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CROMATOGRAFÍA
 La cromatografía es un método muy utilizado en
todas las ramas de la ciencia y que permite la
separación, identificación y determinación de los
componentes químicos en mezclas complejas.
 Ningún otro método de separación es tan potente y
de aplicación tan general como la cromatografía.
HPLC
 Usa una variedad de interacciones químicas entre el
analito y la columna cromatográfica.
 El analito se pasa a través de una columna de la fase
estacionaria bombeando la fase móvil liquida con alta
presión (entre 1500 a 2200 psi).
 El tamaño de partícula es entre 3 y 10 micras
 La muestra se introduce en pequeños volúmenes a la
corriente de la fase móvil y allí se retarda por medio de
interacciones químicas con la fase estacionaria mientras
atraviesa la columna.
HPLC
Tiempo de
Retención
Retardo
 Único para cada analito.
 Depende: (naturaleza)
Analito
Fase
estacionaria
Composición de
fase móvil
Fase Móvil
Agua
purificada
Líquidos Orgánicos:
•Metanol
•Acetonitrilo
Sales y buffers:
•Contribuyen a la separación
de componentes
Gradiente de elución
Variación de la composición de la fase móvil, para adaptarse a los diferentes analitos
Separa la matriz del analito en función de la afinidad del analito por la composición
de la fase móvil.
Cada analito tiene un gradiente de elución óptimo para obtener la máxima separación
de picos en el detector.
La información obtenida se analiza mediante una computadora acoplada al
equipo; permitiendo:
 Estandarizar la cromatografía
 Identificar la naturaleza los picos eluídos
 Cuantificar su contenido.
Los picos se relacionan según su "tiempo de retención" con estándares, que
permiten identificar los compuestos presentes en la mezcla. La cantidad
relativa de cada uno de ellos se determina calculando el área la curva del
pico correspondiente.
Tipos de HPLC
 FASE NORMAL
 FASE REVERSA
 EXCLUSIÓN POR TAMAÑO
 INTERCAMBIO IÓNICO
FASE NORMAL Y FASE REVERSA
Cromatografía reparto
Cromatografía líquidolíquido
Fase estacionaria líquida se
retiene sobre la superficie
por adsorción.
Cromatografía de fase unida
químicamente
Fase estacionaria líquida
unida químicamente a la
superficie.
FASE NORMAL (adsorción)
 Separa compuestos en base a su “Polaridad”
 Utiliza:
Fase Estacionaria
Polar
Fase Móvil
No Polar
 Compuesto a separar debe ser muy polar
Fundamento
 El analito polar es retenido por la fase estacionaria polar. La adsorción
aumenta con la polaridad del analito y la interacción entre analito y
fase estacionaria. Esto incrementa el tiempo de retención.
 El uso de disolventes polares en la fase móvil disminuye el tiempo de
retención, mientras que disolventes hidrófobos aumentan el tiempo de
retención.
 Muchas fases estacionarias son porosas para
proporcionar una mayor superficie.
Poros Pequeños
Poros Grandes
Mayor superficie
Mejor cinética para compuestos
de tamaño más grande
Una proteína que sea ligeramente más pequeña que el tamaño de los poros
puede entrar, pero difícilmente saldrá con facilidad.
Fase Estacionaria
 Sílice
Hidrofílicas y porosas
 Alúmina
Fase Estacionaria
 Sílice:
 Es el más utilizado debido a que
retiene a los solutos por
adsorción.
 Muy estable, lo que permite gran
variedad de disolventes.
 Capacidad para catalizar la
degradación de las moléculas del
soluto.
 Alúmina:
 Empleada como intercambiador
catiónico.
 Su neutralización y acidificación
hace posible su empleo como
intercambiador aniónico.
 Carácter anfotérico permite la
determinación de solutos de
carácter ácido y básico.
 Deben evitarse los pH extremos,
que pueden llevar a la disolución
de la fase estacionaria.



Separación
de
sustancias
orgánicas no saturadas
Anillos bencénicos
Isómeros de anillos aromáticos
condensados
Disolventes
 Elevada polaridad:
o Agua
o Trietilenglicol
Fase Móvil
 Se
emplean solventes no polares, ya que puede existir
desactivación de la columna de sílice o alúmina por adsorción de
agua.
 El agua es responsable de los mecanismos mixtos de retención y
produce cambios profundos en la retención y selectividad.






Hexano
Isopropilenglicol
Tolueno
Diclorometano
Éter
Acetato de Etilo
FASE NORMAL
Ventajas


Separación de solutos de
polaridad mediana a alta
Separación de isómeros
posicionales con
sustituyentes polares
Desventajas
o Falta de reproductibilidad de
los tiempos de retención puesto
que los disolventes próticos
cambian el estado de
hidratación de la sílice o
alúmina de la cromatografía.
FASE REVERSA
FASE REVERSA
Características
 Los
componentes más polares
eluyen primero.
 Si aumenta la polaridad de la fase
móvil aumenta
elución.
el
tiempo
de
 Los rellenos de fase unida química
son de fase reversa cuando el
recubrimiento enlazado es no
polar.
Polaridad del soluto:
A>B>C
FASE REVERSA
Características
 Grupos R del siloxano es C8
(n-octilo) o una cadena de
C18 (n-octadecilo).
 Las cadenas se alinean en la
superficie
estructura
semejante a brocha o cepillo.
FASE REVERSA
Características
 Cadenas más largas originan rellenos
con mayor retención.
 Una mayor longitud de cadena permite
una mayor cantidad de muestra.
 pH no mayor de 7.5  hidrólisis de
siloxano.
FASE REVERSA
EXCLUSIÓN POR TAMAÑO
Cromatografía
por exclusión
de tamaño
Cromatografía
de
penetración
sobre geles
Cromatografía
de filtración
sobre geles
 Se pueden usar analitos de alto peso molecular.
 No implica interacción física o química entre los analitos y la fase
estacionaria.
 A diferencia de otros tipos, hay un límite superior para el tiempo
de retención, ya que ningún analito es retenido más tiempo que
aquel para el cual la penetración en la fase estacionaria es total.
 Las moléculas son atrapadas eficazmente en los poros y
eliminadas del flujo de la fase móvil.
EXCLUSIÓN POR TAMAÑO
Las moléculas que tienen diámetros que son
significativamente menores de poro del
relleno pueden penetrar a través del
laberinto de poros y así resultan atrapadas
durante más tiempo, éstas son las últimas
en eluir.
Las moléculas que son más grandes que el
tamaño medio de poros del relleno son
excluidas y de esta forma, esencialmente no
se retienen y, por tanto, son las primeras
que eluyen.
EXCLUSIÓN POR TAMAÑO
Diámetro entre
5-10 μm
Contienen una red de poros uniforme en
los que pueden difundir las moléculas del
soluto y del disolvente
Polímeros
Rellenos de
columna
Sílice
EXCLUSIÓN POR TAMAÑO
 SÍLICE
 Ventajas:
 Gran rigidez, lo que facilita el relleno y permite el empleo de






presiones más elevadas.
Mayor estabilidad, lo que permite gran variedad de disolventes
incluyendo el agua.
Una equilibración más rápida al cambiar el disolvente.
Buena estabilidad a elevadas temperaturas.
Desventajas:
Tendencia a retener solutos por adsorción.
Capacidad para catalizar la degradación de las moléculas del
soluto.
EXCLUSIÓN POR TAMAÑO
 Los rellenos poliméricos se han comercializado con
distintos tamaños de poro:
EXCLUSIÓN POR TAMAÑO
 El volumen total de una columna rellena con gel de
sílice o con un polímero poroso viene dado por:
 Vg : volumen ocupado por la matriz sólida del gel.
 Vi : volumen del disolvente retenido en sus poros.
 Vo : volumen libre exterior a las partículas de gel, volumen teórico del
disolvente que es necesario para transportar a través de la columna a
los componentes que son demasiado grandes para entrar en los poros
de gel.
EXCLUSIÓN POR TAMAÑO
 Las moléculas de tamaño intermedio pueden transferirse a
una fracción k del disolvente que ocupa los poros, el
volumen de elución para esas moléculas retenidas es:
Ve = V0 + KVi
Por lo tanto esta ecuación aplica a todos los solutos
que pasan por la columna pero el valor de K difiere:
Grandes, no pasan por los poros, K= 0
Los que pasan por los poros, K= 1
EXCLUSIÓN POR TAMAÑO
VR= Volumen de retención=
tiempo de retención* caudal
volumétrico.
Límite de exclusión: Peso
molecular por encima del
cual no existe retención.
Límite de penetración: Peso
molecular por debajo del
cual las moléculas de soluto
penetran completamente por
los poros .
EXCLUSIÓN POR TAMAÑO
Filtración sobre gel
Utiliza disolventes
acuosos y rellenos
hidrofílicos
Penetrabilidad
sobre gel
Utiliza disolventes
orgánicos no
polares y rellenos
hidrofóbicos
Exclusión por
tamaño
APLICACIÓN DE LA CROMATOGRAFÍA
EXCLUSIÓN POR TAMAÑO
 Determinación de glucosa (G), fructosa (F) y
sacarosa (S) en zumos enlatados.
APLICACIÓN DE LA
CROMATOGRAFÍAEXCLUSIÓN POR TAMAÑO
•Separación de ácidos grasos
Columna de poliestireno, con un límite de tamaño de 1x10³. Fase
móvil: tetrahidrofurano. Detector: índice de refracción.
Otras aplicaciones…
 Separación de moléculas de alto
peso molecular, de bajo peso
molecular y de sales.
 Determinación rápida de pesos
moleculares.
 Distribución de pesos moleculares
en grandes polímeros o productos
naturales.
Ventajas y desventajas de la exclusión por
tamaño:
Ventajas
• Tiempos de separación cortos y
bien definidos.
• Bandas estrechas que conducen a
una buena sensibilidad.
• No hay pérdida de muestra porque
no hay interacción con la fase
estacionaria.
Desventajas
• Número limitado de bandas en el
cromatograma (escala de tiempo es
corta).
• No es aplicable a muestras de
componentes de tamaño
semejante, como mezclas de
isómeros.
CROMATOGRAFÍA IÓNICA
Se refiere a los métodos para separar y determinar iones
en columnas con relativamente baja capacidad de
intercambio iónico.
Empezó a desarrollarse cuando se demostró que se
podían separar fácilmente mezclas de cationes o aniones
mediante las columnas de HPLC rellenas con resinas de
intercambio catiónico o aniónico.
*Equilibrios de intercambio iónico
 Se basan en los equilibrios de intercambio entre los
iones de una disolución y los iones del mismo signo
que están en la superficie de un sólido de elevada
masa molecular y esencialmente insoluble.
 Los sitios activos más comunes en las resinas de
intercambio catiónico son los grupos de ácido
sulfónico –SO3H+, un ácido fuerte, y los grupos de
ácido carboxílico –COO-H+, un ácido débil.
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO POR
CATIONES
 Cuando un intercambiador iónico de ácido sulfónico
se pone en contacto con un solvente acuoso que
contiene un catión Mx+ , se establece un equilibrio de
intercambio que puede expresarse mediante:
 xRSO3-H+ + Mx+
(RSO3-)x Mx+ + xH+
CROMATOGRAFíA DE INTERCAMBIO Iónico
POR CATIONES
 xRSO3-H+
+ B+
(RSO3-)x B+ + H+
La elución con una solución diluída de ácido
clorhídrico desplaza el equilibrio hacia la izquierda,
lo que ocasiona que parte de los iones B + se
transfieran a la fase móvil. Estos iones descienden luego
por la columna en una serie de transferencias entre las
fases estacionaria y móvil.
Rellenos de intercambio iónico
 Se emplean pequeñas partículas
esféricas porosas que se forman en
la co-polimerización del estireno y
del divinilbenceno emulsionados y
para activar el polímero frente a
los iones, se le unen grupos
funcionales ácidos.
 Otro tipo de relleno se prepara
recubriendo
micro
partículas
porosas de sílice, tal como las que
se utilizan en la cromatografía de
adsorción, con una delgada
película del intercambiador.
 Fase móvil:
solubiliza a la muestra, conduce a
tiempos de retención razonables e interactúa con los
solutos de tal forma que favorece la selectividad.
 En cromatografía iónica las fases móviles suelen
contener disolventes orgánicos miscibles con el agua
y es a menudo contienen especies iónicas para
formar un tampón.
 Los iones de la fase móvil compiten con los iones del
analito por los puntos activos del relleno del
intercambiador iónico.
Cromatografía iónica con inhibidores
 Los detectores de conductividad son una buen
elección para la cromatografía iónica
en la
determinación de especies inorgánicas. Son sensibles
y responden a los cambios de concentración.
 Limitación: la concentración del electrolito que se
requiere para eluir los iones del analito, reducen la
sensibilidad del detector.
Columnas inhibidoras
 La columna inhibidora está
rellena con una segunda resina de
intercambio iónico que convierte
con eficacia los iones del solvente
en especies moleculares de
ionización limitada, sin afectar la
conductividad causada por los
iones del analito.
 H+ (ac) + Cl- + resina +OH- 
resina+Cl- (s) + H2O
Cuando se determinan cationes se
emplea HCl como eluyente y la
columna inhibidora es una resina
de intercambio aniónico en la
forma de hidróxido.
Cromatografía iónica con una sola columna.
 Se aumentan las
diferencias de
conductividad entre los
iones de la muestra y los
iones del eluyente con
intercambiadores de baja
capacidad que hacen
posible la elución con
soluciones que contienen
bajas concentraciones del
electrolito.