Transcript Bioszenzorok_előadás_2014_tavasz_kállai_b_rész

Bioszenzorok
Bioreaktorok és a mérnöki gyakorlat kiselőadás
Kállai Brigitta
2014. április 22.
1
Bioszenzorok
• Szenzorokkal mérhető és szabályozható paraméterek:
•
•
•
•
•
•
oldott oxigén és szén-dioxid,
pH,
redoxpotenciál,
hőmérséklet,
habszint,
keverés.
• Első fejlesztések:
• Biomassza meghatározása in situ optikai denzitás méréssel;
• Fejlődő gáz analízis;
• Illékony komponensek detektálása (pl. metanol).
• Bioszenzorok:
• Nem illékony szubsztrátok és metabolitok mérése;
• Egyetlen analitikum mérése még komplex mátrixokban is.
2
Bioszenzorok
• A mintavétel és analízis között eltelt idő összhangban kell
legyen a folyamat idejével
• Baktériumok tenyésztése során pár perc,
• Lassabban szaporodó emlős sejtek esetében 1-2 óra,
• Immobilizált enzimet alkalmazó reaktor esetében pár másodperc.
• Alkalmazás:
• In situ (sterilizálás probléma);
• Szűrést követően (analízis körülményei nem egyeznek meg a
fermentáció körülményeivel);
• Alternatíva: automata analizátorok (FIA, flow injection analysis)
Előnyök
Hátrányok
Kisebb befertőződési veszély
Membrán eltömődhet
Rövid válaszidő
Minta hígítására szükség lehet
Kis mintatérfogat elégséges
pH beállítása analízis előtt
Automatikus kalibráció
Idővel szenzor inaktiváció
3
Bioszenzorok általános felépítése
S
JEL
Külső
membrán
pl. dialízis
membrán
P
Jel:
pH-változás,
Felszabaduló gáz,
Fényemisszió
Tömegváltozás
Stb.
Jelerősítés
Biológiai érzékelő
(Biokatalizátor)
•
•
•
•
•
•
Teljes organizmusok
Szövetek
Sejtek
Organellumok
Enzimek
Antitestek
PC
Jelátalakító
(Transzducer)
•
•
•
•
•
Potenciometriás
Amperometriás
(Konduktometriás)
Termikus
Optikai
4
Enzimek alkalmazása analitikai célra (BIM)
• Szubsztrát, mint analitikum
5
Sevella Béla: Biomérnöki műveletek és folyamatok, 2011 (98. oldal)
Enzimek alkalmazása analitikai célra (BIM)
• Ha nincs közvetlenül mérhető változás: indikátorreakció!
elnyelési max.
6
Sevella Béla: Biomérnöki műveletek és folyamatok, 2011 (98. oldal)
Enzimek
 Kvantitatív:
 Specifikus reakciók;
 Minimális mintaelőkészítés;
 Michaelis-Menten kinetika
 Szilárd felszínen történő rögzítés (immobilizációs stratégia)
 Cél:
 Az enzim lehető legmagasabb aktivitása
 Hosszú stabilitási idő
 Rögzítést követően kis távolság a jelátviteli egységtől
 Fizikai: gélbe zárás, adszorpció
 Kémiai: kovalens kötéssel, keresztkötéssel, immobilizáció polimer
filmbe
7
Fizikai: gélbe zárás
 Gélképző polimerek pl. alginát, kitozán, akrilamid
 Enzimtartalmú oldat + nátrium-alginát összekeverése
 Csepegtetés Ca2+ ionokat tartalmazó pufferbe
 Kálcium-alginát nem oldódik vízben, a golyócskák bezárva
tartalmazzák az enzimmolekulákat.
 Előny: bármilyen enzimre alkalmazható
 Hátrány:
 Frissen kell elkészíteni
 Lassú a szubsztrát/termék transzport, hosszú a reakcióidő
 Enzimek folyamatosan elvesznek (póruseloszlás miatt), csökken
az enzimaktivitás
 Polimer szerkezete megváltozik (zsugorodhat/duzzadhat a
környezet ionerősségétől függően)
8
Fizikai: adszorpció
• Előny: nincs szükség további reagensekre, minimális aktiváció
• Hátrány: gyenge kölcsönhatások → érzékeny a környezezet
megváltozására (pH, hőmérséklet, ionerősség, polaritás)
• Modell: minden egyes a felülettel érintkező molekula
adszorbeálodik és koncentráció gradiens alakul ki.
Mi a probléma?
A modell nem veszi figyelembe a
parciális telítettséget, ekkor a
deszorpció kedvezményezett.
• Alkalmazás:
egyszer használatos szenzorok
(nem igényelnek hosszú távú
stabilitást)
9
Kémiai: kovalens kötéssel immobilizált enzim
 Előny: irreverzibilis (stabil)
 Kémiai kötés - a fehérje funkcióit nem befolyásoló aminosav
oldalláncokkal (karboxil, hidroxil, tiol, imidazol, fenol)
I. Fémelektródokhoz
1) elektródfelület aktivációja: Fém + szilán → stabil –M-O-Si- kötés
2) enzim kötődése az aktivált elektród felülethez → amid kötés
•
Aktivált enzim (BIM)
10
Kémiai: kovalens kötéssel immobilizált enzim
II. Szénelektródokhoz
1. Felületi hidroxil csoport + cianur-klorid (2,4,6-Triklór-1,3,5-triazin)
→ szerves oldószerekben és vizes oldatokban stabil éter-kötés
2. Cianur-klorid + hidroxil, amino csoport
Pl. torma peroxidáz rögzítése grafit részecskék felületéhez
11
Kémiai: keresztkötéssel
12
http://synapses.clm.utexas.edu/lab/howto/cross-linking%20fixatives.pdf
Kémiai: immobilizáció elektrokémiai
polimerizációval
• Monomer (pirrol, tiofén) → gyök → polimer
• In situ polimer film elektrokémiai iniciációval
• A vizes oldatban jelenlévő enzimmolekulák bezáródnak a növekvő
polimer mátrixba
• Előny:
• Rugalmas módszer, könnyen kontrollálható
• Egyszerűen megvalósítható
• Magas enzimaktivitás
• Akár több réteg is növeszthető, több enzim immobilizálható
• Elektród felületéhez lokalizálódó polimerek: polianilin, polifenolok,
polipiridin
13
Bioszenzorok általános felépítése
S
JEL
Külső
membrán
pl. dialízis
membrán
P
Jel:
pH-változás,
Felszabaduló gáz,
Fényemisszió
Tömegváltozás
Stb.
Jelerősítés
Biológiai érzékelő
(Biokatalizátor)
•
•
•
•
•
•
Teljes organizmusok
Szövetek
Sejtek
Organellumok
Enzimek
Antitestek
PC
Jelátalakító
(Transzducer)
•
•
•
•
•
Potenciometriás
Amperometriás
(Konduktometriás)
Termikus
Optikai
14
Jelátalakító: potenciometriás
Azt a potenciálkülönbséget méri, mely fellép az ion-szelektív
membrán két oldalán.
Egy ion-szelektív elektródra mindig érvényes összefüggés:
E – mért potenciál
R – egyetemes gázállandó
T – abszolút hőmérséklet
n – ion töltése
ai – adott ion aktivitása
• Ionszelektív elektród kalibrációs egyenesének meredeksége
standard hőmérsékleten és nyomáson: 59/n mV
• Például:
• karbamid detektálásához ureáz enzim
• Ionszelektív elektród: pH, NH3, CO2
15
Jelátalakító: potenciometrikus enzimelektród felépítése
• Mérőelektród: pH-üvegelektród
• Üveggömbre felhordva a gélben rögzített enzim
• Enzimes reakció sztöchiometrikus protonképződéssel vagy NH3
felszabadulással jár (segédelektród)
16
Sevella Béla: Biomérnöki műveletek és folyamatok, 2011 (100. oldal)
Jelátalakító: amperometriás
Biokatalizátor
Azt az áramot méri, ami az elektródon fellép egy
adott potenciálon. Ez a mért áram egyenes arányban
áll a kérdéses anyag oldatbeli koncentrációjával.
Enzimes redox reakció:
Szubsztrát (2H) + FAD-oxidáz →
Termék + FADH2-oxidáz
a) Első generációs:
A termék keletkezésének vagy a reakciópartner
fogyásának figyelemmel követésével következtetünk
a vizsgálandó anyag koncentrációjára.
Biokatalizátor:
FADH2-oxidáz + O2 → FAD-oxidáz + H2O2
Elektród:
H2O2 → O2 + 2H+ + 2ehttp://www1.lsbu.ac.uk/water/enztech/amperometric.html
17
Jelátalakító: amperometriás
Biokatalizátor
Enzimes redox reakció:
Szubsztrát (2H) + FAD-oxidáz →
Termék + FADH2-oxidáz
• Mi a probléma?
• Oxigén tenziójának helyi ingadozásai (pH,
hőmérséklet, ionerősség megváltozása miatt)
• Endogén anyagok nem-specifikus oxidációja
miatti hidrogén-peroxid mérés
• Megoldás: mediátorok alkalmazása
18
http://www1.lsbu.ac.uk/water/enztech/amperometric.html
Jelátalakító: elektronátadó sók
• Elektronátmenettel járó enzimes reakciók (NAD, FAD mediált
reakciók): elektronátadó sók
19
Sevella Béla: Biomérnöki műveletek és folyamatok, 2011 (101. oldal)
Jelátalakító: amperometriás
Biokatalizátor
Enzimes redox reakció:
Szubsztrát (2H) + FAD-oxidáz →
Termék + FADH2-oxidáz
b) Második generációs:
Mediátorral módosított, a mediátor redox
tulajdonságai segítik az elektrontranszfert az enzim
és az elektród felülete között.
Biokatalizátor:
FADH2-oxidáz + 2 Ferrocénium+ → FAD-oxidáz +
2 Ferrocén + 2H+
Elektród:
2 Ferrocén → 2 Ferrocénium+ + 2e-
A reakcióban felszabaduló elektronok ferrocén
közvetítésével jutnak az elektródhoz.
http://www1.lsbu.ac.uk/water/enztech/amperometric.html
20
Jelátalakító: amperometriás
Biokatalizátor
Enzimes redox reakció:
Szubsztrát (2H) + FAD-oxidáz →
Termék + FADH2-oxidáz
b) Harmadik generációs:
Direkt enzim-elektród kapcsolat, az elektród
közvetlenül felhasználja a reakcióban felszabaduló
elektronokat.
Biokatalizátor/elektród:
FADH2-oxidáz → FAD-oxidáz + 2H+ + 2e-
21
http://www1.lsbu.ac.uk/water/enztech/amperometric.html
Jelátalakító: amperometriás – glükóz elektród
Oldott oxigént mérő elektród
membránfelületére rögzített
glükózoxidáz és kataláz enzim
• Membrán határolja, mely a
meghatározandó
szubsztrátra (glükózra), és a
termékre (glükonsavra) is
áteresztő
• Reakció során csökken a
gélben az oldott oxigén
koncentrációja, amit az
oxigénelektród detektál.
22
Sevella Béla: Biomérnöki műveletek és folyamatok, 2011 (100. oldal)
Jelátalakító: termikus
Az enzim által katalizált kémiai reakció hőenergia változását
követik (exoterm reakciók, 5-100 kJ/mol)
• A modern termisztorok 0,0001°C különbséget is képesek
rögzíteni
Hátránya:
• Nem-specifikus hőhatások miatt a szubsztrát koncentráció
túlbecslése (pl. áramlásból adódó).
• A mérőeszköz felmelegedéséből származó hőveszteség.
23
Jelátalakító: optikai
A biokatalitikus kölcsönhatás során UV-VIS abszorpció, bio- és
kemilumineszcencia, fluoreszcencia, foszforeszcencia,
visszaverődés, szóródás, stb. történik.
• Optikai szálak és lézerek fejlődésével nagyobb figyelmet
kaptak
• Előnyei az elektrokémiai szenzorokkal szemben:
• Nincs szükség referencia elektródra;
• Nincs szükség közvetlen kapcsolatra a biokatalizátor és az optikai
szál között;
• Biztonságosabbak;
• Stabilabbak működési szempontból.
24
Jelátalakító: optikai
Az optikai szál egyik végén
rögzített szelektív
biokomponens, a szál másik
végén gerjesztő és érzékelő
egység együttese
Scheper et al. (1994): BIOOPTROD
Glükóz, fruktóz, glükonolakton és szorbit
• Glükóz-fruktóz oxidáz komplex (Zymomonas mobilis)
• NADP+/NADPH koenzim redukcióját/oxidációját 450 nm-en
történő fluoreszcencia detektálásával vizsgálták (gerjesztés
360 nm)
Pl. fruktóz redukálódik szorbittá, NADP+ lesz, fluoreszcencia csökken
25
Jelátalakító: optikai
Huang et al. (1991): kemilumineszcencia
• FIA, on-line glükóz, állati sejttenyészet
• Immobilizált glükóz oxidáz (GOD):
Glükóz + O2 + H2O → Glükonsav + H2O2
• Hidrogén-peroxid + luminol → 425 nm-en fényemisszió
26
Köszönöm a figyelmet!

27