Transcript fase móvil - Degradome

CROMATOGRAFÍA
Mikhail Tswett, 1906
Separación de pigmentos vegetales usando una
columna de carbonato cálcico
CROMATOGRAFÍA
Separación de los componentes
de una mezcla (muestra),
disueltos en una fase móvil a
medida que se van desplazando
con diferente velocidad a través
de una fase estacionaria
TIPOS DE CROMATOGRAFÍAS
ESTADO FÍSICO DE LAS FASES:
Fase Móvil
- Gaseosa (Cromatografía de gases)
- Líquida (Cromatografía Líquida)
Fase Estacionaria
- Líquida (inmovilizada, soporte)
- Sólida
TIPOS DE CROMATOGRAFÍAS
CRITERIOS DE SEPARACIÓN:
1. REPARTO (F. estacionaria “líquida”)
Los componentes de la mezcla se reparten entre las fases móvil
y estacionaria en función de sus características. La composición
de la fase móvil es constante.
2. ADSORCIÓN (F. estacionaria sólida)
Los componentes de la mezcla quedan retenidos sobre la
superficie de la fase estacionaria y hay que cambiar la
composición de la fase móvil para eluirlos.
CROMATOGRAFÍA DE REPARTO
1.SOLUBILIDAD
Fase “Normal”: F. Estacionaria polar, F. Móvil apolar
Fase Reversa: F. Estacionaria apolar, F. Móvil polar
2. TAMAÑO (exclusión molecular)
Fases móvil y estacionaria líquidas idénticas
separadas por una especie de tamiz o malla
CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN
1. INTERCAMBIO IÓNICO
Fase estacionaria positiva: Intercambio aniónico
Fase estacionaria negativa: Intercambio catiónico
2. INTERACCIÓN HIDROFÓBICA
Fase estacionaria hidrofóbica
3. CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD BIOLÓGICA
Fase estacionaria con ligandos inmovilizados
4. ADSORCIÓN INESPECÍFICA
hidroxiapatita, colorantes inmovilizados
TIPOS DE CROMATOGRAFíA
Reparto
Interacción
Tipo de
interacción/reparto
Tipo de cromatografía
Solubilidad
•Fase Normal
•Fase Reversa
Tamaño
•Exclusión Molecular
Electrostática
•Intercambio aniónico
•Intercambio catiónico
Hidrofóbica
Afinidad biológica
•Ligandos inmovilizados
•Inmunoafinidad
Afinidad inespecífica
•Hidroxiapatita
•Colorantes
FORMATO
1. COLUMNA
2. “BATCH” o TANDAS
- Sistemas manuales
- Equipos automatizados
(HPLC)
3. SUPERFICIES PLANAS
- Papel
- Capa fina
(TLC, thin layer chromatography)
TERMINOLOGÍA
• FASE ESTACIONARIA: (matriz, soporte cromatográfico)
componente estático de la cromatografía
• FASE MÓVIL: (eluyente) solvente que arrastra a través de la
columna los componentes de la mezcla a analizar
• ELUCIÓN: paso de fase móvil a través de una columna hasta
lograr la salida de los solutos
• ELUIDO: fase móvil que se recoge a la salida de una columna
TERMINOLOGÍA
• CROMATOGRAMA: Perfil cromatográfico, Perfil de elución.
Representación gráfica de la cuantificación de solutos en el
eluído de una columna
• VOLUMEN DE ELUCIÓN: volumen de fase móvil que pasa a
través de la columna hasta que sale cada soluto
• VOLUMEN MUERTO: volumen de elución de una molécula que
viaja a través de la columna con la velocidad de la fase móvil,
que no experimenta ningún retraso. También se llama
VOLUMEN DE EXCLUSIÓN
CROMATOGRAFIA EN COLUMNA
Registrador
Solventes
Bomba(s)
Mezclador
COLUMNA
(fase móvil)
Detector
(UV)
Inyector
Colector de
fracciones
HPLC:
High Performance Liquid Chromatography
Waters, Millipore
Perceptive BioSystems, BioCAD
SEPARACIÓN DE AMINOÁCIDOS
MEDIANTE HPLC
CROMATOGRAFIA EN COLUMNA
(manual)
SEPARACIÓN DE COMPONENTES CELULARES
POR ULTRACENTRIFUGACIÓN
ELIMINACIÓN DE MOLÉCULAS PEQUEÑAS
MEDIANTE DIÁLISIS
CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR
CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR
Volumen de líquido
Volumen de líquido
en las partículas
(Vi)
Volumen ocupado
por la matriz
(Vg)
VT = Vo+ Vi + Vg
Volumen total
de líquido (Vt)
2.0
Absorbancia (280 nm)
(Vo)
en los intersticios
0.0
20
40
60
80 100 120
Volumen de elución (ml)
Flujo isocrático, condiciones nativas o desnaturalizantes
CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR
Nombre comercial
Tipo de matriz
Rango tamaño
Sephadex G-50
Sephadex G-100
Sephacryl S-200 HR
dextran
dextran
dextran
1500 - 30000
4000 - 150000
5000 - 250000
Ultrogel AcA 54
Ultrogel AcA 44
Ultrogel AcA 34
polyacrylamide/agarose 6000 - 70000
polyacrylamide/agarose 12000 - 130000
polyacrylamide/agarose 20000 - 400000
Bio-Gel P-60
Bio Gel P-150
Bio-Gel P-300
polyacrylamide
polyacrylamide
polyacrylamide
3000 - 60000
15000 - 150000
60000 - 400000
CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR:
Estimación de masas moleculares
Marcadores de masa molecular
2.0
67 kD
A280 nm
2.0
0.0
14 kD
43 kD
20
40
60
80
100
120
100
120
Proteína problema
20
40
60
80
Volumen de elución (ml)
Volumen de elución (ml)
A280 nm
0.0
Recta de calibrado
25 kD
Log Mr
CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR
VENTAJAS:
• Flexibilidad en cuanto a solvente
• Condiciones poco agresivas
• Proporciona información estructural
INCONVENIENTES:
• Poco resolutiva, debido a difusión
• La muestra se diluye
• Es necesario aplicar volúmenes muy pequeños
Etapas finales de protocolos de purificación
CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN MOLECULAR:
Columnas de “desalado”
2.0
0.3 kD
120 kD
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.
1.2
Volumen de elución (ml)
• Cambio de solvente
• Purificación de fragmentos de DNA marcados
(fragmento 200 pb: 120 kD; nucleótidos libres: aprox. 0.3 kD
INTERCAMBIO IÓNICO
INTERCAMBIADORES IÓNICOS
FASE ESTACIONARIA: SOPORTE – GRUPO CARGADO
SOPORTES:
• RESINAS SINTÉTICAS. (P.ej. Poliestireno)
- Densidad muy alta de grupos
intercambiadores
- Muy hidrofóbicas: desnaturalización
de biomoléculas
- Eliminación de impurezas iónicas de
solventes químicos y de tampones
Purificación de agua
•POLÍMEROS NATURALES. Celulosa, agarosa
INTERCAMBIADORES IÓNICOS
INTERCAMBIADORES IÓNICOS
Intercambiador
Tipo
Fuerte
Grupo cargado
+
Abreviatura
CH2CH3
-CH2CH2-N-CH2CH(OH)CH3
QAE
CH2CH3
Dietil-2-hidroxipropilamino etilo
De aniones
Débil
+
CH2CH3
DEAE
-CH2CH2-N-H
CH2CH3
Dietilamino etilo
Fuerte
De cationes
Débil
-
-CH2CH2-CH2-SO3
Sulfo propilo
-
-CH2-COO3
Carboxi metilo
SP
CM
INTERCAMBIADORES IÓNICOS
+
aniónico
débil
(DEAE)
carga
aniónico
fuerte
(QAE)
pH
-
catiónico
fuerte
(SP)
catiónico
débil
(CM)
INTERCAMBIO IÓNICO
Matriz(-). Ión(+) + Soluto(+)
K=
Matriz(-) . Soluto(+) + Ión(+)
[Matriz(-) . Soluto(+)] [Ión(+)]
[Matriz(-) . Ión(+)] [Soluto(+)]
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO
1. Equilibrado. Ajuste a
condiciones iniciales
2. Adsorción. Baja fuerza iónica.
Intercambio aniónico, pH >pI
Intercambio catiónico, pH < pI
+
pH
3. Lavado. Condiciones iguales a
la adsorción.
4. Elución. Modificación de la
fase móvil: aumento de fuerza
iónica
pI
-
INTERCAMBIO IÓNICO
GRADIENTE DISCONTINUO
0.5
Absorbancia (280 nm)
2.0
[NaCl]
(M)
----
0.0
0.0
20
40
60
Número de fracción
80
100
120
INTERCAMBIO IÓNICO
GRADIENTE LINEAL
0.5
Absorbancia (280 nm)
2.0
[NaCl]
(M)
----
0.0
0.0
20
40
60
Número de fracción
80
100
120
CROMATOGRAFÍA DE INTERACCIÓN HIDROFÓBICA
1.0
Absorbancia (280 nm)
2.0
[Sal]
(M)
- - --
0.0
0.0
Fenil-sefarosa
Octil-sefarosa
20
40
60
80
Número de fracción
100
120
CROMATOGRAFÍA DE INTERACCIÓN HIDROFÓBICA
Capacidad de facilitar interacciones hidrofóbicas
(PO4)3- > (SO4)2- > Acetato > Cl- > Br- > SCN-
(NH4)+ > K+ > Na+ > Mg2+ > Ca2+
FORMATO
1. COLUMNA
2. “BATCH” o TANDAS
- Sistemas manuales
- Equipos automatizados
(HPLC)
3. SUPERFICIES PLANAS
- Papel
- Capa fina
(TLC, thin layer chromatography)
CROMATOGRAFÍA SOBRE SUPERFICIES PLANAS
- Papel
- Capa fina
(TLC, thin layer chromatography)
CROMATOGRAFÍA EN PAPEL
- Fase estacionaria: H2O retenida entre las fibras
de celulosa del papel
- Fase móvil: Solvente orgánico (mezcla)
Cromatografía de reparto, fase normal
CROMATOGRAFÍA EN PAPEL
•
Aplicación de la muestra:
•
Desarrollo de la cromatografía:
volumen mínimo
Extremo sumergido
en la fase móvil, sin tocar el punto de aplicación de la muestra.
Recipiente cerrado herméticamente. Ascendente/descendente
•
Detección de las sustancias separadas:
– Directa (sustancias coloreadas o fluorescentes)
– Tinción
– Autorradiografía (compuestos radiactivos)
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA
•
Optimización de cromatografía en papel
•
Fase estacionaria:
fina capa (0.15-0.5 mm) de sólido
pulverizado sobre una superficie de vidrio, plástico o cristal.
•
Celulosa, poliamida, alúmina, sílica-gel
VENTAJAS DE LA TLC
Característica
Fase estacionaria
finamente dividida
Ausencia de
estructura fibrosa
Efecto
Ventaja
Elevada acción capilar
Rapidez de desarrollo
Elevada superficie de
contacto f. móvil f.
estacionaria
Reducida dispersión de los
solutos durante aplicación y
desarrollo
Válida cualquier fase
estacionaria que pueda ser
pulverizada
Eficiencia
cromatográfica
Sensibilidad
Versatilidad
MÉTODOS DE TINCIÓN EN TLC
Método
Inespecífico
Específico
Aplicación
Color
Vapores de Iodo
C. orgánicos
Pardo-amarillento
H2SO4 + calor
C. orgánicos
Negro (carbonización)
2,4dinitrofenilhidracina
C. carbonílicos
Naranja
AgNO3/OH-
C. carbonílicos
Marrón
Ácido iodoplatínico
Bases
Púrpura-negro
Verde de
bromocresol
Ácidos
Verde-amarillento
Ninhidrina
Aminas 1rias
(aminoácidos)
Azul-violáceo
Rodamina 6G
Lípidos
fluorescencia
FACTOR DE RETARDO (Rf)
Frente del
solvente
soluto
Distancia migrada por el soluto
Rf =
origen
Distancia migrada por el frente
TLC BIDIMENSIONAL
1ª dimensión
2ª dimensión
punto de
aplicación
CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
+ glucose
CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
1. Equilibrado. Ajuste a condiciones
2.0
2. Adsorción. Alta fuerza iónica.
3. Lavado. Condiciones iguales a la
adsorción.
4. Elución.
• Competición con ligando libre
Absorbancia (280 nm)
iniciales.
Adición de
ligando libre
• Desnaturalización (pH,
temperatura, agentes caotrópicos)
0.0
20
40
60
80
Número de fracción
100
LIGANDOS PARA CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
Ligando
2’,5’-ADP
Aplicación
Deshidrogenasas dependientes de NADP+
5’-AMP
Arginina
Benzamidina
Calmodulina
Deshidrogenasas dependientes de NAD+
Serín-proteasas
Serín-proteasas
Quinasa, proteínas dependientes de calmodulina
Concanavalina A (ConA)
ADN
Gelatina
Heparina
Glicoproteínas, polisacáridos
ADN y ARN polimerasas
Fibronectina
Factores de coagulación, lipoproteínas, enzimas
específicas de ADN y ARN
Lectinas
Lisina
Proteína A
Proteína G
Poli-(U), Poli-(T)
Poli-(A)
Glicoproteínas, polisacáridos
Plasminógeno, ARNr
Anticuerpos (IgG)
Anticuerpos (IgG)
Poli-(A), ARNm
Poli-(U)
CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD:
PREPARACIÓN DE LA FASE ESTACIONARIA
1. Activación del soporte
2. Anclaje covalente del ligando
3. Bloqueo de grupos reactivos remanentes
+ CNBr
OH
=
O
+ NH2-ligando
C=N
O
agarosa
OH
agarosa
agarosa
NH
O-C-NH-ligando
OH
PROTEÍNAS DE FUSIÓN RECOMBINANTES
CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
INMUNOPRECIPITACIÓN
INMUNOPRECIPITACIÓN