Transcript Az Enterococcusok, Staphylococcus aureus, Pseudomonas

Az Enterococcusok, Staphylococcus
aureus, Pseudomonas aeruginosa és
Clostridiumok, Listeria monocytogenes
és a Campylobacter jejuni kimutatása
4-5. gyakorlat
Enterococcus spp.
Streptococcaceae család,
Streptococcus nemzetség,
Lancefield D szerológiai csoport
–
–
–
Enterococcus faecalis
(var. liquefaciens, var. zymogenes)
Enterococcus faecium
Enterococcus durans
Általános jellemzők
Gram +
2-6 tagú láncok
0,5-1 μm
kissé megnyúltak
általában nem mozognak,
de ritkán előfordul
mozgó törzs is
Anaerob aerotoleráns
(tejsavas erjedés)
Általános jellemzők
Indikátor mikrobák (fekál kontamináció).
Termorezisztencia (pasztőrözési eljárások
hatékonyságát, lehet vele ellenőrizni)
A nem-spórások közül a legellenállóbbak
(nem megfelelő fertőtlenítés ellenőrzése),
Ételmérgezés (106)
α- vagy β-haemolysis véres agaron
„Sherman kritériumok”






Képesek fejlődni 10 – 45°C között
Túlélik a 60°C-os 30 perces hőkezelést
Fejlődnek 6,5%-os sókoncentráció mellett
pH 9,6
0,1 % metilénkéket tartalmazó tejben
40% epét tartalmazó véres agaron
jól fejlődnek
Szilárd táptalajok
Na-azidos agar
Na-azidos véres agar
(Packer-agar, defibrinált steril vér, vizeskristályibolya, vizes Na-azid)
TTC agar (trifenil-tetrazolium-klorid)
(Slanetz-Bartley agar)
A Na-azid gátolja a Gram-negatív flórát; az
Enterococcusok a TTC-t redukálják vörös
formazánná → telepek vörösesbarna színűek
Folyékony tápközegek
Na-azidos tápleves Raj-szerint (Na-azid,
brómtimolkék)
Litsky-Mallman- féle Na-azidot
tartalmazó dúsító táptalaj (Na-azid,
etilibolya)
Biokémiai azonosítás


Gram festés: +
Kataláz-próba: kataláz enzim
2 H2O2

2 H2O + O2
húsleves tenyészet + 3%-os H2O2
Hőtűrő-képesség vizsgálata:
húsleves tenyészet (37°C, 48 óra) →
60°C, 30 perc vízfürdő → alapos felrázás →
oltókacsnyi mennyiséget másik levesbe átoltani → 37°C,
48 órás inkubáció → ha zavaros és kataláz negatív → +
Enterococcusok kimutatása vízből
(201/2001.(X.25.)Korm.r.,65/2004.(IV.27.)FVM-ESZCSM-GKM )
Membránszűréses módszer:
100, vagy 250 ml víz szűrése 0,45 µm
pórusméretű membránon
Tenyésztés Slanetz-Bartley táptalajon, 37
oC, 48 óra
Enterococcus telepek vöröses-barna
színűek
S. aureus általános tulajdonságai







Gram +, fak. anaerob, 0,8-1μm, legkisebb
coccus, típusosan szőlőfürt elrendeződésű,
Nem mozog
Aranysárga pigmentet termel
Sótűrő: 7,5%-os sótartalmú talajon is
szaporodik
6-47°C is szaporodik
pH 4,3-8,0 között is szaporodik
20-45°C-on toxint termel
S. aureus általános tulajdonságai






Szaporodás aw>0,86
Toxintermelés aw>0,92
NO3 → NO2
Bontja: glükóz (aerob és anaerob), laktóz,
szacharóz, maltóz, mannit
Mannitot aerob és anaerob módon is bontja
(Differenciálás Micrococcustól, S.
epidermidis-től: ezek csak aerob viszonyok
között bontják a mannitot)
Haemolizál: α, β, γ, δ haemolysint termel
A S. aureus előfordulása





A leggyakoribb gennykeltő baktérium, nyálkahártyán
normális esetben is lehet. Az emberek és az állatok
az elsődleges hordozói. Jelen vannak az orrüregben
és a garatban, valamint egészséges egyéneknél a
hajon és a bőrfelületen is.
Nátha esetén számuk megnő, az élelmiszerek
könnyen kontaminálódhatnak.
Azért nem okoz túl nagy problémát, mivel borzasztó
táp- és vitaminigényes, rossz versengő mikroba.
Tésztagyártás→elszaporodik, jól tűri a beszárítást
Mastitis
A S. aureus előfordulása








Hús és hústermékek
Baromfi és tojás
Tojás-, tonhal-, csirke-, burgonya- és
tésztasaláta
Sütőipari termékek, krémmel töltött tészták
Krémes sütemények
Szendvicstöltelékek
Gomba
Tej és tejipari termékek
A S. aureus által kiváltott
ételmérgezés






Entero- és neurotoxikus hatású, tünetek 30 perc (!)
alatt kialakulnak.
Enterotoxin: A, B, C, D, E, F hőálló polypeptid
(diszulfid hidak), 121,1°C-on 20 perc alatt bomlik.
Nem minden törzs termel enterotoxint (kb. 50%)
Infektív dózis: <1.0 μg toxin az élelmiszerben
105/g szükséges, de a szám nem ad megfelelő
felvilágosítást
Az enterotoxin-termelés és koaguláz-pozitivitás
között nincs egyértelmű korreláció (is-is)
Táplevesek


Jelenléti/hiánypróba, MPN
Giolitti-Cantoni-féle
(Micrococcus szaporodása gátolt)
–
–
–
Mannit: elektív előny a S. aureusnak,
LiCl: Gram-neg.-t gátol,
Tellurit: Gram-poz.-t gátol, K-telluritot
redukálja→fém tellúr→fekete csapadék
Szilárd táptalajok
Baird-Parker-agar, 37°C, 24-48 óra
 Összetétel: ua. mint leves + tojássárgája emulzió
–
–
–

tellurit → fémes tellúr – fekete
feltisztulás: lecitináz
opálos zóna: lipolízis, proteolízis
Telep:
–
–
24 órás tenyészet: gombostűfej, koromfekete, sima szélű és
felületű, keskeny átlátszó széllel, feltisztult udvar
48 órás tenyészet: kölesnyi, feltisztult udvar 3-5 mm, ezen
belül 2 mm opálos zóna
Biokémiai azonosítás
1. Gram +
2. Koaguláz próba:
a.) Tárgylemez próba (tájékozódó vizsgálat!):
1 csepp víz
+ telep (vagy 1 csepp agy-szív inf. leves)
+1 csepp 37°C nyúlvérplazma →5 sec múlva csapadékképződés
b.) Kémcső próba: agy-szív levesbe: 37°C, 20-24h
↓
0,1 ml + 0,3 ml nyúl vagy emberi vérplazma
(ill. 0,9 ml teljes citrátos házinyúl vér)
↓
37°C, 2-4-6 óra
↓
Pozitív: alvadás ++,+++,++++
S. aureus: 99% pozitív; S. hyicus, S. delphi néha +
Negatív: nincs alvadás: S. epidermidis
Biokémiai azonosítás
3. Termostabil Dezoxi-ribonukleáz próba
S. aureusnak hőálló DNS-bontó enzimje van
DNS-agar (toluidin kék metakromásan fest)
Agy-szív leves → 15 perc forró vízfürdőbe → majd az agarba
vájt 15-20 μl űrtartalmú lyukakba mérünk a hőkezelt
tenyészetből → 37°C, 4 órás inkubáció után vizsgáljuk
lemezt:
+: lyuk körül 1 mm széles rózsaszínű gyűrű (kék → rózsaszín),
0,005 μg/ml esetén (nyomnyi) a reakció már pozitív+, magából a
hőkezelt élelmiszerből is ki lehet mutatni az enzimet, így 4-5
órán belül eredmény mutatható
Korreláció nem 100% az enterotoxin és temostabil DN-áz termelés
között!
Biokémiai azonosítás
4. Enterotoxin kimutatása élelmiszerből:
ELISA, RIA, de rutinszerűen sehol nem
ezeket végzik, ugyanis az enterotoxin
megoszlása egyenetlen, jól kötődhet az
élelmiszer egyes anyagaihoz, így nem
mindig lesz a próba pozitív, annak ellenére,
hogy ott van a toxin
Szabványos vizsgálat
Élelmiszerekből a szabvány nem a
Staphylococcus aureus, hanem a koaguláz
pozitív Staphylococcusok vizsgálatát írja elő.
Szabványos vizsgálat esetén a gyanús
telepekkel csak koaguláz próbát végzünk.
Pseudomonas aeruginosa
Gr-, aerob, 1 csilló, általában a mikrobatest végén,
150-féle szénforrást tud hasznosítani (nyálkás-nyúlós telep,
eltömi a fejőgépet)
Legtöbb törzs trimetil-amin termelő → hársfavirág-illat
Fluoreszcein → vízoldható (sárga), minden törzs termeli →
táptalajba diffundál → zöld lesz körülötte → idővel
oxidálódik,
megbarnul
→
rozsdaszínű
(latin:
aerugo=rozsda)
Piocianin → kloroformban oldódik (neutrális v. lúgos
közegben kék), nem minden törzs termeli (régi név:
Bacterium pyocyaneum)
Pseudomonas aeruginosa
glükózt oxidatív úton bontja
oxidáz +
kataláz +
nitrát→nitrogén-gázzá redukálja (!!)
karbamidot, acetamidot bontja
zselatint elfolyósítja
triptofánból indolt NEM termel
Pseudomonas aeruginosa




Előfordulás: talaj, víz, gennyes folyamatok („kékgennybetegség”)
fakultatív pathogén → állomány-szinten mastitis (1-2%) –
fejőrendszerben túlélhet
106/g felett ételmérgezést okoz
Ellenálló-képesség:
– beszáradást, hőt nem bírja
– antibiotikumoknak viszonylag ellenáll
– kvaterner ammónium-sókkal szemben
rezisztensek
– egyes amfoter vegyületekben még szaporodnak is
Pseudomonas aeruginosa
tenyésztése
Szilárd:
 Cetrimid-agar: gátlóanyag: N-cetyl-N,N,N-trimethylammonium bromide (cetrimid)
37 oC, 24-48 óra, (növekedés 42 oC-on is)
Véres agar: ß-haemolysis, büdös
 Z-agar: szintetikus (acetamid az egyetlen szénforrás)
Telepmorfológia: 2-4 mm, kerek-ovális, sima, domború, erősen
nyálkás, gyöngyház fényű, hársfavirág-illatú
Folyékony:
 Nitrofurantoinos leves: zavarosodás
 Z-leves

Pseudomonas aeruginosa
azonosítása







Oxidáz próba: pozitív
Nitrátredukció: komplett
Indol-próba: negatív
Kataláz-próba: pozitív
Piocianin-termelés: +kloroform → a kloroformos
fázis kék
Karbamid-bontás: karbamid → ammónia
(fenolvörös indikátor: sárga →lila)
Glükóz aerob oxidációja: szőlőcukros magasagar tetején, hártyaszerűen nő, itt sárga, máshol
piros marad
Szulfit-redukáló mezofil Clostridiumok
–
–
–
–
–
–
–
Gram-pozitiv, obligát anaerob, kataláz negativ, spórás
baktériumok
Hőmérsékleti optimum 37 oC
Peritrich csillóval mozognak
Tojás-, vagy gömb alakú spórát képeznek, amely centrálisan,
vagy terminálisan helyezkedik el. A spóra átmérője nagyobb,
mint a sejté.
Előfordulásuk talajban, vízben, emlősök bélcsatornájában
Szulfit tartalmú táptalajban fekete, vagy sötétszürke telepet
képeznek
Néhány közülük hemolizál (különböző típusú hemolizis)
Szulfit-redukáló mezofil Clostridiumok
A Cl. botulinum és a Cl. perfringens élelmiszer mérgezést
okoz, a többi romlást.
A vizsgálat menete:
–
–
–
Hígítási sor készítése
A félfolyékony, szulfit agart (Takács-Narayan) tartalmazó csövek
beoltása (minden hígításból 2 cső, egyik a vegetatív, másik a
spórás alakok kimutatására) a táptalaj vas(III)citrátot és Naszulfit-ot tartalmaz.
80 oC, 20 perc hőkezelés, a vegetatív sejtek elpusztítására és a
spórák aktiválására az egyik csőben
Szulfit-redukáló mezofil Clostridiumok
–
–
–
Tenyésztés 37 oC, 48 óra. A felszín alatt kb. 0,5 cmre látható feketedés jelzi a lehetséges pozitivitást.
Minden fekete, vagy sötétszürke csőből át kell oltani
tojássárga D-cikloszerin szulfit agarra.
A lemezeket anaerob körülmények között inkubáljuk
37 oC–on 24 órán át.
A pozitiv telepek feketék, vagy sötétszürkék, 1-2
mm átmérőjűek, néha opálos udvarral (lecitináz
aktivitás), vagy fénylő felszinnel (lipáz aktivitás)
Szulfit-redukáló mezofil Clostridiumok
megerősítése
1. Gram-festés: +,pálcák, 8-12 μm
2. Metilén-kék, tus festés
(háttér  fekete, Clostridium  kék, a tok  színtelen)
3. Kataláz teszt: negatív