Transcript Análisis de compuestos traza en muestras ambientales

Análisis de compuestos traza en
muestras ambientales
Contaminación Ambiental
Presencia de compuestos químicos específicos,
naturales o antropogénicos, que provocan efectos
nocivos sobre la salud o los ecosistemas
Químicos
 Biológicos
 Sanitarios
 Legislativos, etc...
Análisis Ambiental
Origen (Caracterización de fuentes)
Transporte y distribución
Procesos de degradación biótica o/y abiótica
(¿nuevos contaminantes tóxicos?)
Destino final (bioacumulación, etc)
Efectos
Límites legales
Identificación y Análisis de compuestos
químicos en el medio ambiente
Límites exigidos por la normativa
No
75/440/EEC
Título
Aguas superficiales
80/778/EEC
Agua para consumo humano
76/659/EEC
Aguas con peces
76/464/EEC
Substancias peligrosas Lista 1
Compuestos orgánicos
Cyfluthrin
Hidrocarburos
Permerthrin
Plaguicidas
Fenoles
Hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs)
Plaguicidas individuales
Plaguicidas totales
Benzo-3,4-pireno
Tetracloruro de carbono
Tricloroetano
Tetracloroetano
Trihalometanos
Fenoles
PAHs
Cyfluthrin
Flucofuron
PCSDs i PAD
Permethrin
Sulcofuron
Tetracloruro de carbono
Cloroformo
DDT
Endrin
Aldrin
Dieldrin
Isodrin
Hexaclorobenceno
Hexaclorobutadieno
Lindano
Pentaclorofenol
1,2-dicloroetano
Percloroetileno
Triclorobenceno
Tricloroetileno
Límites (ug/L)
0.001
50-1000
0.01
1-5.0
1-100
0.2-1.0
0.1
0.5
0.01
3.0
30.0
10.0
100.0
0.5
0.2
0.001
1.0
0.05
0.01
25.0
12.0
12.0
0.01
0.005
0.01
0.01
0.005
0.03
0.01
0.11
2.0
10.0
10.0
0.1
10.0
ppb
Análisis Ambiental
Matrices complejas
 Selectividad
Compuestos con un
gran intervalo de
 Universalidad
propiedades fisicoquímicas.
 Sensibilidad
Analitos a nivel de
traza (ppb, ppt)
Análisis específicos vs multiresiduos
• Determinación de
• Determinación del
un solo compuesto
máximo número de
o grupo de
contaminantes con
compuestos en una
propiedades físicomatriz ambiental
químicas diferentes
específica
– Metabolitos
– Contaminación global
EPA Priority Pollutants
– Efectos sinérgicos o
Protocols
antagónicos
Determinación de compuestos orgánicos traza











Hidrocarburos alifáticos
Hidrocarburos aromáticos
Aldehidos
Alcoholes y fenoles
Anilinas y benzidinas
VOCs (Disolventes clorados)
SOCs (PCBs, dioxinas)
Plaguicidas apolares y polares
Ftalatos i adipatos
Tensioactivos
...y muchos más
Análisis Ambiental
Toma de muestra
Tratamiento previo
Extracción
Purificación
(Clean-up)
Análisis Instrumental
GC
HPLC
GC-MS; HPLC-MS
Cuantificación
Compartimentos medioambientales
Análisis Ambiental
Toma de muestra
Tratamiento previo
Extracción
Purificación
(Clean-up)
Análisis Instrumental
GC
HPLC
GC-MS; HPLC-MS
Cuantificación
Análisis Ambiental
To m a de m u e stra
T r atam iento pr ev io
Sedim entos , s uelos
Eliminación agua
Eliminación material grueso
Tam iz ado (> 250 µ m , 63 µ m )
H o m o g e n e iz ar
Agua
Par ticulad o
Elim inación agua
A ir e
Par ticulad o
Elim inación agua
Or ganis m os
Eliminación agua
Digestión ácida o alcalina
Homogeneizar
Eliminación de agua




Liofilización
Secado en horno (35-40 oC)
Tratamiento con desecantes
Pre-extracción con disolventes
orgánicos miscibles en agua
Análisis Ambiental
Toma de muestra
Tratamiento previo
Extracción
Matrices acuosas
Líquido-Líquido
Extracción en fase sólida (SPE)
Matrices sólidas
Ultrasonidos
Soxhlet
Extracción asistida con Microondas (MAE)
Extracción con disolventes acelerada (ASE)
Extracción con fluidos supercríticos (SFE)
Matrices acuosas. Extracción líquido-líquido
 Se extrae el total de componentes
(particulado+disuelto)
 Consumo de grandes cantidades de disolvente
– Problema medioambiental
– Problema de blancos
– Paso de eliminación del disolvente
 Protocolos largos
pérdidas
Extracción en fase sólida (SPE)
 Paso a través de un adsorbente de sílica
modificada químicamente
o Cadenas hidrocarbonadas (C8 y C18)
 Se extraen solo los componentes disueltos
(filtrar previamente)
 Muy versátil
 Rápida y sencilla (automatización)
 Relativamente barata
 Bajo consumo de disolventes
 A considerar :
o Volumen de ruptura
o Capacidad
o Limpieza
Extracción en Soxhlet
Refrigerante
Muestra
(Cartucho de
Celulosa)
1-200 gr
100-200 ml disolvente
Calor
Diagrama de fases
ASE, accelerated solvent extraction
MAE, Microwave assisted extraction
SFE, supercritical fluid extraction
Pc, presión crítica
Sólido
Tc, temperatura crítica
Pc
C, punto crítico
Presión
FS
Líquido
SFE
ASE
MAE
C
Soxhlet
Sonicación
Temperatura
Gas
Tc
Técnicas de extracción de compuestos
orgánicos en matrices sólidas
Soxhlet
Sonicación
SFE
MAE
ASE
Tiempo
++++
++
+
+
+
Disolventes
++++
++
+
++
+
++
+
Automatización
+
+
+++
Dificultad de
optimización
+
+
+++
++
++
++++
++++
+++
++
+++
Costes
Robustez
++++ +++ ++++
+++ ++++
Análisis Ambiental
Toma de muestra
Tratamiento previo
Extracción
Purificación
(Clean-up)
Análisis Instrumental
GC
HPLC
GC-MS; HPLC-MS
Cuantificación
Análisis Ambiental
Toma de muestra
Tratamiento previo
Interferencias más importantes:
Extracción
Purificación
(Clean-up)
Cromatografia de adsorción en columna
Ataque ácido o básico
Extracción en fase sólida (SPE)
• Lípidos
• Azufre
• Carotenoides
• Pigmentos...
Clean up del extracto
 Cromatografía de columna líquido-sólido
Fase móvil
Polaridad creciente
apolar
Fase estacionaria polar
– Adsorbentes más comunes:
•
•
•
•
•
Sílice (uso general)
Alúmina
Florisil (Clean-up de plaguicidas organoclorados)
Poliestireno, poliacrilamida
Geles para GPC (Por ej.: Sephadex LH-20, Bio-Beads SX)
(Clean-up de muestras con alto contenido lipídico)
Eliminación de azufre
 Reacción con mercurio
 Sulfuro de mercurio
 Reacción con cobre
 Sulfuro de cobre
 Reacción con sulfito de sodio en hidróxido
de tetrabutilamonio
Concentración del analito
 Evaporación del disolvente a presión reducida
(rotavapor)
 Kuderna-Danish
 Corriente de nitrógeno
Análisis Ambiental
Toma de muestra
Tratamiento previo
Extracción
Purificación
(Clean-up)
Análisis Intrumental
GC
HPLC
GC-MS; HPLC-MS
Sistemas de Cromatografía
Volatilidad
Cromatografía
de gases (GC)
Cromatografía
Líquida (HPLC)
Baja
Polaridad
(Solubilidad en agua)
Alta
Cromatografía de gases
Registrador
Integrador
Ordenador
Gas portador 1-2 µl
Inyector
250-300 oC
Horno +
columna
Detector
Cromatografía de gases
Los analitos se evaporan a temperatura alta (250-300oC), y se hacen
pasar por una columna cromatográfica. Separación isoterma o por
gradiente de temperatura.
 Fase móvil gas inerte: He, H (gas portador, carrier)
 Columnas capilares de sílice fundida (0,25 mm d.i. x 25-50 m; espesor
de capa 0.25 µm)
 Normalmente con la fase líquida (WCOT)
 Fases más utilizadas: silicones
 OV-1: Metilsilicones
 OV-17:metilfenilsilicones
 OV-210: trifluoropropilsilicones
 Detectores universales (FID) y selectivos: ECD, FPD, NPD.
Cromatografía de gases. Detectores
 Detector Universal
 Detector de ionización de llama (FID)
o Universal
o Destructivo
o Estable y lineal
 Detectores Selectivos
 Detector de captura de electrones.
o Para compuestos con grupos electronegativos (halogenados,..)
o No destructivo
o Rango lineal estrecho
 Detector de nitrógeno-fósforo
o Para compuestos con N y P
o Destructivo
o Moderadamente lineal
 Detector fotométrico de llama.
o Compuestos con S y Sn (diferentes filtros)
o No lineal
o Destructivo
Mezcla de PCBs. GC-ECD
HPLC. Cromatografía líquida de alta resolución
• Generalmente en fase inversa: fase estacionaria de C8-C18;
fase móvil acuosa con acetonitrilo o etanol
– Útil para substancias:
• alto peso molecular
• baja volatilidad
• Lábiles, degradaciones térmicas
• polares
Si son muy polares: cromatografía de
par iónico o en fase normal (aminopropil, fases
móviles con disolventes orgánicos)
HPLC. Detectores
Detector de ultravioleta-visible
Detector de fluorescencia
Detector de fotodiodos (Diode-array)
Espectrometría de Masas
 Identificación inequívoca de
sustancias en matrices
complejas (CG,CL...)
 Análisis de sustancias con
propiedades fisico-químicas
distintas (átomos a
biopolímeros)
 Análisis cuantitativos (límites
de detección ppb,ppt)
Selectividad
Universalidad
Sensibilidad
Espectrómetro de Masas
Presión ~ 10-6-10-8 Torr
Introducción
muestra
+
Fuente de iones
(Ionización)
+
+
+
+ + +
+ +
Analizador
(Separación)
100 %
+ + +
M/Z
Detector de iones
(Detección)
Acoplamiento GC/LC-MS
100
Separación
cromatográfica
%
Ionización
0
2.00
4.00
6.00
8.00
rt
10.00 12.00 14.00 16.00 18.00
t (min)
218
100
220
%
162
164
83
84
0
Análisis
espectral
98 123
100
154
150
165
222
177 216
200
223 256
250
284 288
300
masa/carga
Sistemas de Introducción
GASES
CROMATOGRAFIA GASES CAPILAR
Conexión directa
LIQUIDOS
SOLIDOS
LC, EC
Interfases especialesDLI
PB
MEMBRANA
CF-FAB
TSP
SONDA DIRECTA
APcI
ESP (ionspray)
Interfases CL-EM
INTRODUCEN MUESTRA
INTRODUCEN E IONIZAN
 Haz de partículas (Particle
beam PB)
 Cinta móvil (moving belt)
 Introducción directa (DLI)
 Termospray (TSP)
 Bombardeo con átomos
rápidos a flujo continuo (CFFAB)
 Ionización a presión
atmosférica (API)
 Electrospray (ESP)
 Ionspray
 Ionización química a
presión atmosférica
(APcI)
Sistemas de Introducción
Peso Mol.
Electrospray
Ionspray
CF-FAB
Particle
APCI
CG/EM Beam
Termospray
Baja
Polaridad
(Solubilidad en agua)
Alta
CL-EM. Aplicaciones descritas en la literatura
Nº Publicaciones
200
MBL
150
TSP
PB
100
ESP
50
APcI
0
79-80 81-82 83-84 85-86 87-88 89-90 91-92 93-94 95-96
Años
W.M.A. Niessen, en: D. Barceló (Ed.), Applications of LC-MS in Environmental
Chemistry. J. Chromatography Lib. Vol 59, Elsevier Sc. Amsterdam, Holanda (1996).
Sistemas de Ionización
Ionización por Impacto Electrónico (IE)
Ionización Química
 Ionización Química Positiva
 Ionización Química Negativa
 Ionización Negativa por Captura de Electrones
Ionización/Desorción de Campo
Ionización/Desorción por Plasma
Ionización por Bombardeo de Atomos Rápidos (FAB)
Ionización Multifotónica
Ionización Laser Asistida por Matriz (MALDI)
Ionización por Plasma de Acoplamiento Inductivo (ICP)
Métodos de ionización en EM
 Impacto de electrones (70 eV).
o Mucha energía, muchas fragmentaciones
o Universal
 Ionización química negativa
 Ionización química positiva
o Técnicas de ionización suaves, poca fragmentación (ión
molecular)
o Selectivas, compuestos electronegativos o
electropositivos
o Método de ionización en HPLC-EM
Dioxinas. Cuantificación por EM(IE)
M+.
(M-COCl)+
Cl
O
Cl
Cl
O
Cl
2,3,7,8-Tetraclorodibenzo-p-dioxina
Análisis Ambiental
Toma de muestra
Tratamiento previo
Extracción
Purificación
(Clean-up)
Análisis Instrumental
GC
HPLC
GC-MS; HPLC-MS
Cuantificación
Cuantificación
• Calibración con patrones externos e internos
(identificación por tiempo de retención)
• Blancos del procedimiento
• Determinación de
Validación del método
– sensibilidad
–
–
–
–
–
–
límite de detección
intervalo de linealidad
precisión
exactitud
robusteza
interferencias del método
• Confirmación por GC-MS o HPLC-MS
Control de calidad
 Objetivo
 Comprobar:
 eficiencia de la extracción
 pérdidas en las etapas de clean up
 pureza de los blancos
 Separación cromatográfica
 Procedimiento






Falsos positivos :
Interferencias de la muestra o
contaminación externa
Falsos negativos: Se concluye que un
contaminante no aparece cuando en
realidad si está en cantidades detectables:
Bajas recuperaciones
Interferencias que enmascaran
Añadir un “surrogate”: por ejemplo ,trans-heptacloroepoxido, decaclorobifenilo
Como mínimo una muestra del batch por duplicado
Muestra certificada o repetida
“Muestra ciega”
Blancos: por ejemplo en casos de muestras de agua, agua milli-Q
Calibrado del aparato con 4 puntos mínimo y comprobación periódica
 Criterios de calidad:
 Recuperación entre 50-130%
 Diferencia entre los dos duplicados <25%
 Blanco no tendría que dar niveles detectables del analito
límite de
cuantificación.
Sedimento húmedo
Ejemplo 1
Análisis de HAP y
PCBs en sedimento
Extracción
MeOH
Extracción
DCM:MeOH
(2:1)
PCB30,PCB209,an-d10, pi-d10, b[ghi]per-d12
Saponificación
KOH/MeOH
6%
Extracción
n-hexano
Fase hexánica
Fase metanólica
Fracción
ÁCIDA
Fracción
NEUTRA
Cromatografía de
adsorción alúmina
FRACCIÓN II
FRACCIÓN I
OCs
HAPs
TCN, OCN, naf-d8, per-d12
Tratamiento
Cu
TCN, OCN, naf-d8, per-d12.
CG-EM
SIM
CG-EM
SIM
HAP. Análisis por CG-EM (SIM)
TIC (SIM)
+
+
Rango lineal :250-10.000 ng/ml (ppb)
LDD (S/N =3) : 2,5 - 10,5 pg
tR (min)
Ejemplo 2. Análisis de OCs y HAP en muestras de aire
Fase gas:
Fase particulada:
Filtro
Espumas
naf-d8, pi-d10
PCB30, PCB209
Extracción Soxhlet
400 ml hexano, 24 h
Evaporación a
presión reducida
1 ml
TCN, OCN, per-d12
Vial tarado
OCs y HAPs, CG-EM/SIM
Extracción por sonicación
3 x 30 ml DCM:MeOH
(2:1)
10 ml de extracto
an-d10, pi-d10,
per-d12, b[ghi]per-d12
PCB30, PCB209
Na2SO4
1 ml
TCN, OCN, naf-d8
OCs y HAPs, CG-EM/SIM
Ejemplo 3. Análisis de OCs y HAP en agua
Elución fase disuelta:
1º
Fase particulada:
2ª
Filtro
MeOH
Liofilización
200 ml MeOH
50 ml de azeótropo
Extracción líquido-líquido
3 x 30 ml hexano
200 ml DCM
Extracción
DCM:MeOH (2:1)
PCB 30, PCB 209
an-d10, pi-d10, per-d12,
b[ghi]per-d12
PCB30,PCB209,an-d10,
pi-d10, b[ghi]per-d12
Saponificación
50 ml de extracto
KOH/MeOH 6%
Na2SO4
Extracción
n-hexano
10 ml de extracto
TCN, OCN, naf-d8
OCs y HAPs, CG-EM /SIM
Fase metanólica
Fase hexánica
Fracción
ÁCIDA
Fracción
NEUTRA
Cromatografía de
adsorción alúmina
FRACCIÓN I
FRACCIÓN II
OCs
HAPs
TCN, OCN, naf-d8, per-d12
CG-EM
SIM
Ejemplo 4. Análisis de HAP y OCs en muestras de deposición total
Fase particulada:
Fase disuelta:
FiltroMeOH
congelado
Liofilización
Extracción
DCM:MeOH
(2:1)
PCB30,PCB209,an-d10,
pi-d10, b[ghi]per-d12
Elución 5 ml MeOH
Elución 5 ml ciclohexano
Extracción l-l
2 ml hexano
Elución 5 ml DCM
PCB30,PCB209,an-d10,
pi-d10, b[ghi]per-d12
10 ml de extracto
Na2SO
4
Fase metanólica
Fracción
ÁCIDA
Extractos
Fase hexánica
Fracción
NEUTRA
Na2SO
Fase metanólica
4
Fracción
ÁCIDA
Fase hexánica
Fracción
NEUTRA
Cromatografía de
adsorción alúmina
Cromatografía de
adsorción alúmina
OCs y HAPs
TCN, OCN, naf-d8, per-d12
OCs y HAPs
CG-EM
SIM
TCN, OCN, naf-d8, per-d12
Carrera et al., J. Chromatogr .1998
CG-EM
SIM
Ejemplo 5. Análisis de OCs en muestras de peces
4,5 g de músculo dorsolateral
se trituran y secan con Na2SO4
Extracción Soxhlet
Hex:DCM (4:1), 18 h
20 ml
80 ml
TBB y PCB 209
Lípidos
2 ml, clean-up H2SO4
o GPC
se desecha la fase ácida
OCs, CG-ECD
Ejemplo 6. Análisis multiresiduos
Sedimento marino
Liofilización
Tamizado (250 µm)
Extracción
Soxhlet
DCM:MeOH
(2:1)
Cromatografía adsorción
Silica:Alúmina
(5% agua)
Tratamiento HCl
Análisis elemental
% C orgánico
Hexano
Alcanos
Hexano:DCM (90:10)
PCBs, LABs
Hexano:DCM (80:20)
HAP, esteres céridos
Hexano:DCM (50:50)
Alquilnitrilos, aldehidos
DCM
Cetona esteroidales
DCM:MeOH (80:20)
Fosfatos alquilo
Esteroles, alcoholes
Eter dietílico
Trialquilaminas
CG/FID
Tratamiento Cu
GPC
CG/NPD
CG/FID
CG/FID
Derivatización
trimetilsilil
CG/NPD
CG/ECD
CG/FID
CG/EM
CG/FID
CG/NPD
Tensioactivos. Análisis
Sustancias iónicas, no volátiles y solubles en agua
CG-EM
Necesidad de derivatización previa
CL-UV o fluorescencia
Mezclas complejas
No existen apenas sustancias puras
Muchos no tienen grupo cromóforo
Cromatografía Líquida acoplada a Espectrometría de Masas
Residuo
Válvula
Reactivo
Naranja de metilo/H2O
0.4 ml/min
Mezcla limpieza
MeOH/ NH3
Columna de Fase Normal
Nucleosil- NH2
Bucle de extracción
Residuo
Separador de
Fases
CROMATOGRAFIA LIQUIDA
ALTA EFICACIA
CHCl3 / MeOH / HAc
1.2 ml/min
(CH3)2N
Restrictor de flujo
UV/VIS
Detector
420 nm
N=N
SO3 +
+ NR4
Fase Orgánica
0.4 ml/min
(CH3)2N
N=N
SO3 + NR4
Tensioactivos Catiónicos. Electrospray-EM
PATRON
Condiciones experimentales :





Voltaje aceleración 4kV
Voltaje capilar 8.7 kV
Gas nebulizador N2 a 12 L/h
Gas envolvente N2 a 200 L/h
20 ng/l DTDMAC en metanol
a 10 ul/min
LODO DEPURADORA
 Barrido de m/z 50 a 1500
(2 s/decade)
Plaguicidas. Técnicas “on-line”
Plaguicida
Técnica
CL-EM
Extracción
LDD (S/N=3)
(ng/L)
Referencia
Ac. Clorofenoxicarb.
ISP (+)
Cartuchos C18
10-100 (SIM, 50 ml)
Chiron et al., 1995
Multiresiduos
TSP(+)
Cartucho C18
Polímero EVB
Organofosforados
APcI (+)
APcI (-)
Cartucho C18
2-15 (SIM, 100ml)
2-25
Lacorte y Barceló,
1996
Clorofenoles
APcI (-)
ISP (-)
Polímeros con
grupos Sulfónicos
0,5-40 (SIM, 50 ml)
25-100
Puig et al., 1997
Triazina, Fenilurea
APcI (+)
Immunoabsorb.
1-5 (SIM, 20 ml)
Ferrer et al., 1997
1-100 (SIM, 100 ml) Sennert et al.,
1995
ANÁLISIS DE COMPUESTOS ORGÁNICOS VOLÁTILES (VOCs)
 Headspace (espacio de cabeza)
Técnicas
principales
 Purge and Trap (Purga y Trampa)
 Microextracción en fase sólida
 Extracción térmica directa
Purga y
Trampa
 Purga del cartucho
 Captación del aire
 Primera desorción:desorción térmica de los cartuchos
 Refocalización de los analitos en una trampa criogénica
 Segunda desorción: desorción térmica de la trampa y
transferencia -inyección de los analitos a la columna
cromatográfica
 Separación, identificación y quantificación de los analitos
DESORCIÓN TÉRMICA
Primera desorción: desorción térmica de los compuestos retenidos en el
adsorbente del cartucho a una T de 300ºC durante 5 minutos y
refocalizados hacia una trampa criogénica que contiene Tenax TA a T de
-30ºC
Segunda desorción: desorción térmica de los compuestos retenidos
en el adsorbente de la trampa a una T de 300ºC y transferidos a la
columna cromatográfica
Lista negra de contaminantes
(Introducción al medio ambiente se tiene que reducir)
Candidatos a la lista negra
Mercurio
Cadmio
Cobre
Zinc
Plomo
Arsenico
Cromo
Simazina
Atrazina
Tributil estaño
Trifenil estaño
Etil azinfos
Metil azinfos
Fenitrotion
Demeton O
Cloruro cianurico
Dimetoato
1,1-Dicloroetileno
Mevinfos
1,3-Dicloropropan-2-ol
2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético)
2-cloroetanol
Linuron
Etilbenceno
Pirazon
Bifenil
Niquel
‘drins (Aldrin, dieldrin, endrin)
Lindano
DDT
Pentaclorofenol
Hexaclorobenceno
Hexaclorobutadieno
Fention
Malation
Paration
Metil paration
Diclorvos
Tricloroetileno
Tetracloroetileno
2-amino-4-clorofenol
1,4-diclorobenceno
Antraceno
1,3-dicloropropeno
Àcido cloroacético
Hexacloroetano
4-cloro-2-nitrotolueno
1,1,1-Tricloroetano
Tetracloruro de carbono
Cloroformo
Trifluralin
Endosulfan
Triclorobenceno
1,2-Dicloroetano
Tricloroetano
Dioxinas