Transcript 08_szabályozás

Szabályozás
Transzkripció, transzláció,
enzimaktivitás, fehérje
koncentráció, efektor molekulák
Szabályozó útvonalak prokariótákban
A szabályozás
elsődlegesen a
transzkripciónál
A prokarióta gének
operonokba
szerveződnek
A gének
megnyilvánulását
promóterek
vezérlik
A DNS függő RNS polimeráz (RNAP) felismeri
a promótert és elkezdi a transzkripciót
Iniciáció
RNS polimeráz (core enzim) + szigma faktor (sokféle; specifikusság)
Az mRNS transzkriptum szinézise (5’3’);
komplementere a templát szálnak– szigma
disszociál
Elongáció
Az elongáció addíg folytatódik, míg az RNAP el
nem éri a terminátort és disszociál
A transzkripció iniciáció: a RNAP holoenzim a
promoterhez kapcsolódik
holoenzim = RNAP core + σ faktor
A vegetatív (s70) promóter felépítése
-a core promótert ismeri fel a σ faktor
T T G A C A
T A T A A T
69 79 61 56 54 54
77 76 60 61 56 82
17 bp spacer (43)
% gyakoriság
A
47
-60
UP Element
-35
-10
Core Promoter
+1
DSR
Az iniciációs komplextől az elongációsig
RNAP
+
promóter
RNAP
RNAP
Zárt komplex
Nyitott komplex
RNAP
Elongációs komplex
A transzkripció iniciáció mechanizmusa
NTP-ék
k1
k2
RPC
R+P
k-1
A KI egyensúlyi
konstanssal írható
le
k3
RPO
k-2
k4
RPI
k-3
abortív
transzkriptumok
KI = RPC/(R + P)
R – RNAP
P – Promóter
RPC – zárt komplex
RPO – nyitott komplex
RPI – iniciációs komplex
RPE- elongációs komplex
RPE
A nyitott komplex
képződés
sebességét gyakran
kII konstanssal
Ez az átmenet a
“promoter
clearance” a
promóter
felszabadulása kIV
A transzkripciós ciklus
- Körfolyamatnak
tekinthető
1. iniciáció
2. elongáció
3. termináció
A Thermus aquaticus
RNAP core enzim 3D
szerkezete (ribbon
diagram)
Mitől függ a gén transzkripciós aktivitása?
Promóter erősség
Mennyire hasonlítanak a promóter fő részei (-10,-35
boxok és a köztük levő távolság) a konszenzus
szekvenciához?
- általában minél inkább, annál aktívabb a
promóter
- de néhány hely sokkal fontosabb, mint a többi
TTGACA ---17bp---TATAAT---A
konszenzus
TCGACA---17bp---TATTAT---A
erős promóter
TCAGTT---19bp---GATAAC---A
gyenge promóter
A fő elemeken kívüli szekvenciák befolyásolják
a promóter erősségét
1. Néhány promóternél hosszabb –10-es
szekvenciák (cisz)
2. UP elemek
más promótereknél a -35-ös boksz előtti AT gazdag
szekvenciák növelik a transzkripció sebességét (cisz)
3. Downstream elemek
közvetlenül a transzkripciós start hely utáni
szekvenciák befolyásolhatják a transzkripció
iniciációjának hatékonyságát (cisz)
Szabályozó fehérjék, vagy más effektor
molekulák (transz)
Génszabályozás I – Transzkripció szabályozása
NTP-k
k1
k2
RPC
R+P
k-1
A KI egyensúlyi
konstanssal
jellemezhető
k3
RPO
k-2
k4
RPI
RPE
k-3
abortív
transzkriptumok
KI = RPC/(R + P)
A nyitott komplex
képződés
sebessége kII
Ez az
átmenet a
„promóter
tisztulása,”
“promoter
clearance”, a
kIV
konstanssal
jellemezhető
Két lépés a szabályozott gén-megnyilvánuláshoz
1. σ faktor választék – megszabja, hogy melyik
promoter legyen be-, vagy kikapcsolva.
2. Szabályozó fehérjék – általában DNS-kötő
fehérjék
a. Represszorok – gátolják a transzkripciót
b. Aktivátorok – növelik a transzkripciót
c. Kettős hatású szabályozók – mindkettőt – a
körülményektől függően
A transzkripció inicációjának kezdete: RNAP holoenzim
kötődik a promóterhez
holoenzim = RNAP core (α2ββ’) + σ
A vegetatív (s70) promóter felépítése
-a core promótert ismeri fel a σ faktor
T T G A C A
T A T A A T
69 79 61 56 54 54
77 76 60 61 56 82
17 bp spacer (43)
% gyakoriság
A
47
-60
UP elemek
-35
-10
+1
DSR
Core promóter
DSR = downstream regulátor elemek
Alternatív σ faktorok
Különböző szerkezetű promótereket
ismernek föl – gének különböző regulonjai
Az különböző σ faktorral szabályozott promótereknek
teljesen eltérő konszenzus szekvenciája lehet
s70
TTGACA – 17 bp – TATAATN3-6-A
-35
-10
s32
CTTGAAA – 16 bp – CCCCATNTN3-10-T/A
-35
-10
s54 GG – N12 – GC/T – 12bp – A
-24
-12
Egy adott pillanatban a legtöbb RNAP s70 –es, de
néhány százalékban más σ faktor is van
A legtöbb s faktor a s70 –es családhoz tartozik
és ezért a σ70 –hez hasonlóan működik
A s54 eltérő – a kötödés után egy aktívátor fehérjének
kell aktiválni – kII–őt befolyásolja – RPO képződik
Hogyan tudja egy anti-σ faktor a diferenciális
génszabályozást biztosítani?
Példa: egy anti-σ faktor az FlgM
(FlgM – s28)
Transzkripciós faktorok
Általában DNS-kötő fehérjék, amelyek asszociálnak a szabályozott
promóterrel és csökkentik, vagy növelik a transzkripció gyakoriságát.
Represszorok és aktívátorok –a szabályozó fehérjék jó része
mindkettőt tudja a körülményektől függően
A represszorok eltérő szabályozási mintázatokat
juttathatnak érvényre
Arginin bioszintézis
Represszió
Laktóz degradáció
Indukció
A represszió, vagy korepresszió mechanizmusa
Példa: arginin, a 20 aminosav egyike
A baktériumok el tudják készíteni maguknak, de ha arginint adunk a
táptalajhoz, nem működtetik a bioszintézis géneket (nem nyilvánulnak meg)
(A fene se dolgozik, ha van kaja bőven!)
Nincs arginin
Kell a sejtnek
A represszor nem kötődik
Az arginin gének megnyilvánulnak
Sok az arginin
Elegendő a sejtnek
Represszor + Arg kötődik
Az arginin gének csendesek
Arginin
Represszor, korepresszor, effektor, operátor
Egy indukálható repressziós mechanizmus
Példa: laktóz, cukor szénforrás
a baktériumok hasznosítani fogják a laktózt, ha az van a tápközegben, de
nem működtetik az ehhez szükséges géneket, ha nincs
(Miért gyártsuk le az enzimeket, ha nincs is laktóz?)
Nincs laktóz
A sejt nem hasznosíthatja
A represszor kötődik a lac operátorhoz
Lac enzimek nem képződnek
Van laktóz
Tápanyagként hasznosíthatják
[Represszor + allolaktóz] leválik a DNS-ről
A Lac enzimek gyártása elkezdődhet
Lactose
A transzkripciót aktíváló mechanizmus
Példa: maltóz, cukor szénforrás
A baktériumok hasznosítják a maltózt, ha van, de a gének nem
nyilvánulnak meg, ha nincs
(Miért készítsük el a maltóz hasznosításához szükséges enzimeket, ha
nincs a környezetünkben? – a lac-hoz hasonló logika)
Nincs maltóz
A sejtek nem
Az aktívátor nem kötődhet a DNS-hez
Nincs Mal enzim szintézis
Van maltóz
Tápanyagként hasznosíthatják a sejtek
[Aktívátor+maltóz] kötődhet a DNS-hez
Készülnek a Mal enzimek
Gyenge promóter
maltóz
Aktívátor fehérje, iducer, aktívátor-kötő hely
Hova kötődnek a szabályozó fehérjék a promótereknél?
Az aktívátorok általában -30-as hely előtt
(upstream) kötődnek;
míg sok represszor utána (downstream),
valamint a -30-as boksz előtt is kapcsolódhat a
DNS-hez
Represszió, gátló mechanizmusok
1. Térbeli gátlás (steric hindrance) – a kötőhely átfed a
promóterrel és és a represszor kötődés affinitása nagyobb,
mint a RNAP-é (KI)
2. Fehérje-fehérje kölcsönhatások – a represszor
megakadályozza a RNAP kötődése utáni lépéseket (kII és kIV)
3. RNS polimeráz bezárása – a represszor megváltoztatja a
lokális DNS szerkezetet és így limitálja a kötődött RNAP
produktivitását (kII és kIV)
4. Összetett (multipartite) promóterek és DNS kihurkolás (DNA
looping) – összetett represszorok kötődnek különböző
helyeknél, megváltoztatva a DNS konformációját és
befolyásolják a RNAP kötődését (KI)
A l represszor térbeli gátlással akadályozza PR aktivitását
-10
Lizogén
funkciók
-35
OR3
PRM
l
l -35 l
OR2
l-10
OR1
PR
Lítikus
funkciók
A legtöbb
represszor
sokkal
komplikáltabb –
a LacI
represszor is
Az összetett
operátorok és a
DNS looping is
gyakori
További fehérjék
(mint pl. a CAP
és a CytR) is
gyakran
szerepelnek
A transzkripció aktíválásának néhány mechanizmusa
Szinte mindig szükséges a RNAP-al való kontaktus
Nagyon jó példa a
katabolit represszió
– a katabolit
aktivátor fehérje
(catabolite
activator protein)
(CAP)
Ez „globális”
szabályozó – több
mint 100 promótert
szabályoz
A CAP a cAMP-vel
kapcsolódva aktíválódik
(cAMP intracelluláris
koncentrációja nő, ha a
glükóz elfogy)
A fehérje dimerizálódik és
különböző módon kötődhet a
promóterekhez – és nagy
mértékben meghajlítja a
DNS-t (DNA bending)
I. – a -35 box előtt
II. – átfeda –35–ös régióval
A RNAP-pal érintkezve
stimulálja a transzkripciót
Class I
Class II
A promóter aktíválás I. és a II csoportjának modelljei
Az I. csoportban a CAP
kötőhelyek -62-től -103-ig
terjedhetnek. A CAP a RNAP
α-alegységének C-terminális
(αCTD) részével lép
kölcsönhatásba
A II. csoportban a CAP
kötőhelye általában átfed
a -35-ös régióval. A CAP
kölcsönhat az aCTD-vel,
aNTD-velés a s faktorral
is
Az AraC szükséges az ara gének aktíválásához
További adatok szerint az AraC kapcsolódik egy a PBAD
promótere (az araBAD gének promótere) előtti távoli araO2
operátorhoz és ekkor gátolja a PBAD aktivitását.
Regulátorok aktívátor és
represszor aktivitással
Az arabinóz katabolizmus
regulátora az AraC jó
példa erre
Sok gén vesz részt a
felvételében és a
katabolizmusában
Az AraC-től függő szabályozás
Összetett
repressziós loop
Transzkripciós
aktívátor I. csoport
araC-PBAD kazetta kereskedelmi forgalomban
1. Szigorú represszió arabinóz nélkül (és glükóz
jelenlétében)
2. Arabinóz hozzáadásával erős aktíválódás
A s54 –től függő
aktíválás
mechanizmusa
( a jó öreg σ)
Az NtrC transzkripciós
aktívátorral való
kölcsönhatással – egy
enhancer típusú
fehérje
NtrC stimulálja a s54
RPO képződést – így
befolyásolja kII-őt
A regulátorok a RNAP különböző komponenseivel
lépnek kölcsönhatásba
Szabályozási útvonalak prokariótákban
A transzkripció terminációja a szabályozás fontos
célpontja lehet
A transzkripció sok gén esetében a kódoló
szekvenciák után fejeződik be
A trp mRNS upstream regiójának több lehetséges másodlagos
szerkezete lehet, az egyik transzkripiós terminátor
A triptofán bioszintézise többszörösen szabályozott
- Egyszerű korepressziós mechanizmus a triptofánra adott válasz
– a regulátor a TrpR
triptofán
+ TrpR
TrpR
A trp operon expressziója –
trpEDCBA
A trpR null mutánsban a trp
gének nem működnek
konstitutívan. Van
valamennyi triptofán
represszió.
Genotípus
trpEDCBA expresszió
- Trp
+ Trp
WT
+++++
-/+
trpR mutáns
+++++
+++
A gén szekvenciájának elemzése érdekes
tulajdonságot fedett fel
Ennek a
szekvenciának
a deléciója
megszüntette
a TrpR-től
független
repressziót
A transzkripció attenuációjának
mechanizmusa
1. RNAP megpihen az 1:2 hajtű
szintézise után
2a. A riboszóma elkezdi a leader
transzlációját – áthalad a Trp
kodonokon (sok Trp)
2b. A riboszóma elkezdi a leader
transzlációját – a Trp kodonoknál
megáll (kevés a Trp)
3a. A riboszóma befejezi a leader
peptidet – a 3:4 hajtű kialakul
3b. Az álló riboszóma megakadályozza
1:2 kialakulását – helyette 2:3
képződik
4a. A RNAP terminációját a 3:4 hajtű
kialakulása okozza
4b. A 3:4 hajtű nem tud idejében
kialakulni, a RNAP átírja a
lehetséges terminátor helyet
A transzláció attenuációja
Gyakran az
antibiotikum
rezisztencia géneknél
– néhány antibiotikum
célpontja a riboszóma.
Egy egyedi mRNS
szerkezeten és egy
leader peptiden alapul
mRNS másodlagos
szerkezete lefedi a
riboszóma-kötő
helyet
A transzláció
várakozása a
vezető-peptidnél
megtöri a
másodlagos
szerkezetet és
lehetővé teszi a
transzlációt
A fehérje funkció szabályozása a stabilitásával
Proteázok befolyásolhatják a fehérje
aktivitásának szabályozását
Példa: A sS faktor stabilitásának szabályozása
Az RssB fehérje versenyez a sS –ért és kijelöli lebontásra
Adaptáció környezeti változásra adott válaszként
Külső jelek
Transzmembrán
receptor
Indirekt
hatás
Belső jelek
Fiziológiai
változás
Membránon
áthatoló jelek
Génszabályozás
A környezeti jelzés egyszerű paradigmája – a két
komponensű rendszer
> 30 ilyen rendszer az E. coli-ban – növényekben és gombákban
is, nem csak baktériumokban
1. Környezetből jel
(signal)
2. Érzékelő kináz
(sensor kinase)
3. Válasz szabályozó
(response regulator)
A két komponensű jelátvivő rendszer egyszerűsített modellje
(two component-regulatory system)
Az értékelő hisztidin kináz (sensor histidine kinase) (HK) – általában
transzmembrán fehérje – foszforilezi saját magát (autofoszforiláció)
A válasz szabályozó (response regulator) (RR) – gyakran, de nem
mindig, hat a génexpresszióra – a HK foszforilezi (phosphorelay)
A foszfotranszfer reakciók alaplépései
1. Autofoszforiláció: HK-His + ATP HK-His~P +ADP
2. Foszfotranszfer: HK-His~P + RR-Asp HK-HIs + RR-Asp~P
3. Defoszforiláció: RR-Asp~P + H20RR-Asp + Pi
Alternatív mechanizmusok
1. HK foszfatázok: HK-His~P + PPHK-His + Pi
2. RR foszfatázok: RR-Asp~P + PP RR-Asp + Pi
Változatos fizikai
és kémiai
stimulusokra
válasz lehetőség
Az alap téma
változatos
variációi léteznek
és minél többet
vizsgáljuk, annál
több
permutációját
figyelhetjük meg.
A kétkomponensű RR-ek szerkezetének vizsgálata
szerint jól konzerválódott modul rendszerű felépítés
Che B metilészteráz
CheA hisztidin kináz
NarL RR
Hogyan reagálnak a megfelelő szignálra?
E tekintetben
mind különböző
A szenzor azon
része, ami
lehetővé teszi a
szignálra adott
választ nagyon
különbözik az
egyes
fehérjékben
Egy jól ismert szignál transzdukciós rendszer
(N2-kötés)
A Rhizobium FixL-FixJ
rendszer szabályozza a
gének válaszát a
molekuláris oxigénre
His
A FixL észleli a hem
csoportjához kötődő
oxigént a sejt
belsejében
A FixJ~P aktíválja a
célgéneket,
ha kicsi az O2
koncentráció
L
J
O2
Hem
P
J
Asp
P
Az RssB is egy RR típusú fehérje
HK, ha van egyáltalán, nincs azonosítva.
A célfunkció a proteolízis.
A két komponens nem elég – phosphorelay, foszfát
továbbítás
Phosphorelay szabályozza a B. subtilis spórázását
Egy kettős kináz, phosphorelay szabályozza a
Vibrio harveyi fénytermelését
Eukarióta kétkomponensű rendszerek
Mikrobiális differenciálódás
Definíciók
1. Két sejt különbözik egymástól abban a tekintetben, hogy bár
genomjuk azonos, a szintetizálódó fehérjék különböznek. (Jacob
and Monod, 1963)
2. A differenciálódás a sejtek alakjában és funkciójában
végbemenő stabil, vagy metastabil változás, amikor is a változás
a sejt normális életciklusának a része. (Marty Dworkin, 1985)
3. A prokarióta differenciálódáshoz olyan, az alaki és funkcióbeli
változások szükségesek, amelyek kiemelkedő szerepet
játszanak az organizmus életciklusában. (Brun and Shimkets,
2000)
Myxobacterium-ok:
a fruiting body (termőtest) képződés
komplexitása.
A Myxobacterium-ok termő-testjei baktérium
sejtek ezreinek aggregátumából állnak
érett aggregátum
fiatal aggregátum
Caulobacter crescentus, mint a sejtdifferenciálódás
modellje
Kirajzó (swarmer) sejt:
szóródás
- Nincs DNS replikáció
- Nincs sejtosztódás
- Mozgékony (motilis)
Kocsányos (stalked) sejt:
reprodukció
- DNS replikáció
- Sejtosztódás
- Felülethez kapcsolva
A Caulobacter életciklusa
kirajzás
horgony
szintézis
lehorgonyzás
Az úszó-sejt differenciálódás komplex programja
Az endospóra képződés mint fejlődési modell
1. Spóraképző baktériumok (pl. Bacillus, Clostridium,
Myxococcus)
2. A baktérium sejtben képződik, ezért „endo”-spóra
3. A baktérium sejtciklus nyugvó fázisa
4. Képződése rendszerint valamilyen környezeti hatásra, mint
az éhezés, indukálódik
5. Nagyon ellenálló
- meleg, hideg, kiszáradás, UV sugárzás
spórák
Spórázás
A Bacillus endospóra modell rendszer
DNS-SASP komplex
dipikolinsav
SASP: small acid soluble proteins
Az endospóra képződésének diszkrét fejlődési
állomásai
Előspóra képződés az anyasejtben
Végül a spóra kiszabadul, az anyasejt lizál
Spóra csírázás
Kedvező környezetben a spóra kicsírázik és visszatér
a vegetatív szaporodáshoz.
spóra
vegetatív sejt
A spórázáshoz szükséges gének
Összességében több mint 100 gén
spo gének - > 50 különböző gén – spórázáskor
nyilvánulnak meg
ger gének – a csírázáskor megnyilvánuló
specifikus gének
más gének – számos gén szükséges még
spórázáskor/csírázáskor, ezek természetesen
máskor is szükségesek
A spo géneket aszerint nevezték el, hogy a
spórázás melyik fejlődési szakaszában nyilvánult
meg a hibájuk
A B. subtilis különböző szempotok figyelembevételével
dönt a spórázásról
Végül mind a SpoOA fehérje foszforilezében nyilvánul meg
A SpoOA~P különböző géneket aktívál és represszál,
amelyek a spórázás iniciációjához kellenek
Az
elsődleges
célpontok
közül kettő
σ faktor
A SpoOA~P s factor kaszkádot indít el
- Számos szabályozási célpont, a σ-ák is,
kompartment-specifikusak
sA – vegetatív, sH – korai spórázás, sF előspóra, sE – anyasejt,
sG, elkülönült spóra, sK – pusztuló anyasejt
A sF és a sE mindkét kompartmentben
anyasejt specifikus szigma faktorok
sF aktíváláshoz
kellenek: anti-s faktor
és anti-anti-s faktor
A sE aktíválásához a pre-protein proteolitikus
hasítása kell
sE érését az
előspórában lévő sF
aktíválja
A kompartmentek közötti criss-cross kommunikáció
spórázáskor
Az anyasejtspecifikus s
faktorok preproteinként
képződnek,
aktíválásukhoz
utómunkálatok
szükségesek.
Az előspóraspecifikus s
faktorokat
anti/anti-anti s
faktor
rendszerek
szabályozzák
A kromoszóma DNS partíciója alapvetően különbözik a
vegetatív szaporodási mechanizmustól
A DNS és a fehérjék elhelyezkedése spórázáskor
SpoIIE
A konjugációs
transzfer
rendszerekhez
hasonló
B. subtilis spórázás: szabályozó
kölcsönhatások
• A gének, fehérjék és kis molekulák különböző
kölcsönhatása kell a spórázás iniciációjához.
AbrB
SinR~SinI
SinR
Spo0A~P aktíválja sin operont
SinI
sinR
sA
sinI
sin operon
sH
+
AbrB represszálja sin operont
Spo0A˜P
SinI inaktíváljaSinR-t
Spórázás iniciáció: szabályozó hálózat B. subtilis-ban
H
s
SinR/SinI
A
s
-
SinR
SinI
spo0A
Spo0A
Signal
+
+
s
kinA
sA
sinR
+
H
-
+
+
phosphorelay
KinA
sF
Spo0A˜P
protein
-
Spo0E
promoter
abrB
sA
s
A
sigH s
(spo0H)
sH
Hpr
-
H
sigF
AbrB
spo0E
+
-
-
gene
sH
sinI
sA sA
-
+
sA hpr (scoR)
-
-
EUKARIÓTA
GÉNEXPRESSZIÓ
A TRANSZKRIPCIÓ
SZABÁLYOZÁSA
EUKARIÓTA RNS
POLIMERÁZOK
RELATÍV
AKTIVITÁS
a AMANITIN
ÉRZÉKENYSÉG
rRNS
50-70 %
-
NUCLEOPLASMA
mRNS
20-40 %
+
NUCLEOPLASMA
kis RNS
(tRNS &
5S rRNS)
10 %
VÁLTOZÓ
TÍPUS
HELY
POL I
NUCLEOLOUS
POL II
POL III
TERMÉK
RNS POLIMERÁZOK
ÖSSZEHASONLÍTÁSA
E. coli
a2bb’
b
b’
EUKARIÓTA
II
I
L’
L’
L
L
III
L’
L ~ b és b’
CTD
a
a’
~ a és a’
KÖZÖS
POL II transzkripció iniciáció
• POL II-őn kívül még + 7 GTF
(GENERAL TRANSCRIPTION FACTORS)
• A GTF-ek: TFIIA, IIB, IID, IIE, IIF, IIH & IIJ
Transzkripció
• INICIÁCIÓ
- RNS polimeráz kötödése
- DNS lokális kitekerése
• ELONGÁCIÓ
- Komplementer bázispárosítás
- foszfodiészter kötések kialakítása
- 5’ → 3’ transzlokáció
• TERMINÁCIÓ
- nem specifikus és rosszul meghatározott
POL II
• RNS szintézis DNS templátról
• Az iniciáció és az elongáció során egy sor
általános és specifikus transzkripciós
faktorral lép kölcsönhatásba
• 8-12 alegységből épül fel
• Méreteik változóak 240→16 kDa
POL II alegységek
POL II nagy
240KD-os alegysége
• E coli b’-höz hasonló
• Nagyon konzerválódott – ember/egér 95%
• C terminális ismétlődő CTD
TYR SER PRO THR SER PRO SER
52X egérben
26X élesztőben
• CTD esszenciális az életképességhez
140 KD-os alegység
• E coli b - hoz hasonlít
• A H1hisztonnal keresztreagál
SOKLÉPCSŐS MODELL
PRE-INICIÁCIÓS KOMPLEX
J
UPE
E
IIA IID IIB POL II
TATA
INR
H
IIF
CTD
+1
-20
SOKLÉPCSŐS MODELL
INICIÁCIÓS KOMPLEX
CTD foszforiláció
ATP
J
UPE
IIA IID IIB
TATA
H
CTD
-20
E
POL II
IIF INR
+1
SOKLÉPCSŐS MODELL
PROMÓTER CLEARANCE
RIBONUCLEOTIDES
pre-mRNA
J
UPE
IIA IID IIB
TATA
H
CTD
-20
E
POL II
INR
+1
ELONGATION
FACTORS
INICIÁCIÓ
PROMÓTER CLEARANCE
ELONGÁCIÓ
HOLOENZIM
HOLOENZYME
HOLOENZIM KOMPLEX
ELŐSZERELT
CTD
J
POL II
H IIB IIF
E
UPE
IIA IID
TATA
-20
INR
+1
HOLOENZIM KOMPLEX
ELŐSZERELT
UPE
E
J
POL II
IIA IID
H IIB IIF
CTD TATA
-20
INR
+1
VÁLTOZÁSOK AZ EXPRESSZÁLÓDÓ
CHROMATINBAN
• DNAase I ÉRZÉKENSÉG
• DNAase I HIPERÉRZÉKENYSÉG
(kibomlik)
• DEMETILÁLÓDÁS (RE érzékenység:
MspI (Met), HpaII) aktív gének gyengén
metiláltak
• HISZTONOK ACETILEZÉSE (C-terminális
vég lizinben gazdag, acetilezés
semlegesíti, csökkenő kötődés)
CHROMATIN
ALAPEGYSÉG = NUKLEOSZÓMA
200 bp DNS
H2A
H2B
H2A
H1
H2B
H1
H3
H3
H4
H4
BIZONYÍTÉK A NUKLOSZÓMÁRA
CHROMATIN-t Micricoccus nukleázzal emésztve 200 bp-os
„létrát” kapunk
10OO
8OO
6OO
4OO
2OO
EUKARIÓTA PROMÓTER
UPSTREAM PROMOTER ELEMENTS
(UPEs)
-100
TATA
-30
Inr
Py2CAPy5
Iniciáció általában egy
A -nál
POL I, POL II ÉS POL III PROMÓTEREK
POL II
AdML
UPE -60
TATA -30
Inr +1
POL III
tRNA
(internal)
tRNA
A +20
PSE -60
B +60
TATA -30
POL I
rRNA
UCE -90
CORE
POL I, POL II ÉS POL III PROMÓTEREK
• Minden promóterhez kell a TFIID TATA
kötő helye
Hogyan vizsgáljuk a promótereket?
• Klónozzuk a gén 5’ végét és keressük a
konzerválódott motívumokat
• Megkeressük a fehérjéhez kötödő DNS
szekvenciákat: band shifts, footprinting
• Funkcionális vizsgálatok: helyspecifikus
mutagenezis, riporter gén
Upstream elemek, enhancerek,
silencerek
• Tipikus pol II:
• Eukarióta promóterek:
Transzkripciós aktivátorok
• HTH motívum
• HLH motívum
• Zinc-finger
Transzkripciós aktivátorok
• Leucin-zipper:
Példa: zinc finger, élesztő GAL4, GAL80
• Galaktóz indukál
Transzkripció után: RNS splicing
RNS érés mechanizmusa
• Splicing szignálok:
5' - AG|GUAAGU – intron –YNCURAC – YnNAG|G - 3'
Splicosome
Alternatív splicing
Self-splicing intronok: I., II. csoport
• I. csoport rRNS
prekurzorok:
Self-splicing intronok: I., II. csoport
• II. csoprt
mitokondrium és
kloroplaszt génekben:
5’sapka és 3’poliA farok
5’ sapka: RNS stabilitás
3’ polA farok: RNS stabilitás
Poliadenilációs szignál : AAUAAA
Rövidítés
Teljes név
Funkció
CPSF
cleavage and polyadenylation hasításhoz, adenilációhoz is
specificity factor
kell, köt a AAUAAA-hoz
CF-I
cleavage factor I
RNS kötő fehérje, csak a
hasításhoz kell
CF-II
cleavage factor II
csak a hasításhoz kell
CstF
cleavage stimulation factor
csak hasításhoz kell, a GU/U
régióhoz köt
PAP
poly [A] polymerase
poli [A] szintézist katalizálja
és a hasításhoz is
pol [A] binding protein II
poliadenilációt stimulálja,
segíti poli [A] farok
növekedését
PAB II
• CPSF kék, CF I és II barna,
CstF szürke
• PAP piros
• PAB II sárga
MÁS: Transzlációs
frameshifting
Transzlációs bypass:
T4 gene 60 (topoizomeráz)
INTEIN, EXTEIN