Transcript EGFR - Free

Evaluation Externe de la Qualité
pour améliorer le Diagnostic
Moléculaire des Tumeurs Solides
Cancer du poumon et du côlon
Réunion Biomarqueurs Grand Est
Strasbourg, 3 et 4 mai 2013
Dr Etienne Rouleau
Institut Curie, Paris - France
http://www.fotocommunity.de/pc/pc/cat/9479/display/30415918
Critères de performances
Critères de performance
Réponse clinique
• Objectif : identification des tumeurs sensibles au traitement
– Identification des cancers colorectaux KRAS sauvages
– Identification des cancers du poumon EGFR mutés
Taux de réponse
  

  
 

Anti-EGFR : 10%
DIAG

  
 
 
 
 
 
Taux de réponse
Anti-EGFR : 43% [28-57]
Anti-EGFR : <2%
F Di Fiore et al British Journal of
Cancer (2010) 103, 1765–1772.
Critères de performance
Réponse clinique
Dahabreh et al Ann Intern Med. 2011;154:37-49.
45 publications
Se 0.49 (CI, 0.43 to 0.55)
Sp 0.93 (CI, 0.87 to 0.97).
Critères de performance
Un unique test ?
Critères de performance
Linardou H et al The Lancet Oncology 9,2008 : 962-972
Ex2 bi-ds : 34,4% (87/253)
Se 0,47 [0,35-0,60]
Sp 0,87 [0,62-0,96]
AD : 37,6% (225/598)
Se 0,48 [0,42-0,54]
Sp 0,99 [0,89-1,00]
Critères de performance
Hétérogénéité des méthodes
(1) Taqman
(2) HRM
(3) Pyroséquençage
(4) SNAP Shot
(5) Séquençage direct
(1)
(2)
(5)
(4)
(3)
Di Fiore F et al. British Journal of Cancer (2007) 96, 1166 – 1169
Spathis A et al.
Anticancer Res. 2010
Jun;30(6):1969-75.
Critères de performance
Hétérogénéité des méthodes
Nomber of patients
KRAS+
KRASwt
NC
Sanger Sequencing
1913
37%
63%
5%
HRM/sequencing
3748
35%
65%
6%
Pyrosequencing
2457
37%
63%
4%
Allele specific (Taqman…)
5133
40%
60%
3%
Snap Shot
1926
42%
58%
10%
Other methods
1123
38%
62%
3%
Total
16 300
38%
62%
5%
Data 2009 INCA – on declaration - 946 patients without any technique information
KRAS+ : muted KRAS, KRASwt : wild-type KRAS, NC : non contributive
Critères de performance
Hétérogénéité des méthodes– KRAS
A)
Méthode(s) utilisée(s)
Taqman et apparenté
HRM/Séquençage
Pyroséquençage
Séquençage
SNaPshot/extension
HRM/Pyroséquençage
HRM/Taqman
HRM/Séquençage/Taqman
Taqman/Sanger
Total
Total
11
9
8
9
6
3
2
1
1
50
B)
C)
Sensibilité minimale
0-5
5-10
10-15
15-20
20-25
>30
Total
Nombre de méthodes
1
2
3
Total
Total
4
13
19
1
10
1
48
Total
33
16
1
50
Tables : A) Méthodes utilisées pour les analyses KRAS, B) Sensibilité globale
déclarée, C) Nombre de méthodes appliquées par analyse.
5 participants utilisent au moins un kit commercial
Therascreen KRAS Pyro (Qiagen - CE-IVD) / COBAS KRAS
Autres sociétés impliquées : 11 Life Tech, 6 Qiagen, 3 Roche
Critères de performance
Méthodes maisons – KRAS
-11-94
111+48
tggtggagtatttgatagtgtattaaccttatgtgtgacatgttctaatatagtcacattttcattattttta
ttataaggCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGtGGTAGTTGGAGC
TGGTGGCGTAgGCAAgAGTGcCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCA
TTTTGTGGACgAATATGATCCAACAATAGAGgtaaatcttgttttaatatgcatatt
actggtgcaggaccattctttgatacagataaaggtttctctgaccattttcatgagtacttattacaa
g
121 paires de bases homologues
Tableau : Distribution des amplicons en fonction des amorces déclarées dans le
cadre du STIC MOKAECM. En majuscule, région avec une forte homologie sur la
partie codante du gène KRAS.
Critères de performance
Hétérogénéité des méthodes– KRAS
Séquençage Sanger
Taqman
HRM/Sanger or Pyro
Pyrosequençage
SnapShot
Combinaisons
2009
MOKAECM
27%
16%
13%
13%
12%
20%
2012
EQA
18%
22%
24%
16%
12%
8%
Tableau : Evolution des techniques utilisées pour le génotypage KRAS en
France entre le STIC MOKAECM en 2009 et l’EEQ 2012.
Critères de performance
Hétérogénéité des méthodes – EGFR exon 21
A)
Exon 21
HRM/séquençage
Taqman
pyroséquençage
Séquençage
Snapshot/séquençage
Taqman/séquençage
digestion enzymatique
HRM/pyroséquençage
HRM/Taqman/séquençage
pyroséquençage/Taqman
SNaPshot/pyroséquençage
Taqman/Snapshot
Non renseigné
Total
Total
10
9
8
7
2
2
1
1
1
1
1
1
1
45
B)
C)
Sensibilité exon 21
0-5
5-10
10-15
15-20
20-25
25-30
Total
Nombre de méthodes (exon 21)
1
2
3
Total
Total
5
9
14
4
10
1
43
Total
26
18
1
45
Tables : A) Méthodes utilisées pour les analyses EGFR exon 21,
B) Sensibilité globale déclarée, C) Nombre de méthodes appliquées par analyse.
Critères de performance
Un laboratoire
= une technique
un protocole
Plusieurs laboratoires
= une technique
un protocole
Plusieurs laboratoires
= plusieurs techniques
plusieurs protocoles
Critères de performance
• Quelle est la performance réelle des analyses
moléculaires KRAS and EGFR au niveau national ?
• Plusieurs facteurs : techniques (AS/DS), protocoles /
SOP, organisation du laboratoire
• Critère principal : Réponse au traitement
GGT GGC
• Critères indirectes
3
4
3
5
3
8
– Statistique des mutations
- Sans biais de sélection : ERBB2, KRAS
- Avec un biais de sélection : EGFR
- Validation de méthode : limite de détection
- Contrôles internes de qualité
- Contrôles externes de qualité
(AS)
(DS)
Programme
KRAS & EGFR EQA
Organisation
Contexte
• Bonne pratique de laboratoire
• Preuve de la compétence
• Accréditation des laboratoires
• Nombreux tests « maisons »
• Suite de MOKAECM / ERMETIC
• Ne pas confondre EEQ et CQI
• EEQ et leurs recommandations
Recommandation ESP
ISO17043
Organisation
Programme participatif
Nijmegen
Leuven
Curie
AFAQAP
Joint partners
Partner Platforms
Reference Platforms
Organisation
Programme participatif
•
Plateformes partenaires
EGFR
–
Ile de France Ouest - Hôpital de FOCH (Dr DENOUX – Plateforme
HUVEGEN),
–
Centre Hospitalier Universitaire de Nancy (Pr VIGNAUD),
–
Paris - Hôpitaux Paul Brousse-Bicêtre-Antoine Béclère (Pr LEMOINE),
–
Lille – Centre Hospitalier Régional et Universitaire de Lille (Dr ZERIMECH),
–
Clermont – Centre Jean Perrin (Pr PENAULT-LLORCA),
–
Centre Hospitalier de Brest (Dr DOUCET),
–
Marseille – Assistance-Publique des Hôpitaux de Marseilles (Pr OUAFIK)
KRAS
–
Bordeaux - Institut Bergonier (Pr SOUBEYRAN),
–
Centre Hospitalier Universitaire de Nice (Dr PEDEUTOUR),
–
Centre Hospitalier de Brest (Dr DOUCET-Dr LE MARECHAL),
–
Paris - Hôpital Ambroise Paré (Pr EMILE),
–
Centre Hospitalier Régional et Universitaire de Lille (Dr ZERIMECH),
–
Centre Hospitalier Universitaire de Rouen (Pr SABOURIN), Lyon - Centre
Léon Bérard (Dr WANG)
•
Plateforme de référence : Nijmegen laboratory (H van Krieken, M
M.Ligtenberg)
Comité de pilotage
Plateformes partenaires
Envoi du statut moléculaire
des blocs sélectionnés
Envoi de 4 blocs sélectionnés et validés
Expert pathologique
AFAQAP
ANONYMISATION
Expert moléculaire
Expert qualité
Accord pour la mise en place
des lots de lames
Institut Curie
Réalisation de lots validés
Laboratoires participants
Nimègue (Nijmegen)
ANONYMISATION
Confrontation des résultats avec
le statut moléculaire initial
Retour des réponses
Louvain (Leuven)
Résultats individuels
Blocs (échantillons primaires)
Lames pour valider l’homogénéité
x1
x1
x1
Sélection des blocs
Coupes des lames
Préparation des lots
Envoi des lots
x48
x48
10x3 lames
x48
Organisation
Pourquoi 10 échantillons ?
Réception des lots
10x3 lames
Etape préanalytique
Relecture histologique
Lame HE
Scan des lames HE
Etape analytique
Réalisation de l’analyse
moléculaire
Extraction ADN
Résultats bruts
Image des résultats
Détermination moléculaire
Validation technique
Etape postanalytique
Réalisation du compte-rendu
Validation biologique
Compte-rendu
d’analyse
Interprétation des résultats
EGFRwt
EGFRm
14 jours
Macrodissection
Organisation
Matériel de référence
ADN
Extrait
ADN
Plasmides
Bloc
artificiel
Contrôle de tout le processus
Tout
Partiel
Partiel
Tout / partiel
= spécimen biologique
Identique
Partiel
Non
Proche
Prêt à l’emploi
Lames
Oui
Oui
Lames
Reproductible
A valider
A valider
Oui
Oui / à valider
Quantité disponible
Limitée
Limitée
Illimitée
Illimité
Stabilité dans le temps
Limitée
Limitée
Oui
Oui
Eventail de situation
Limité
Limité
Important
Important
Consentement / éthique
Oui
Oui
Non
Non
CEQ
CIQ
Calibrateur
Organisation
Périmètre et objectifs
HES
Analyse histologique
Sélection du matériel
Enrichissement
ADN
Bloc
Analyse moléculaire
3 lames 6µ
Choix technologique
Process analytique
Organisation
Participants
• Participation nationale
• 45 EGFR / 50 KRAS participants
– EGFR : 4
– KRAS : 9
– EGFR & KRAS : 41
• 450 EGFR et 500 KRAS cas (3 lames)
Résultats
GENOTYPE
Génotype
Bilan des erreurs
• 9 erreurs concernant 8 participants
• KRAS
– 4 erreurs
– 3 participants avec au moins 1 erreur (6%/50)
– 0 participant avec une erreur de génotype grave
• EGFR
– 5 erreurs
– 5 participants avec au moins 1 erreur (11%/45)
– 4 participants avec une erreur de génotype grave
Génotype
Bilan des erreurs
• 4 erreurs avec des conséquences thérapeutiques
– Un faux positif (1 EGFR « activating mutation ») : -2 points
– Deux faux négatifs (2 EGFR) : -2 points
– Un échec d’amplification (1 EGFR exon 21 mutation) : -2
points
• 5 erreurs sans conséquence thérapeutique
– Erreurs de mutation (2 KRAS – 1 EGFR) : -2 points
– Un échec pour un KRAS muté (1 KRAS muté) : -2 points
– Une erreur d’échantillon sur le rapport (1 KRAS muté ) : -1
point
Génotype
Sensibilité et spécificité nationale
KRAS
Sensibilité : 100% Spécificité : 100%
0% erreurs avec un impact thérapeutique
EGFR
Sensibilité : 98,7% Spécificité: 99,6%
0,89% erreurs avec un impact thérapeutique
KRAS
lot1
lot2
Total
EGFR
lot1
lot2
Total
16/20 18/20 19/20 20/20
1
24
1
1
23
1
1
1
47
18/20
2
3
5
20/20
21
19
40
% succès
96%
92%
94%
Total
25
25
50
% succès
91%
86%
89%
Total
23
22
45
Tables : Résultats globaux des EEQ KRAS et EGFR.
Génotype
Données de la littérature
• UK NEQAS EGFR
– Deans ZC, et al. J Clin Pathol 2013;66:319–325.
– 3 rounds 2010-2011: Erreurs : 24% - 6,7% - 6,4%
– 49 participants dernier round
• UK NEQAS GIST KIT/PDGFRA
– Wong et al. J Clin Pathol 2012;65:786–790.
– 13%, 33%, 19% et 4% (2008-2011)
– 8 à 16 participants
Génotype
Exactitude du génotype
•
Description de la délétion
– EGFR : délétion sans description (7 cases)
– EGFR : erreurs de génotype (13 cases)
•
Echantillon EGFR : B200
–
–
–
–
–
•
Mutation : c.2239_2248delinsC, p.Leu747_Ala750delinsPro
c.2240_2254del, p.Leu747_Thr751del
c.2238_2249delinsP, p.Leu747_Ala750delinsPro
c.2239_2247del ; p.Leu747_Glu749del
c.2236_2248delinsGAAC, p.Leu747_Ala750delinsPro
Echantillon EGFR : B484
– Mutation : c.2236_2250del, p.Glu746_Ala750del
– c.2235_2249del, p.Glu746_Ala750del
•
Echantillon EGFR : B009
– Mutation : c.2236_2250del, p.Glu746_Ala750del
– c.2240_2254del, p.Leu747_Thr751del
Génotype
Sur-interprétation ?
Echantillon EGFR B110
Non exclusion
4/23 soit 17% d’échec
Interprétation : échec ou sauvage
Laboratoire de référence : échec
Curie / Partenaire : sauvage
6
Nombre de participants
–
–
–
–
–
5
NC
4
3
2
1
0
30
40
45
50
55
60
65
70
75
80
90
100
Percentage of neoplastic cells B110 EGFR (NC : test failure)
Génotype
Sur-interprétation ?
Importance d’avoir des seuils d’interprétation

Résultats
DELAI DE RENDU
Délai de réponse
Approche analytique
• Le délai de réponse de chaque participant sera évalué
entre l’arrivée des échantillons au laboratoire et la
validation du rendu des résultats sur le site internet:
celui-ci étant idéalement de 10 jours (en référence aux
nécessités cliniques), l’analyse comparera le résultat du
laboratoire par rapport à l’ensemble des laboratoires
français.
• Délai : réception du colis – soumission sur le site
– EGFR - moyenne 16,6 jours
– KRAS - Moyenne 14,6 jours
Délai de réponse
Programme KRAS
12
10
32/50
Nombre de participants
8
6
4
2
0
4-7
8-9
10-11
12-13
14-15
16-17
18-19
20-21
22-23
24-25
26-27
28-29
Délai en jour
Figure : Délais de rendu en jour pour le programme EEQ KRAS
(classe 5).
Délai de réponse
Programme EGFR
12
10
27/45
Nombre de participants
8
6
4
2
0
8-9
10-11
12-13
14-15
16-17
18-19
20-21
22-23
26-27
28-29
Délai en jours
Figure : Délais de rendu en jour pour le programme EEQ EGFR (classe 5).
Délai de réponse
Corrélation KRAS et EGFR
30
Délai
EGFR
EGFR
Délai
25
20
15
10
5
0
0
10
20
30
40
Délai KRAS
Figure : comparaison des délais de rendu pour les
participants aux deux programmes EGFR et KRAS
Résultats
COMPTE-RENDU
Comptes-rendus
Approche analytique
• Les comptes rendus fournis par les participants
sont analysés systématiquement en vue de
formuler des recommandations d’amélioration ;
l’évaluation portera sur l’interprétation, les
données saisies et la présence de plusieurs
items selon les recommandations de l’INCa
• Grille des contrôles EQA Européens
• Anonymisation de tous les comptesrendus
• Double lecture de tous les rapports
Comptes-rendus
Interprétation
% des réponses correctes
KRAS
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
c.34G>T (p.Gly12Cys)
c.35G>A (p.Gly12Asp)
WT
Résultat du génotype
Information pour
l'interprétation
Interprétation du
résultat
Figure : Score des items correspondants à l’interprétation
(évaluation sur trois dossiers).
Comptes-rendus
Interprétation
EGFR
% des réponses correctes
100%
90%
80%
70%
WT
60%
c.2235_2249del
50%
c.2239_2248delinsC
40%
30%
20%
10%
0%
Résultat du génotype
Information pour l'interprétation
Interprétation du résultat
Figure : Score des items correspondants à l’interprétation
(évaluation sur trois dossiers).
Comptes-rendus
Score EQA ESP (/4.5)
Comptes-rendus
Score EQA ESP - KRAS (/4.5)
12
10
12/50
8
6
4
2
0
0,25
0,5
0,75
1
1,25
1,5
1,75
2
2,25
2,5
2,75
3
3,75
4,25
Figure : Score globale des items « interprétation EQA ESP » pour l’EEQ KRAS.
Comptes-rendus
Score EQA ESP - EGFR (/4.5)
10
9
8
9/45
7
6
5
4
3
2
1
0
0,25
0,5
0,75
1,5
1,75
2
2,25
3
3,75
Figure : Score globale des items « interprétation EQA ESP » pour l’EEQ EGFR.
Comptes-rendus
Points à améliorer
Moins de 50% de participants avec l’item
– Sous numéro d'échantillon : numéro de coupe
– Nombre de lames : 3
– Raison de la prescription : « mise sous
traitement »
– Limite de détection de la technique
– Pagination
– Date de prélèvement
– NM séquence de référence
Cellularité
Estimation de la cellularité
Cellularité KRAS
12A840
12A808
12A449
12A410
12A409
12A280
12A204
12A181
12A114
12A100
12A099
12A061
12A045
12A012
12A008
12A002
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Figure : Estimation de la cellularité en cellules néoplasiques pour l’EEQ EGFR 2013
(ligne verte : maximum, ligne rouge : minimum, ligne noire : moyenne)
Estimation de la cellularité
Cellularité EGFR
12B890
12B800
12B660
12B501
12B484
12B400
12B249
12B200
12B140
12B110
12B108
12B092
12B042
12B018
12B009
12B004
12B003
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Figure : Estimation de la cellularité en cellules néoplasiques pour l’EEQ EGFR 2012
(ligne verte : maximum, ligne rouge : minimum, ligne noire : moyenne)
Estimation de la cellularité
Facteurs de performance
Données statistiques
Lien entre activité et délais de rendu
25
20
15
Number of labs
Turnaround time
10
5
0
10-99
100-249
250-499
500-999
1000-2999
Nombre d’analyse KRAS par an
Données statistiques
Participation à des EEQ - KRAS
Participation à un autre EEQ
NON
OUI
Total
Total KRAS
23
27
50
Participation à un EEQ européen
non
ESP KRAS EQA
EMQN
CAP
EMQN/ECAT
UKNEQAS
ECAT
Total
Total KRAS
32
11
3
1
1
1
1
50
Participation à un EEQ régional
non
oui
Total
Total KRAS
39
11
50
Tables : Participation à un autre EEQ pour l’analyse KRAS
Impact sur le score du compte-rendu
EEQ en general pas d'impact 71%
EEQ régional
NS négatif oui 67,5% vs non 72,38%
EEQ Europeen NS meilleur oui 74% vs 70%
CQ EQA
NS meilleur oui 75% vs 70%
Données statistiques
Participation à des EEQ - EGFR
Participation à un autre EEQ
NON
OUI
Total
Total EGFR
24
21
45
Participation à un EEQ européen
Non
EQA/EMQN
UKNEQAS
Total
Total EGFR
38
6
1
45
Participation à un EEQ régional
Non
oui
Total
Total EGFR
30
15
45
Tables : Participation à un autre EEQ pour l’analyse EGFR
Impact sur le score du compte-rendu
EEQ en général NS plutôt négatif 72% non et 70,17% oui
EEQ régional
NS plutot neg 72% non et 69% oui
EEQ européen NS oui 73,5% vs 71,4% non
Données statistiques
Accréditation / certification
Accréditation Total KRAS
Non
40
Oui
5
Total
45
Accréditation
Non
Oui
Total
Total EGFR
35
5
40
3 participants avec l’analyse
dans la portée d’accréditation
2 participants avec l’analyse
dans la portée d’accréditation
Tables : Nombre de participants accrédités ou certifiés – portée d’accréditation
Conclusion
Conclusion
• Performance nationale
– KRAS 100%
– EGFR <100%
– Hétérogénéité des méthodes
• Spécificité du programme français
– Programme participatif national
– Matériel de référence : 3 validations
– Animation d’un réseau
• Facteur de performance
– Activité (pas sur le génotype)
– Participation à des EEQ
Conclusion
Performance n’est pas que l’EEQ
• Importance d’un travail commun d’amélioration et
d’homogénéisation des pratiques
• Nécessité d’une intégration européenne
• Nécessité d’un matériel qualifié
– Contrôle de qualité externe
– Contrôle de qualité interne
• Nécessité de recommandation d’interprétation
– Bases de données de mutations
– Mise en place d’un réseau d’essai fonctionnel
• Vers une approche multiparamétrique
IQC
BIOMARKER
TESTING
SOP
accreditation
EEQ
Conclusion
Approche multiparamétrique
Harris TJ, McCormick F. Nat Rev Clin Oncol. 2010 May;7(5):25165. Epub 2010 Mar 30.
Conclusion
Approche multiparamétrique
Melanoma
Mutations BRAF
Breast cancer
Amplification ERBB2
GIST
Mutations c-KIT
Mutations PDGFRα
Colorectal cancer
Mutations KRAS
Mutations BRAF
Thyroid cancer
Mutations KRAS
Mutations BRAF
Lung Cancer
Mutations EGFR
Amplification EGFR
Mutations KRAS
Translocation EML4-ALK
…
Conclusion
Approche multiparamétrique
A)
Réponses
44
B)
BRAF
MSI
PIK3CA
57%
25
36%
16
18%
8
Methylation du
promoteur de
MLH1
9%
4
DPYD/UGT
2%
1
ALK
MET
translocation amplification
KRAS
BRAF
HER2
PIK3CA
Réponses
91%
89%
52%
72%
2%
2%
46
42
41
24
33
1
1
C)
Réponses
51
EEQ
d'extraction
82%
42
Non
18%
9
Tableaux : Réponses au questionnaire d’inscription pour les paramètres à ajouter
à l’EEQ 2013. A) Cancer du colorectal, B) Cancer du poumon, C) EEQ d’extraction
Conclusion
Approche multiparamétrique
•
Fournisseur d’EEQ
– Identification du matériel
– Qualification du matériel
•
•
•
•
•
Vérification de la qualité et du génotype
Technique médiane
Validation externe
Validation NGS (PGM – AmpliSeq Côlon / Poumon)
EQA 2013
– 56 Participants : 46 EGFR – 50 KRAS
– Approche multiparamétrique
• KRAS, BRAF, MSI
• EGFR, KRAS
– Amélioration de la qualification
• 10 mutations validées
• 10 variants supplémentaires d’intérêt détectables
Merci pour attention !
Programme KRAS & EGFR
Institut Curie
Jean-François Emile
Catherine Noguès
Yves Denoux
Ivan Bièche
Plateforme NGS
Pierre Laurent-Puig & Hélène Blons
Catherine Andrieu
Thomas Rio Frio
Cédric Le Marechal & Laurent Doucet
Chloé Derouet
Virginie Bernard
Jean-Marc Guinebretière – Xavier Sastres
Frédéric Maraone
Quentin Leroy
Antoinette Lemoine
Audrey Margogne
Karen Leroy
L’houcine Ouafik
Departement of Pathology of the Radboud
University Nijmegen Medical Centre
Florence Pedeutour & Paul Hofman
Han van Krieken
Frederique Penault-Llorca
Marjolijn Ligtenberg
Jean-Christophe Sabourin
Isabelle Soubeyrans
Institut National du Cancer
Jean-Michel Vignaud
Etienne Lonchamps
Qing Wang
Frédérique Nowak
Fahrid Zemerich
AFAQAP
Jean-Pierre Bellocq
Caroline Egele
Dominique Fetique
Biomedical Quality Assurance Research unit of
the University of Leuven
Els Dequeker
Silke Sterck
Lien Tembuyser