Transcript TK_Antimikrobialis

Antibiotikumok
fejlesztése a genomika
segítségével
Készítette:
Terecskei Kata
IV.biológus
Bevezetés:
1940-1960-as évek: antibiotikumok ‘aranykora’
1970-es évek: megnyertnek hitt csata
1985 óta: antibiotikum rezisztencia
Methicillin-rezisztens Staphylococcus
aureus (MRSA)
Vancomycin-rezisztens Enterococcusok (VRA)
Streptococcus pneumoniae
Enterococcus faecalis
Multidrog rezisztens Mycobacterium tubercolosis
Pseudomonasok
Gram-negatív baktériumok antibiotikum rezisztenciája Magyarországon
1990-es évekig gyógyszeripar célja: meglevő szerek
fejlesztése
(pl: tetraciklinek cglicilciklinek
kinolok cfluorokinolok)
Genomika: új molekuláris targetek
Escherichia coli, Bacillus subtilis modellek helyett
direkt a patogénnel való munka.
Genom szekvenálás: új target
azonosításának alapja
•
•
•
•
•
Szekvenálás automatizálása
Első publikált megszekvenált teljes bakteriális genom:
Haemophilus influenzae (1995)
Mai antibiotikumok célpontja: DNS, RNS, fehérje, sejtfalszintézis c bővülhet a hatáskör
Klasszikus módszer: cidikus vagy sztatikus vegyület keresése n
Ésszerűbb target-alapú stratégia
Genomika: szekvenálás + bioinformatikai analízis
Target szelektálás
Kritériumok:
- emberben ne forduljon elő
- esszenciális legyen a baktérium növekedéséhez vagy
életképességéhez
- expresszálódjon a fertőzés folyamán és fontos
legyen abban
Target spektrum és szelektivitás:
•
ORF azonosítás
•
In silico vizsgálatok
•
Filogenetikai vizsgálatok (különböző fajokban, egy faj
különböző izolátumaiban)
In silico vizsgálat fontossága: UDP-N-acetil-glükóz-amin
enolpyruvát transzferáz (MurA)
Esszenciális génről van-e szó?
met-tRNS szintetáz
polipeptid deformiláz
Gén-inaktiválás: - plazmid-beépítés
- transzpozon-inszerciós mutagenezis
- allél-replacement mutagenezis
- in vitro kondícionálisan letális mutánsok izolálása (géntermék
szintjének vagy aktivitásának csökkentése)
Problémák: - kapcsolat kimutatása a target gátlása és az antimikrobiális hatás között
- nonspecifikus hatások
- nem várt toxicitás
Transzkripció a fertőzés során
•
•
•
•
•
IVET (in vivo expression technology)
DFI (differential fluorescent induction)
STM (signature tagged mutagenesis)
microarray technika
RT-PCR alapú technika
Ígéretes targetek
Amino-acil tRNS szintetázok:
20 van a prokarióta sejtben c 20 új target?
Mupirocin - isoleucyl tRNS szintetázt gátolja cBactrobanTM
•
Polipeptid deformilázok:
A deformilálás kritikus lépés a bakteriális fehérje-szintézisben, Pdf
esszenciális a baktérium növekedéséhez. Jól konzervált sok patogén
esetében.
Actinonin - természetben előforduló antibiotikum, Pdf-et gátolja
több patogén baktériumban (de nem jó a farmakokinetikája)
•
Zsírsav bioszintézis:
Baktérium - de novo zsírsav bioszintézis több enzimmel
Emlős - FAS (fatty acid synthase) komplex
Kettő közt alacsony szekvencia-homológia c szelektív inhibítorok
(isoniazid, thiolactomycin)
•
Antimikrobiális szerek
fejlesztése a bakteriofágok
genomjának segítségével
Staphylococcus aureus



nosocomális fertőzések
vancomicin, methycillin rezisztencia
megszekvenált genom - esszenciális gének azonosítása
- hőmérséklet-szenzitív
mutánsok vizsgálata
- gén inaktiválási vizsgálatok
c


új targetek
26 Staphylococcus aureus fág vizsgálata
31 polipeptid család -bakteriális növekedést gátolták
Bakteriofágok:
- bakteriális fehérjék inaktiválása
- metabolikus folyamatok gátlása
77-es fág ORF104 és DnaI kölcsönhatása
c kis molekulájú inhibítorok hatása
S. aureus fág genom
150 dsDNS bakteriofág vizsgálata:
Lítikus hatás
3 csoport <20 kbp (p68 fág C1)
~40 kbp (77-es fág B1/B2)
>100 kbp (G1 fág A1)
Funkcionális screenelés: 77-es fág
- Arzenit indukálható promóter
kontrollja alá helyezett fág ORF
- S. aureus ars operonjáról
- kis mennyiségű 77ORF104
termék esetén is gátlás
- citolitikus polipeptidek (holin,
amidáz)
- több fág esetében is
Dot screening
S. aureus DnaI

77ORF104 celluláris targetje
DNS replikáció iniciációja

77ORF104-DnaI kölcsönhatás:

DnaI azonosítása
affinitás-kromatográfiával
Far-western
analízis
Élesztő 2
hibrid analízis
DnaI esszenciális S. aureusban
RpLLReDnaI - genetikailag módosított törzs
Spac promóter
RN4220 - kontroll törzs
pMJ8426 plazmid - LacI-t konstitutívan expresszál
77ORF104 expresszió gátolja a
DNS szintézist
•
•
direkt és specifikus
interakció DnaI-vel
ORF67
RNS szintézist gátol
Antimikrobiális
szerek hatása DnaI-re
 125000 vegyület
tesztelése elérhető
könyvtárakból
 36 hatással volt a DnaI77ORF104
kölcsönhatásra
 11 igen hatásosan
gátolta a bakteriális
növekedést
Összefoglalás
 DnaI és DnaN
 Sok potenciális target a DNS
replikációs folyamatban
 Antimikrobiális hatású fág
ORF-ek azonosítása
 További, DnaI-hez hasonló
proteinek azonosítása
 Screening: fág ORF-fel
bakteriális target azonosítása
 Kis molekulájú inhibítorok
 További patogének vizsgálata:
- Streptococcus pneumoniae
- Pseudomonas aeruginosa
Köszönöm a figyelmet!