Transcript File - AnalizameSTA

 Inventada
Mikhail Tswett (1900) para
separar distintos pigmentos de la clorofila
pasándola por una columna de carbonato de
calcio.
Es la separación
de dos o más
compuestos
químicos en un
medio
Fase Móvil: Gas ó Líquido
Fase Estacionaria: Inmiscible; es
sólido o líquido fijado en un sólido.
La movilidad de los componentes de
la mezcla a separar depende de la
afinidad química o propiedades / FE
& FM
Si 1 Componente tiene propiedades
químicas
=
FM,
tendrá
gran
movilidad, es decir, el efecto de
retención que provocaría la fase
estacionaria sería nulo.
El Desplazamiento diferencial de los
solutos (Fenómeno de adsorción) al
ser arrastrados por una FM sobre una
FE, nos permite identificar cuantos
componentes tiene una mezcla.
 Cromatografía
plana.
FE=Placa plana o papel
 Cromatografía
en papel
 Cromatografía en capa fina
 Cromatografía
en columna.
FE=Columna
 Según el fluido empleado:
 Cromatografía





de Líquidos
Cromatografía de Líquida de Intercambio Iónico
Cromatografía de Líquida de alta eficiencia
Cromatografía de Líquida de Exclusión
Cromatografía de Líquida de Adsorción
Cromatografía de Líquida en fase Inversa y Normal
 Cromatografía
de Gases
 Cromatografía de líquidos súper críticos
FE= papel de celulosa.
FM= disolvente y la mezcla de
varios líquidos que contiene
agua.
Se aplica la muestra sobre el papel
Introducción del papel en la cubeta que
contiene el disolvente.
Éste atraviesa el papel por capilaridad
arrastrando los componentes de la
mezcla.
Separación en función de la afinidad por las dos
fases, las más solubles en agua se quedarán cerca
del punto donde se aplicó la muestra, y las menos
solubles en agua y más solubles en el disolvente
llegarán más lejos.
Las sustancias separadas se identifican mediante
diversos procedimientos físicos o químicos.
• Con la ayuda de un
capilar de vidrio,
una pequeña
cantidad de
muestra se
deposita sobre el
adsorbente, muy
cerca del extremo
inferior de la
placa.
1
2
• Una vez depositada
la
muestra,
se
introduce la placa
en una cubeta de
cromatografía, que
contiene
en
el
interior
el
disolvente con el
que
va
a
desarrollarse
el
cromatograma.
• Transcurridos
unos
minutos, cuando el
frente del disolvente
se encuentra próximo
al extremo de la
placa, se saca ésta de
la cubeta, se deja
secar. Los diversos
compuestos
se
localizan
directamente si son
coloreados, o con la
ayuda
de
un
indicador
o
luz
ultravioleta, si son
incoloros
3
Los compuestos que avanzan a lo largo
de la placa se ven atraídos por fuerzas
sobre la superficie del adsorbente,
interaccionando el disolvente con
ambos.
Esta interacción competitiva establece
las velocidades relativas con que
ascienden por la capa de adsorbente,
el frente de disolvente y un
determinado
compuesto.
Cuanto
mayor es la polaridad de los
compuestos, más intensamente se ven
 Eluyentes
mas
comúnes:













éter de petróleo
Tolueno
dietil-éter, t-butil-éter
Diclorometano
acetato de etilo
n-pentano, n-hexano
Ciclohexano
tetracloruro de carbono
éter dietílico
Cloroformo
Acetona
Iso-propanol
Etanol
 Adsorbentes
más
comunes:




Silica gel (se utiliza en
el 80% de las
separaciones)
b) Óxido de Aluminio ó
Alúmina (ácida, neutra
ó básica)
c) Celulosa (Nativa o
micro-cristalina)
d) Poliamidas
Limpieza de
las Placas
Temperatura
Pureza de los
disolventes
 La
separación por cromatografía de intercambio
iónico depende de la adsorción reversible de una
molécula de soluto cargada a un grupo de
intercambiadores iónicos inmovilizados de carga
opuesta.
FE = resina de intercambio iónico que contiene grupos
cargados.
FM = generalmente una solución amortiguadora de pH
Equilibrio de la
matriz
Adsorción de la
muestra
Comienzo de la
remoción
Fin de la remoción
Regeneración de la
matriz
• pH, fuerza iónica
 Fuertes:
permanecen ionizadas en todo el rango
útil de pH.
 Débiles: disminuyen su ionización en función del
pH.
-Gran sensibilidad
-Determinaciones cuantitativas exactas
-Determinación de compuestos no volátiles
(alto Peso Molecular, iones metálicos) o
termolábiles.
-El sistema HPLC requiere una mezcladora
de solventes, un inyector, y una bomba que
inyecte el líquido a la columna.
- La fase móvil fluye a través de la columna
estrechamente empaquetada.
-Presiones de hasta 1500 – 2000 PSI.
-Tiempo de análisis reducido.
-Los eluidos se identifican al abandonar la
columna por métodos:
UV Índice de Refracción Fluoresencia
Resolución
Elevada
Pequeña
capacidad
Velocidad
Sensibilidad
elevada
Limita
purificaciones a
gran escala
Pureza de materias primas
 Industria farmacéutica
 Productos de degradación
 Metabolitos en medicamentos en muestras biológicas
 Análisis toxicológicos
 Análisis de muestras medioambientales

-Fase Estacionaria:
El material que llena la columna (gel
o resina) está formado por partículas
con poros de un cierto intervalo de
tamaños.
-Las moléculas mayores que los poros no
pueden entrar en ellos, por lo que "pasan
de largo" y avanzan por la columna
(eluyen) con mayor rapidez que las de
tamaño menor, que pueden entrar en los
poros y así realizan un recorrido mayor,
progresando más lentamente a lo largo de
la columna.
 DETERMINACIÓN
 DETERMINACIÓN
DE MASAS MOLECULARES
DE ESTRUCTURA 3ª Y 4ª DE
PROTEÍNAS PURIFICADAS
 Las





moléculas se fijan sobre sustancias insolubles:
Alúmina (Al2O3)
Carbón activado
Tierra de Diatomeas (Kieselguhr)
Sacarosa pulverizada
Gel de sílice
 Asociaciones
de Van der Waals
 Enlaces
O
H
 Eluyente:
Hexano
 Separa
substancias No Polares
 Columna
polar – Disolvente no polar
Fase
inversa (FI)
– Fase móvil polar/ Fase estacionaria no polar
Fase
normal (FN)
– Fase móvil no polar/ Fase estacionaria polar
 Es
la más utilizada actualmente.
 La separación se basa en interacciones hidrofóbicas
entre grupos hidrocarburo de la fase estacionaria y
del analito.
 Componentes más polares eluyen primero.
 La retención aumenta cuando aumenta la
hidrofobicidad del analito.

Sílica con hidrocarburos saturados,
insaturados o aromáticos de
diferentes tipos.
Más empleados:
•octadecil (C18)
•octil (C8).
Cuanto mayor es el #C, mayor es la
eficacia.
 Agua





o solución buffer con:
Metanol
Acetonitrilo
Tetrahidofurano
Acetato de etilo
Acetona
Cuanto menos polar es el disolvente, más fuerza eluyente tiene
 Elimina
las colas de los picos.
 Menos sensible a impurezas en el eluyente.
 Se ha adaptado uso de columnas.
 HPLC: alta presión para mejorar la resolución y
reducir los tiempos de separación.

Separación compuestos






Farmacéuticos
Bioquímicos
Forenses
Clínicos
Industriales
Purificacion de biomoleculas
proteínas y péptidos.
 oligonucleótidos

Desalado
 Analisis cuantitativo

 Primera
descrita, menos utilizada
 Basada en interacción de los analitos con grupos
funcionales polares de la superficie de la fase
estacionarial originada por fuerzas eléctricas entre
dipolos permanentes o inducidos.
 El componente menos polar se eluye primero,
debido a que es el más soluble en la fase móvil
Un aumento de la polaridad de la fase
móvil, hace disminuir el tiempo de
elución.
Fase móvil
apolar
Sílica con grupo:
 grupo ciano
 diol
 amino
 dietilamino
Solventes muy apolares:
• hexano
• heptano
mezclados con solventes
más polares:
• isopropanol
• cloroformo
• etilacetato
La fuerza de elución de la fase
móvil de modifica con n-hexano.
 Herramienta
de separación muy potente debido a la
amplia gama de eluyentes disponibles que se pueden
utilizar para ajustar con precisión la selectividad de
una separación.
 Se ha dejado de utilizar debido a su complejidad.




Período de equilibrado prolongado
Problemas de reproducibilidad
Sensibilidad de la técnica a presencia de pequeñas
concentraciones de contaminantes polares en la fase
móvil.
Si esto se controla, se obtiene cromatogramas
mejores a los de fase reversa debido a la baja
viscosidad de los eluyentes que se utilizan
habitualmente.
 Separación

de:
PAHs (Hidrocarbonos Policíclicos Aromáticos).
Analizar trazas de sustancias potencialmente
cancerígenas y mutagénicas en aire, agua y
 Lípidos
efluyentes.



Alcanos
Esteroides
Azúcares
 Es
la técnica para la separación de
compuestos orgánicos e inorgánicos
térmicamente estables y volátiles
 Se produce como consecuencia de la
interacción de los componentes de una
mezcla vapor en una fase móvil gaseosa
inerte, con una fase estacionaria
(sólido/líquido) de alto punto de ebullición
sobre un sólido inerte
Gas portador: Medio de transporte de los componentes de la
mezcla a través del sistema cromatográfico.
Debe ser inerte: Ar, He, N2

 Columnas
Capilares:
Sílice fundida.
Diámetros interiores: 200-250 mm.
Longitud < 20 m.
Micro-empacadas
Tubulares abiertas
Empaquetadas
Tubo de acero inoxidable, niquel
o vidrio.
Diámetros interiores 1,6 -9 mm.
Longitud > 3 m.
Se rellenan de un material adsorbente
adecuado.
A MENOR DIÁMETRO, MAYOR EFICIENCIA Y RESOLUCIÓN
EL INCREMENTO DE LA LONGITUD DE LA COLUMNA INCREMENTA EL
NÚMERO DE PLATOS TEÓRICOS, Y ASÍ LA RESOLUCIÓN
Fases estacionarias
Separaciones por punto de ebullición de compuestos en
un intervalo amplio de pesos moleculares:
Escualano
Polidimetilsiloxano
Para hidrocarburos insaturados y otros compuestos
polidifenildimetilsiloxano
policarboranometilcianoetilsilicón
Para compuestos nitrogenados
poliamida
policianoetilmetilsilicon
Para alcoholes, ésteres, cetonas y acetatos
polietilenglicol
pentaeritritol tetracianoetilado
Conductividad
térmica
Espectroscopía de
masas
Detector de captura
de electrones (ECD)
Cromatografía líquidos supercríticos
La Tc de una sust. es la
temp. por encima de la
cual no puede existir en
fase
liquida
independientemente de la
presión.
La Pc es presión de vapor de
una sust. a su Tc.
Una sustancia a T y P por
encima de su Tc y Pc
(punto critico) =
FLUIDOS SUPERCRITICOS
Es una modalidad híbrida entre cromatografía de
gases y de líquidos que combina mejores
características de cada una de ellas y permite la
separación y determinación de compuestos que no
son manipulados esas cromatografías.
Compuestos no volátiles o
térmicamente lábiles
para los que la
cromatografía de gases es
inaplicable.
Compuestos con grupos
funcionales no detectables
por
técnicas
espectroscópicas
o
electroquímicas
empleadas
en
cromatografía de líquidos.
Equipo instrumental de cromatografía de fluidos
supercríticos.
Parecido al de HPLC con los mismos límtes de temperatura y presión
•Horno: mantener la columna termostatizada y controlar la
temperatura de la fase móvil.
• Restrictor (contrapresión): mantener la presión en la
columna y convertir el eluyente, de fluido supercrítico en un
gas, y arrastrarlo al detector.
Un restrictor para columna tubular abierta de 50 -100 μm
consiste en un capilar de 2 -10 cm. De longitud y 5 - 10 μm de
diámetro el cual esta directamente unido al extremo final
de la columna
•Microprocesadores:
instrumentales.
permiten
control
de
variables
•Detectores :ionización de llama  respuesta universal a
compuestos orgánicos, de elevada sensibilidad .
Los espectrómetros de masas se pueden adaptar como
detectores mas fácilmente para SFC que para HPLC.
Fase móvil
Columnas
abiertas:
similares a las columnas
de sílice fundida con
recubrimientos internos de
varios tipos de siloxanos
enlazados y de enlaces
cruzados.
Columnas rellenas.
CO2
Disolvente excelente
para
moléculas
orgánicas no polares.
Tc = 31º ; Pc =72.9
atm.
Lo cual permite jugar
con una banda amplia
de temperaturas y
presiones.
Separación de:
* Fármacos
* Alimentos
* Pesticidas
* Herbicidas
* Tensoactivos
* Polimeros
* Explosivos
* Propelentes