Transcript cromatografía

CROMATOGRAFÍA
Fase estacionaria: sólido o líquido fijado a un sólido
Fase móvil: fluído (líquido o gas) que arrastra la muestra a través de la
fase estacionaria
Los distintos componentes de la mezcla interaccionan de
manera diferente con las dos fases estableciéndose un reparto
entre ambas
Se establece un equilibrio entre partículas adsorbidas y desorbidas
α=
coeficiente de reparto
[moléculas adsorbidas]
[mol. adsorbidas] + [mol. desorbidas]
FASE MÓVIL
FASE
ESTACIONARIA
Clasificaciones de cromatografía
1. Según como se encuentre la fase estacionaria
a. columna
b. batch
c. plana cromatografía en papel y en capa fina
2. Según el tipo de fase estacionaria y fase móvil
Fase estacionaria
Fase móvil
Sólida
Líquida o gaseosa
Líquido adsorbido
Líquida o gaseosa
3. Según el tipo de flujo empleado
a. Gravedad
b. Capilaridad (papel, capa fina)
c. Fluído a presión (HPLC)
HPLC (high performance liquid chromatography)
Se basa en los mismos principios que la cromatografía a baja presión
Tiene mejor resolución, tiempos menores, mejor reproducibilidad
El material empacado en las columnas está formado por pequeñas
partículas de tamaño muy uniforme y gran rigidez
Permite trabajar con flujos altos para lo que se requiere aplicar presión
Se requiere de columnas especiales construidas en acero inoxidable
o vidrio grueso
FPLC (fast protein liquid chromatography)
Es una variante del HPLC con columnas y
equipamiento especialmente diseñado para
separar o purificar proteínas
Las columnas de FPLC soportan menos
presión que las de HPLC
4. Según la finalidad del experimento
Separación y purificación
Separación, cuantificación y
caracterización
Preparativa
Analítica
4. Según la interacción entre la fase móvil y el soluto
a. Cromatografía de intercambio iónico
carga-carga
b. Cromatografía de interacción hidrofóbica
c. Cromatografía de afinidad
efecto hidrofóbico
variada pero específica
d. Cromatografía de afinidad por metales
inmovilizados (IMAC)
e. Cromatografía de fase normal y reversa
enlaces covalentes
dipolos
Cromatografía de intercambio iónico
La separación se basa en diferencias de carga a un pH dado
Las interacciones son electrostáticas
Dos tipos
Intercambio aniónico: matriz cargada
positivamente (DEAE, TEA, QAE)
Intercambio catiónico: matriz cargada
negativamente (carboximetilos,
sulfonatos, fosfatos)
Elución: puede llevarse a cabo mediante cambios de pH, fuerza iónica o
ambos
Condiciones iniciales
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Aplicación de la muestra
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Aumento en la concentración de sales
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Elución de la proteína de interés
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Cromatografía de afinidad
Se basa en una interacción biológica específica:
Enzima-sustrato
Anticuerpo-antígeno
Enzima-coenzima
Proteína-ligando específico
La elución se puede lograr agregando el ligando (el que está unido a la
columna) en solución o mediante cambios en el buffer que sean capaces
de debilitar la interacción
IMAC (immobilized metal affinity chromatography)
Se basa en la formación de enlaces de coordinación entre iones
metálicos inmovilizados y grupos básicos en proteínas (histidinas)
Principalmente a los iones divalentes de metales de transición
como Fe, Co, Ni, Cu y Zn
La elución se lleva a cabo adicionando quelantes más fuertes como el
imidazol a distintas concentraciones o cambios en el pH
Es muy utilizada para la purificación de proteínas recombinantes
Generalmente se adicionan 6 histidinas en el extremo Nt o en el Ct
Cola de (Histidina)6
Ni2+
Cromatografía de interacción hidrofóbica
El soporte está sustituído con cadenas alifáticas de 2 a 10 carbonos u otros
grupos hidrofóbicos
La interacción es de tipo hidrofóbica
La fase móvil debe tener una alta concentración de sales
((NH4)2SO3 2 – 4 M)
Salting out
Para la elución se disminuye la concentración de sales en la fase móvil
Cromatografía de fase reversa
Está muy relacionada con la cromatografía de interacción hidrofóbica
pero son diferentes
El soporte está sustituído por alifáticas pero más largas (8 -18 carbonos) y
la densidad de sustituyentes es mayor
La unión es más fuerte y por eso requiere mezclas con solventes no
polares para la elución
Desnaturaliza proteínas
Se utiliza en HPLC
Gel filtración (cromatografía de exclusión molecular)
No es una cromatografía
La separación se da por tamaño
El gel debe ser inerte, de tamaño de poro definido y sin carga
Múltiples aplicaciones:
Cambios de buffer
Separación de moléculas de bajo peso molecular de otras de mayor
tamaño
Determinación del peso molecular
Resultado final: cromatograma
y
y
Velución (mL)
Velución (mL)
y = unidades de absorbancia, unidades de fluorescencia relativa, intensidad
del pico (espectrometría de masa), entre otras
Concluyendo….
La pregunta más importante…
¿En qué son distintas las sustancias que deseo separar?