Transcript 7AF

นางสาวดรุณร ัตน์ แก้วมูล
ึ ษา 51312305
รห ัสน ักศก
สถานทีท
่ างาน โรงพยาบาลศริ ริ าช
ภาควิชานิตเิ วช สาขาวิชานิตพ
ิ ษ
ิ วิทยา
ตาแหน่ง ผูป
้ ฏิบ ัติงานวิทยาศาสตร์การแพทย์
อาจารย์ทป
ี่ รึกษา
ั ศุภล ักษณ์นารี
อาจารย์ ดร. ศุภชย
Long-term stability of various drugs
and metabolites in urine, and
preventive measures against their
decomposition with special attention
to filtration sterilization.
ความคงต ัวระยะยาวและMetabolite
ของยาในปัสสาวะและมาตรการป้องก ัน
ไม่ให้ยาเกิดการสลายต ัวโดยเฉพาะด้วย
ื้
การกรองแบบปราศจากเชอ
Author
• Kei Zaitsu
• Akihiro Miki
• Munehiro Katagi
• Hitoshi Tsuchihashi
ปั ญหาในการตรวจวิเคราะห์ยาและสารเสพติดในสงิ่ สง่ ตรวจประเภท
ปั สสาวะ
ื่ มสภาพของปั สสาวะ
- การปนเปื้ อนแบคทีเรียและการเสอ
- วิธก
ี ารเก็บรักษาสภาพสงิ่ สง่ ตรวจประเภทปั สสาวะ
- การสลายตัวของยาและสารเสพติดในปั สสาวะ
การพัฒนาวิธก
ี ารเก็บสงิ่ สง่ ตรวจประเภทปั สสาวะเพือ
่ ตรวจวิเคราะห์
ยาและสารเสพติด
- Aseptic Collection Kit
- การเติม Sodium azide (สารกันบูด)
- อุณหภูม ิ
ความเป็นมา
ี หาย
ผูต
้ อ
้ งหา/ผูเ้ สย
ิ ธ์รอ
มีสท
้ งขอให้ม ี
การตรวจวิเคราะห์ซา้
การตรวจวิเคราะห์ซา้
ครงแรก
ั้
= ครงหล
ั้
ัง
ื่ ถือ
ผลการตรวจวิเคราะห์นา
่ เชอ
การตรวจวิเคราะห์ซา้
ครงแรก
ั้
= ครงหล
ั้
ัง
ื่ ถือ
ผลการตรวจวิเคราะห์ไม่นา
่ เชอ
Forensic Urine sample
Unknown
Drug / Concentration
Contaminate
More/Less
Infection/natural
Collect
Non aseptic
Transport
Expose to ambient
temperature
Expose to ambient temperature
Effect bacteria
ผลการตรวจ
ครงแรก
ั้
= ครงหล
ั้
ัง
การตรวจวิเคราะห์ซา้
ครงแรก
ั้
= ครงหล
ั้
ัง
ื่ ถือ
ผลการตรวจวิเคราะห์ไม่นา
่ เชอ
Critical
Cut off
1
1 ng / ml
2
Drug
•
•
•
•
•
•
•
Methamphetamine (MA)
Cocaine (COC)
Estazolam (EZ)
6-acetylmorphine (6AM)
7-aminoflunitrazepam (7AF)
Amphetamine (AP)
Nitrazepam (NZ)
Drug
MA
COC
EZ
detected in urine
unchanged forms
Drug
AP 6AM and 7AF
metabolites of grate forensic
proof of intake of their parent drugs
Drug
NZ
readily decomposed by bacteria
indicator of bacteria propagation
Drug
COC and 6AM
common ester-type drug
และ metabolite ทีจ
่ ะ hydrolyzed ได้
Shimadzu LCMS-QP2010 HPLC
quadrupole mass spectrometer
Experimental
เก็บปัสสาวะจากอาสาสมัคร 24 คน
ชาย =12 หญิง =12
(18 – 58 ปี )
ตรวจนับจานวน bacteria
Standard Methods of Analysis in
Health Scienc
Sample
ชาย 27 ปี
1900 cell
ปนเปื้ อนน้ อย
หญิง 29 ปี
10,000,000 cell
ปนเปื้ อนรุนแรง
Sample
ความเข้มข้น 500 ng/mL
Sample
กรอ
งNaN3
MA
AP
- NZ
- EZ
- 7AF
- COC
- 6AM
6 เดือน
0.5 wt%
กรอง+NaN3
ไม่ใส่
เฉพาะ EZ, NZ และ 7AFเก็บไว ้ในทีม
่ ด
ื
ื้
ชุดกรองปัสสาวะปราศจากเชอ
ิ ธิภาพชุดกรองปัสสาวะปราศจากเชอ
ื้
ทดสอบประสท
ปัสสาวะ 24 คน
กรองด ้วยชุดกรอง
LB (Luria-Bertani) media
ไม่พบ Bacteria
Sample
IS
10 ug/mL DBA
ปริมาณ 30 ul
ปัสสาวะ
600 ul
กรองผ่าน
membrane
0.45 um
Results
Selectivity
Table 1.doc
Fig 2
obtained by the automated on-line extraction LC–MS of seven drugs and
metabolites in urine at 500 ng/mL each
Stability of MA and AP
Fig. 3. Time-course changes in the concentrations of MA and AP in the severely
contaminated urine under various storage conditions ((●) with filtration, at 25 °C;
(♦) with NaN3, at 25 °C; (■) without any preservative measures, at 25 °C; (○) with
filtration, at 4 °C; () with NaN3, at 4 °C; (□) without any preservative measures, at 4 °C).
Stability of MA and AP
MA ลดลง 32 %
AM ลดลง 44 %
Fig. 3. Time-course changes in the concentrations of MA and AP in the severely
contaminated urine under various storage conditions ((●) with filtration, at 25 °C;
(♦) with NaN3, at 25 °C; (■) without any preservative measures, at 25 °C; (○) with
filtration, at 4 °C; ( ) with NaN3, at 4 °C; (□) without any preservative measures, at 4 °C)
ย ับยงการสลายต
ั้
ัวของMAและAM
aseptic collection kit
NaN3
ึ ษาเพิม
ศก
่
5 ราย
4 ราย ไม่มก
ี ารเปลีย
่ นแปลง
เก็บที่ 25 C/150 ว ัน
1 ราย
MA
AM
60 %
23 %
ย ับยงการสลายต
ั้
ัวของสาร
aseptic collection kit
NaN3
ทดสอบ MA เปลีย
่ นฟอร์มเป็น AM
ร่างกายร ับ MA เข้าไป
AM
Enzyme
ึ ษาเพิม
ศก
่
ความเข้มข้น
500 ng/mL
เก็บที่ 25˚C 30 ว ัน
LC-MS
No trace AM
Stability of MA and AP
การลดลงของ MA และ AM
เกิดจาก Bacteria ทาปฏิกริ ย
ิ า reductive
ก ับ Nitrogen biological
แยก carbon – carbon bonds
Amine
Stability of MA and AP
ี MA และ AM เป็นไปได้
ด ังนนการสู
ั้
ญเสย
ว่าเกิดจากการ Break carbon – carbon
bonds โดย Bacteria
ผลการวิจ ัย Clauwaert et al
3,4-methylenedioxy derivatives of MA and AP
Urine without preservative
room temperature
MA and AP
มีความคงต ัวอยูไ่ ด้ถงึ 21 weeks
Stability of NZ and EZ
Fig. 3. Time-course changes in the concentrations of NZ and EZ in the severely
contaminated urine under various storage conditions ((●) with filtration, at 25 °C;
(♦) with NaN3, at 25 °C; (■) without any preservative measures, at 25 °C; (○)
with filtration, at 4 °C; () with NaN3, at 4 °C; (□) without any preservative measures, at 4 °C).
Stability of NZ and EZ
-20˚C / 150 ว ัน /All
NZ and EZ ไม่เปลีย
่ นแปลง
ปนเปิ้ อนรุนแรง /25˚C / 14 ว ัน / no preserve
ปนเปิ้ อนเล็กน้อย/ 25˚C / 14 ว ัน / no preserve
ตรวจไม่พบ NZ
NZ ค่อยๆลดลงชา้ ๆ
ชา้ กว่า 5 เท่า
Stability of NZ and EZ
Oxygen-sensitive enzyme จาก Bacteria
จะทาปฏิกริ ย
ิ า reducing
ก ับ nitroaromatic compounds
amine
NZ เป็นสารพวก nitrobenzodiazepienes เปลีย
่ นรูปเป็น 7amino-metabolites โดย bacteria
( bacteria in the gastrointestinal tract reduction nitrobenzene )
Stability of NZ and EZ
detected 7- aminonitrazepam
in all the samples in
which losses of NZ were detected.
Stability of NZ and EZ
• Robertson and Drummer reported
NZ was stable up to 24 months when
samples were stored at 4 C
ป้องก ันการสลายต ัวของ NZ
aseptic collection kit
NaN3
Stability of 7AF
Fig. 5. Time-course changes in the concentration of 7AF in the severely contaminated urine under
various storage conditions (●) with filtration, at 25 °C; (♦) with NaN3, at 25 °C; ( ) with filtration and NaN3, at 25 °C;
(■) without any preservative measures, at 25 °C; (○) with filtration, at 4 °C; (♦ ) with NaN3, at 4 °C;
( ) with filtration and NaN3, at 4 °C; (□) without any preservative measures, at 4 °C).
Stability of 7AF
- 20˚C / 150 ว ัน /7AF ไม่เปลีย
่ นแปลง
ี 7AF เล็กน้อยเหมือนก ัน
ปนเปื้ อนรุนแรง/ ปนเปื้ อนเล็กน้อย / 150 ว ัน/ สูญเสย
ี 7AF เล็กน้อยเหมือนก ัน
กรอง / สูญเสย
ี 7AF ปานกลางเหมือนก ัน
NaN3 / สูญเสย
NaN3 + กรอง / ย ับย้งการสลายต ัวของ 7AF ได้ดท
ี ส
ี่ ด
ุ
ทดสอบ
การ Adsorption 7AF
บนผิวหน้าของ Vessel
ทดสอบ Adsorptions
7AF แต่ละความเข้ มข้ น
(250 – 2000 ng/mL)
A
B
C
D
กรองด ้วยชุดกรอง
เก็บไว ้ 30 วัน
ทดสอบการ Adsorption
7AF ลดลงในประมาณ
100 ng/mL ในทุก
ความเข้มข้นของสาร
แต่ละความเข้มข้น
(A B C D)
7AF ลดลง ไม่ขน
ึ้ อยู่
ก ับความเข้มข้นของ
สาร
7AF ลดลง เกิดจากการถูก
Adsorption ทีผ
่ วิ หน้าของ Vessel
Stability of 7AF
• ลดลงเองตามธรรมชาติ เพราะต ัวม ันเองไม่ stable
• Robertson and Drummer :
Normal blood /4, 22 and 37 C / sodium fluoride
ี 7AF 10% ในระยะเวลา 28 ว ัน
สูญเสย
bacteria-contaminated blood /22 C.
ี 7AF ประมาณ 10% ในระยะเวลา 2 ว ัน
สูญเสย
Normal blood /-20 C / sodium fluoride
7AF ลดลง
Stability of 7AF
ต่างก ัน Robertson and Drummer
Normal blood /-20 C / sodium fluoride
7AF ลดลง
ึ ษาไม่เหมือนกัน
ตัวอย่างทีศ
่ ก
เลือด กับ ปั สสาวะ จึงให ้ผลทีต
่ า่ งกัน
ป้องก ันการสลายต ัวของ 7AF
aseptic collection kit
NaN3
Stability of COC and 6AM
Fig. 7. Time-course changes in the concentration of COC and 6AM in the severely contaminated urine
under various storage conditions ((●) with filtration, at 25 °C; (♦) with NaN3, at 25 °C;
(■) without any preservative measures, at 25 °C; (○) with filtration, at 4 °C; ( ) with NaN3, at 4 °C;
(□) without any preservative measures, at 4 °C).
Stability of COC and 6AM
ปนเปื้ อนรุนแรง/ no preservative /- 20˚C / 150 วัน / 7AF ไม่เปลีย
่ น
ปนเปื้ อนรุนแรง/ no preservative / 4˚C/ 150 วัน/ COC และ 6AM ไม่เปลีย
่ น
ปนเปื้ อนรุนแรง/ no preservative / 25˚C/ 30 วัน/ COC และ 6AM หายไป
ปนเปื้ อนเล็กน ้อย/ no preservative / 25˚C/ 30 วัน/ COC และ 6AM หายไป
ปนเปื้ อนรุนแรง/ NaN3 / 25˚C/ 75 วัน/ ตรวจไม่พบ COC
ี ไป 75 %
ปนเปื้ อนรุนแรง/ NaN3 / 25˚C/ 75 วัน/ 6AM สูญเสย
Stability of COC and 6AM
• จากผลการทดลองพบว่า เมือ
่ กรอง
ให้ผลดีในการร ักษา COC และ 6AM
• แต่กล ับพบว่าเมือ
่ ใช ้ กรอง + NaN3
ี COC และ 6AM
กล ับให้ได้ผลไม่ด ี มีการสูญเสย
ี COC และ6AM
แสดงว่า NaN3 มีผลทาให้ สูญเสย
Stability of COC and 6AM
• COC and 6AM hydrolyzed เองหรือ/และ ด้วย enzymatically
เปลีย
่ น ฟอร์มเป็น benzoylecgonine methylecgonineและ
เปลีย
่ นเป็น morphine
• การเกิด hydrolysis จะเกิดขนในสภาวะที
ั้
เ่ ป็นด่าง
• อ ัตราการ hydrolysis ในปัสสาวะทีป
่ นเปื้ อนรุนแรงจะเร็วกว่าปัสสาวะที่
ปนเปื้ อนเล็กน้อยหลายเท่า
• เป็นไปได้สง
ู ทีว่ า
่ การเกิด hydrolysis ภายใต้สภาวะทีม
่ ี pH สูงทาให้
bacteria แพร่พ ันธุ ์
Stability of COC and 6AM
• NaN3 มีผลต่อการสลายต ัวของยาเนือ
่ งจาก
azide anion functions เป็น a strong
nucleophile จ ับก ับ carbonyl carbon และ
เป็นไปทาให้เกิด hydrolysis ของ ester bond
ในสภาวะเบสอ่อน
Stability of COC and 6AM
• Fuller and Anderson: 12 weeks /20 C/
0.1 wt% NaN3/ มีการลดลง 6AM
• ผลการทดสอบต่างมีความแตกกต่างก ันเป็นไปได้
ึ ษาต่างก ัน 90 ก ับ
เนือ
่ งจากระยะเวลาในการศก
150 ว ันและความเข้มข้น NaN3 ทีใ่ ชใ้ นการ
ทดสอบต่างก ัน 0.1 wt% ก ับ 0.5 wt%
,
Stability of 6AM
เพือ
่ ป้องก ันไม่ให้ปริมาณ 6AM สูญหาย
ชุดกรองเก็บปัสสาวะแทน NaN3
สรุปและวิจารณ์ผลการทดลอง
- การใช ้ Aseptic collection of urine
่ ตรวจประเภท
specimens ในการกรอง สงิ่ สง
้ มามี
ปัสสาวะทีค
่ ณะผูว้ จ
ิ ัยได้คด
ิ ค้นขึน
ิ ธิภาพในการลดการสลายต ัวยาในสงิ่ สง
่
ประสท
ตรวจประเภทปัสสาวะได้
- การใช ้ Aseptic collection of urine
specimens ในการกรองปัสสาวะเป็นวิธท
ี ล
ี่ ดการ
ปนเปื้ อนของแบคทีเรียทีด
่ ก
ี ว่าการใช ้ Sodium
azide เป็นสารก ันบูดในปัสสาวะ
ความคิดเห็นทีม
่ ต
ี อ
่ งานวิจ ัย
ี สเป็ น
• การเก็บตัวอย่างทีอ
่ ณ
ุ หภูม ิ -20 และ 4 องศาเซสเซย
อุณหภูมท
ิ เี่ หมาะสมทีส
่ ด
ุ ตามลาดับ
ี สจะต ้องมีการ
• ตัวอย่างมีข ้อจากัดต ้องอยูท
่ ี่ 25 องศาเซสเซย
กรองหรือและใช ้ NaN3 เพือ
่ ยับ
้ ยัง้ การสลายตัวของสาร
• งานวิจัยนีส
้ ามารถนาไปประกอบเป็ นข ้อมูลของคูม
่ อ
ื การสง่ ตรวจ
ทางนิตเิ วชได ้
่ ารผลิตชุดกรองทีม
• อาจจะพัฒนาไปสูก
่ ส
ี ารเคมีทเี่ หมาะสมในการ
ยับยัง้ การสลายตัวของยาโดยไม่รบกวนตัวยา
ึ ษาว่าควรใชภาชนะใดที
้
• ศก
ส
่ ามารถเก็บรักษาปั สสาวะ โดยทีส
่ าร
ไม่ถก
ู Adsorption โดยพืน
้ ผิวของภาชนะ
ึ ษาในความคงตัวของยาในตัวอย่างอืน
่ ผม เล็บ
• ศก
่ ๆ เชน