蛋白
3
平均粒径大小 (nm)
独一无二的能力


2


1

 = 2D of analyte
0 min
孵育时间 (min)
30 min
动力学结合研究: 在检测过程
中监控粒子大小持续变化
检测目标分析物的粒径大小
检测目标蛋白是否是单体、
复合物还是多聚物
无标记检测：不需要对目标
蛋白进行标记
在真实的生物样品中检测复
合蛋白和聚合蛋白
1. 蛋白检测和浓度分析
剂量-反应曲线
Y
平均粒径大小 (nm)
Y
• 单一单克隆抗体探针法
Y
Y
Y
未知样品
标准曲线
目标蛋白浓度
Y
Y
• 双探针法或单一多克隆抗体探针法
（更高的灵敏度）
Y
o 标准曲线是用标准溶液建立的
o 相对定量可以通过直接比较平
均粒径大小来实现
2. 蛋白质相互作用的动力学研究
Alternative:
目标蛋白 A
平均粒径大小 (nm)
目标蛋白 B
步骤：
1、把目标蛋白A修饰在金纳米粒子上
2、把目标蛋白A修饰的金纳米粒子和
目标蛋白B混合
3、监测金纳米粒子的大小变化
4、蛋白结合亲和力可以用Langmuir吸
附模型估计
无结合蛋白
0
孵育时间 (min)
30
3. 无标记复合蛋白的检测和结合蛋白的分析
Step 2: 结合蛋白可以
平均粒径大小 (nm)
通过抗体来筛选
Step 1: 俘获
目标蛋白
结合蛋白
c
 ~ 2D
没有被结合的蛋白
孵育时间 (min)
• 步骤1. 检测目标蛋白是否以复合蛋白的形式存在
(金纳米粒子粒径的变化可以告诉人们目标蛋白究竟有多大)
• 步骤 2.通过抗体筛选来分析结合在目标蛋白上的蛋白
4. 无标记的低聚/多聚蛋白的检测和分析
蛋白单体
• Specific detection of target protein
oligomer/aggregates in real samples
Average particle size increase (nm)
• Protein oligomer/aggregates cause
AuNP probe cluster formation
低聚蛋白
多聚蛋白
 = 2D of analyte
0 min
Incubation time (min)
30 min
文献
蛋白-蛋白或其他生物分子间相互作用
Jans H, et al. Dynamic light scattering as a powerful tool for gold nanoparticle
bioconjugation and biomolecular binding study. Anal. Chem. 2009; 81: 9425-9432.
Austin L, et al. An immunoassay for monoclonal antibody isotyping and quality analysis
using gold nanoparticles and dynamic light scattering. American Biotechnology
Laboratory 2010; 28: 8, 10-12.
Sánchez-Pomales G, et al. A lectin-based gold nanoparticle assay for proving
glycosylation of glycoproteins. Biotechnology Bioengineering 2012, published online.
Wang, X.; Ramström, O.; Yan, M. Dynamic light scattering as an efficient tool to study
glyconanoparticle-lectin interactions. Analyst 2011, 136, 4174-4178.
无标记复合蛋白和结合物的检测和分析
Jaganathan S, et al. A functional nuclear epidermal growth factor receptor, Src and
Stat3 heteromeric complex in pancreatic cancer cells. PLoS One 2011, 6(5):e19605.
无标记低聚合/多聚合蛋白的检测
Bogdanovic J, et al. A label-free nanoparticle aggregation assay for protein
complex/aggregate detection and analysis. Anal. Biochem. 2010; 45:96-102.
Huo Q. Protein complexes/aggregates as potential cancer biomarkers revealed by a
nanoparticle aggregation assay. Colloids Surfaces B 2010; 78:259-265.
Part III. NanoDLSay™ 和其他分析技术的比较
o ELISA (酶联免疫吸附试验)
o 表面等离子共振
o 免疫共沉淀/免疫印迹
o SEC体积排阻色谱
o 超速离心分析 (AU)
o 使用金纳米粒子探针的比色法
1.
NanoDLSay™ VS ELISA
Sandwich ELISA
o 可能无法检测复合蛋白质
o 需2-3个小时取得成果
o 多个步骤 – 大量的劳动
o 比较大的样本量（10-100s 微升）
NanoDLSay™
o 可以检测以任何形式存在的目标蛋白
o 揭示更准确的生物信息
o 揭示蛋白质复合状态
o 在几分钟内获得结果
o 单步流程
o 低样本量（1-5 微升）
2. NanoDLSay™ VS 表面等离子共振 (SPR)
SPR
NanoDLSay™
o 无标记技术
o 无标记技术
o 光学基质：金纳米粒子
o 光学底物：黄金薄膜
o 读出：金纳米粒子大小的变化
o 读出：折射率变化
o 均相溶液测定
o 异构芯片检测
o 耗材成本低
o 耗材成本高
o 揭示的目标分析物的大小信息，区分蛋白
质复合物和低聚物/单体复合物
o 不能揭示目标分析物的大小信息，
不能判断一种蛋白质是单体的，复
杂的或低聚物
3. NanoDLSay™ VS 免疫共沉淀/免疫印迹
非特异性的相互作用
CO-IP法存在的问题：
o分离过程中导致显著的非特异性相互作用
o在离心过程中，粒子探针和蛋白质的浓度
被人为地增大，导致非特异性相互作用加大
NanoDLSay™不存在这个问题：
o金纳米粒子探针浓度相对较低，
减少非特异性相互作用
o无离心分离这个步骤
4. NanoDLSay™ vs SEC、AU
SEC 和 AU:
o仅适用于纯蛋白溶液研究
oSEC低估了复合蛋白或低聚/高聚蛋白的浓度
o（淋洗液稀释会破坏现有的复合物/低聚物）
oAU 高估了复合蛋白或低聚/高聚蛋白的浓度
o（离心人为地增加蛋白质复合物/低聚物 ）
NanoDLSay™:
o从真实的样品中检测复合蛋白、低聚/高聚蛋白
o快速检测复合蛋白、低聚/高聚蛋白
o不适合各种低聚物的绝对定量分析
5. NanoDLSay™ vs 比色法
Y
Y
Y
Y
颜色变化
Before assay
目标分析物结合金纳米粒子
Target analyte binding-induced
AuNP cluster formation causes
SPR band shift of AuNPs to
longer wavelength
- 颜色变化
比色法
吸光度 (A.U.)
o容易操作
o需要或者不需要仪器
After assay
o灵敏度低
o不能揭示分子大小信息
400
500
600
波长(nm)
700
800
o不适合有颜色的样品 (如：血液）
Product & Services
Part IV.
NDS1200: 一个新的动态光散色仪专门设计用于
NanoDLSay™
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
自动测量12个样品
自动动力学研究12个样本
检测速度快：10-20s每个样品
测量所需检测溶液40µL
成本低，一次性带盖玻璃试管被用作为样
品容器。
没有交叉污染样品
高通量分析能力：120 - 180样品/小时
硬件无需维护
仪器无需特殊的环境
非常容易使用的软件
Product & Services
NanoDLSay™ 软件: 一款用于方便、灵活和
高通量分析的软件
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NDS1200
用于进行NanoDLSay™的动态光散色仪
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oPatent application pending on NanoDLSay™ technology and NDS1200 system: PCT/US09/030087 and PCT/US11/21002
oNano Discovery Inc. has the exclusive license in the world to practice and commercialize NanoDLSay™ technology