Transcript betty-1-diagnostico

El diagnóstico de tuberculosis utilizando
técnicas de biología molecular
Beatriz López
Servicio Micobacterias
Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas
ANLIS “Carlos G. Malbran”
Estudia las macromoléculas (ADN, ARN, enzimas, hormonas)
Linus Carl Pauling (1930)
Watson y Crick (1953)
Frederic Sanger y Walter Gilbert (1977)
Kary Mullis (1986)
Aportes al manejo de las enfermedades infecciosas
Secuencias
especie-específicas
 Detección de un gérmen patógeno
Secuencias y elementos
móviles que generan
variabilidad
 Detección de aislamientos idénticos
Mutaciones
 Detección de resistencia a drogas
Genes
en la muestra o en cultivo
 Prevención
 Tratamiento
Cuales son aplicaciones útiles y factibles
para el manejo de la tuberculosis
Dependiendo del escenario donde se trabaja
Situación epidemiológica de tuberculosis
Población a investigar
Infraestructura (edilicia, bioseguridad)
Logística (transporte y telecomunicación)
Recursos (humanos y presupuesto)
Uruguay
2011
Prevalencia baja 21 /100000 hab
Actividades recomendadas
-Diagnóstico de situación
-Incorporación de métodos para
incrementar la confirmación del diagnóstico de tuberculosis
-Incorporación de métodos para el diagnóstico de TB latente
-Incorporación de métodos para optimizar la vigilancia
epidemiológica
2011
817 casos
94% casos pulmonares (57% B+)
13% HIV +
Examen microscópico
en el día
Diagnóstico de TBC
Sensibilidad limitada a
5000 a 10000 bacilos /ml
Cultivo
Evidencia sólo 10 a 100 BAAR
presentes en una muestra
Económicos
Lentos
caros
rápidos
Disminuir a la mitad el tiempo de detección del cultivo positivo
(7 a 30 días para líquidos y 15–60 días para sólidos)
Amplificación de ácidos nucleicos
1986
2000
Amplificación
1 ciclo
2
3 ciclos
último ciclo
Amplificación de ácidos nucleicos
2001
25
20
15
10
5
27
29
23
25
19
21
15
17
9
11
13
7
5
3
0
1
1986
Meta-análisis en muestras respiratorias
(125 estudios utilizando equipos comerciales)
El uso de diferentes puntos
de corte y de otras muestras
que no son esputo podrían
explicar la heterogeneidad
de resultados
Ling DI, et al PLoS ONE 3: e1536, 2008
Basados en estas
observaciones, el uso de
los métodos de
amplificación no pueden
reemplazar a los métodos
convencionales para el
diagnóstico de TBC
pulmonar
Valoración del método de amplificación de ácidos nucleicos en
una zona urbana de moderada prevalencia entre 2000 -2004
Tuberculosis
No
tuberculosis
positiva
1337
26
negativa
108
940
1445
966
molecular
Total
Sensibilidad: 92,5% (1337/1445)
Especificidad: 97,3% (940/966)
Laraque F.et al. Clin Infect Dis 49:46, 2009
Valoración del método de amplificación de ácidos nucleicos en
una zona urbana de moderada prevalencia entre 2000 -2004
Sensibilidad: 92,5% (1337/1445)
molecular
Total
Baciloscopia
positiva
Baciloscopia
negativa
positiva
1262
75
negativa
77
31
1339
106
Total
1445
94,3%
70,7%
(1262/1339)
(75/106)
Los resultados están en línea con la bibliografía y con las nuevas recomendaciones
del CDC y apoyan el uso de las pruebas de amplificación para un mejor manejo del
paciente
Laraque F.et al. Clin Infect Dis 49:46, 2009
Meta-análisis en muestras no respiratorias
Muestras de liquido cefalorraquídeo
(50 estudios)
n
Métodos
comerciales
14
Métodos
caseros
35
Sensibilidad
% (95% CI)
56 (46-66)
Especificidad
% (95% CI)
98(97-99)
No determinada
Pai M, et al. Lancet Infect Dis 3:633, 2003
Meta-análisis en muestras no respiratorias
Muestras de liquido pleural
(40 estudios)
n:1996 muestras
Pai M.,et al
BMC Infectious Diseases 4:6, 2004
Recomendaciones del uso de métodos de amplificación
CDC. MMWR 58(01);7-10 2009
Interpretar resultados de AAN correlacionando
con el resultado de la baciloscopia
Muestras respiratorias B+ AAN + se presume TBC
Muestras respiratorias BPacientes
• vírgenes de tratamiento
• con imagen de patología pulmonar
• para quienes no se ha decidido instaurar tratamiento anti-TBC
Si resulta positiva
en una muestra respiratoria con baciloscopia negativa,
el resultado debe ser confirmado con otra PCR
realizada otro día, con otra muestra del paciente,
para descartar contaminación de laboratorio
El resultado negativo no descarta tuberculosis
Los organismos de regulación
de países industrializados
aun no han aprobado
la aplicación de equipos diagnósticos
que amplifican ácidos nucleicos
para investigar tuberculosis extrapulmonar
Amplificación de ácidos nucleicos
1986
2001
2006
2009
LAMP (Loop-mediated isothermal amplification)
6 cebadores
FIT cebador interno de avance
BIP cebador interno reverso
F3 y B3 cebadores externos
FLP BLP cebadores de lazo
Bst polymerase fragment
Buffers de mezcla
dntps
63 ºC 60 minutos
calcein, manganese
chloride,Hydroxy naphthol blue
En papel de aluminio SYBR Green I (Invitrogen)
Centrifuga después de la reacción
Ming Hong, et al. World J Microbiol Biotechnol (2012) 28:523–531
http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/anim.html
Mitarai S, et al, 2011
CMT
SP,SC
LAMP test
Kit
Bst
67ªC
Real -Time
turbidimetry and
fluorencense
40 min
Geojith G, et al, 2011
MT,MB
SP
rimM
Bst
65ªC
SYBR Geen I
120 min
Khushboo J, et al, 2011
CMT
CSF
IS6110
Bst
63ªC
Real -Time
turbidimetry
60 min
Aixiao Bi, et al., 2012
MT,MB,MA,MM
SC
hspX
Bst
67ªC
Real -Time
turbidimetry
27 min
10 copies
Ming Hong, et al, 2012
MT,MB
SP,SC
Esat6/ mtp40
Bst
67ªC
Calein, MnCl2, hydroxy
naphthol blue,
SYBR Green I
45 min
25 copies
MT: M. tuberculosis; MB: M. bovis; MA: M. africanum; MM: M. microti; CMT:Complejo M tuberculosis, ; SP: sputum; SC: solid culture; CSF:
cerebrospinal fluid
Evaluación del equipo LAMP para el diagnóstico
de tuberculosis pulmonar
Prevalencia 5%
LAMP
Sensibilidad 84%
Especificidad 96%
molecular
Total
Tuberculosis
No tuberculosis
positivo
42
38
83
negativo
8
912
920
50
950
1000
Total
VPP : 42 / 83 *100 : 50%
VPN : 912 / 920 *100 : 99,1%
Evaluación del método LAMP para el diagnóstico
de meningitis tuberculosa
Khushboo J. Nagdev, et al. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, May 2011, p. 1861–1865
Ventajas
• Rápida amplificación de DNA utilizando condiciones isotérmicas
• No requiere equipamiento
• Simple, sencillo
• Alta sensibilidad en menor tiempo por el uso de cebadores de lazo
• Sistema cerrado que reduce el riesgo de contaminación por amplicones
pero….
Todavía debe ser mejorado el sistema para mejorar
la especificidad
Evaluado en otros escenarios
PCR en tiempo real integrado en un casette cerrado
Xpert MTB/RIF (Cepheid Sunnyvale, CA)
Cepheid Xpert MTB test
1-Licuefacción e
inactivación del esputo
2- Carga de
2 ml de muestra
en el cartucho
3- Introducciòn
del cartucho
dentro del aparato
4- Filtración
y lavado
automático
de la muestra
5- Lisis por
ultrasonido
y extracción
del DNA
6- Mezcla de DNA
con reactivos de
PCR desecados
7- PCR hemi-nested
con cuantificación
fluorescente
(PCR tiempo real)
PCR en tiempo real integrado en un casette cerrado
Xpert MTB/RIF (Cepheid Sunnyvale, CA)
http://www.jove.com/video/3547/diagnosing-pulmonary-tuberculosis-with-the-xpert-mtbrif-test
Único proceso manual
Muestra decontaminada
Con solución
NaOH- y isopropanol
15 minutos
Disminuye en 6-8 logs la viabilidad
Cámaras con soluciones y
reactivos liofilizados
siringe
Válvula rotatoria
y reactivos para
purificación de
ADN o ARN
Tubo de PCR
Émbolo
( jeringa)
Raja et al.: Clinical Testing. Clinical Chemistry 51, 5, 2005
Primer/Sonda
HOT Spot 81 pb
Secuencia
95% de cepas resistentes a R tienen mutaciones en esta región
rpoB F1 Primer
5'- cgtggaggcgatcacaccgcagac -3'
rpoB F2 Primer
5’- atcaacatccggccggtggtcgcc -3'
rpoB R Primer
5’- agC2tccagcccggcacgctcacgt -3'
rpoB Probe A
5'-CF36-CGAGCtcagctggctggtgcGCTCG-Q48-3'
rpoB Probe B
5'-CF4-TGTGgagccaattcatggaccagaGCACA-Q13-3'
rpoB Probe C
5'-CF5-CCGACGccgacagcgggttgttCGTCGG-Q8-3'
rpoB Probe D
5'-CF3-CCACGcttgtgggtcaaccccCGTGG-Q13-3'
rpoB Probe E
5'-Fluoresceine-ACGAGccgactgtcggcgcuggCTCGT-Q13-3'
B. globigii F Primer
5’- agcgcttgcggcaaacacggagaaa -3'
B. globigii R1 Primer 5’- gcgacaccggcgaatacagagatacc -3'
B. globigii R2 Primer 5’- gctccaccgaacaatccgatcttaccgccc -3’
B. globigii Probe
5’-CF1-GGCCGacagacaaggctccgtcatttgatCGGCC-Q8-3’
PCR semi-anidada
DROGAS DE PRIMERA LÍNEA
isoniacida
rifampicina
pirazinamida
La resistencia a estas drogas
define la multiresistencia
etambutol
estreptomicina
TRATAMIENTO
ESTANDARIZADO
DE TUBERCULOSIS
meses
2HRZ+E ó S 4HR
RESULTADO DEL TRATAMIENTO DE TUBERCULOSIS
Corea, Perú, Hong Kong, Ivanovo, República Dominicana, Italia
n=5526 casos nuevos
RIESGO RELATIVO (Mantel-Haenszel)
DE
MULTIRRESISTENCIA
OTRAS RESISTENCIAS
Cualquiera
Cualquiera que incluya R
A una droga
Rifampicina
Isoniacida
Estreptomicina
Etambutol
MORTALIDAD
FRACASO
3,7
15,4
1,0
0,7
3,3
5,5
0,5
1,5
1,3
2,1
5,5
2,2
2,3
0
Espinal MA et al. JAMA 283: 2537-45. 2000
Primer/Sonda
Secuencia
HOT Spot 81 pb
95% de cepas resistentes a R tienen mutaciones en esta región
rpoB F1 Primer
5'- cgtggaggcgatcacaccgcagac -3'
rpoB F2 Primer
5’- atcaacatccggccggtggtcgcc -3'
rpoB R Primer
5’- agC2tccagcccggcacgctcacgt -3'
rpoB Probe A
5'-CF36-CGAGCtcagctggctggtgcGCTCG-Q48-3'
rpoB Probe B
rpoB Probe C
rpoB Probe D
Bacilos
sin
mutacio
nes
5'-CF4-TGTGgagccaattcatggaccagaGCACA-Q13-3'
5'-CF5-CCGACGccgacagcgggttgttCGTCGG-Q8-3'
5'-CF3-CCACGcttgtgggtcaaccccCGTGG-Q13-3'
rpoB Probe E
5'-Fluoresceine-ACGAGccgactgtcggcgcuggCTCGT-Q13-3'
B. globigii F Primer
5’- agcgcttgcggcaaacacggagaaa -3'
B. globigii R1 Primer 5’- gcgacaccggcgaatacagagatacc -3'
B. globigii R2 Primer 5’- gctccaccgaacaatccgatcttaccgccc -3’
B. globigii Probe
5’-CF1-GGCCGacagacaaggctccgtcatttgatCGGCC-Q8-3’
PCR semi-anidada
2 horas
la hibridación emite señal fluorescente
captada y evidenciada automáticamente y en tiempo real
mediante un sensor y un software
que dibuja en una curva la señal cuantificada
mostrando el progreso de la reacción
M tuberculosis resistente a R
al menos una sonda de rpoB no hibrida
o si la hibridación entre la 1ª y última de las 5 sondas
tiene retraso
(hay mutaciones que impiden la hibridación, otras la retardan )
Sistema de PCR en tiempo real cerrado
Ventajas operativas
Primera vez que un test con mayor sensibilidad
que la baciloscopía
• puede ser aplicado y descentralizado con
mayor facilidad que el cultivo
genera riesgo biológico similar al generado por la baciloscopía
minimiza el tiempo de procesamiento
y el riesgo de contaminación cruzada de laboratorio
• no es necesario juntar muestras para
mejorar la operatividad o bajar costos
Emplea iguales principios que sistemas comerciales anteriores,
pero en un contenedor cerrado y con proceso automatizado
Evaluación del sistema Xpert /MTB Rif
para el diagnóstico de tuberculosis pulmonar en adultos
Sensibilidad
n
%
(IC 95%)
1770/1811
97,7
(97,1-98,4)
759/1041
72,9
(70,2-75,6)
10740/10823
99,2
BK+
BK-C+
Especificidad
(99,1-99,4)
13675
Helb D et al J Clin Microbiol. 2010 ; 48:229-37
Vietnan Uganda
Boehme CC et al N Engl J Med. 2010 9; 363:1005-15
Peu Azerbajan Sudafrica India
Marlowe EM et al . J Clin Microbiol. 2011 ; 49:1621-3
EEUU
Moure R et al. J Clin Microbiol 2011, 49:1137-9
España
Malbruny B et al. Int J Tuberc Lung Dis 2011, 15: 553-5
Francia
Bowles EC et al Int J Tuberc Lung Dis 2011, 15: 988-9
Friedrich SO et al J Clin Microbiol 2011, 49:2827-31
Holanda
Ionnidis P et al J Clin Microbiol 2011, 49: 3068-70
Scott LE et al PLoS Med, 2011, 8: e1001061
Grecia
Lawn SDE et al PLoS Med, 2011, 8: e1001067
Sudafrica
Sudafrica
Sudafrica
17 publicaciones,
17 países
1 muestra / paciente
Theron G et al Am J Respir Crit Care Med , 2011, 18:132–140 Sudafrica
Zeka A et al. J Clin Microbiol, 2011, 49: 4138-41
Turquìa
Sudafrica , Peru, India, Azerbaijan, Filipinas , Uganda
Boheme CC et al, Lancet 2011, 377: 1495-1505
Rachow A et al Plos One 2011, e 20458
Armand S et al J Clin Microbiol, 2012 49: 1772-76
Kim SY, et al Int. J Tuberc Lung Dis 2012 ,11:1471-6
Dorman SE, et al. PLoS ONE 2012 ,7:e 43307
Tanzania
Francia
Corea del Sur
Sudafrica
Evaluación del sistema GeneXpert
con muestras pulmonares
Investigando 2 y 3 muestras
la sensibilidad entre casos BK se incrementa a 85% y 90%
La especificidad no está afectada por la presencia
de micobacterias ambientales en las muestras
Evaluación del sistema Xpert MTB Rif
para el diagnóstico de tuberculosis extrapulmonar
Sensibilidad
Especificidad
n
%
(IC 95%)
285/390
73,1
(68,7-77,5)
1155/1171 98,6
(97,9-99,3)
1561
Hillemann D et al J Clin Microbiol. 2011 , 49:1202-5
Moure R et al. J Clin Microbiol 2011, 49:1137-9
Malbruny B et al. Int J Tuberc Lung Dis 2011, 15: 553-5
Ionnidis P et al J Clin Microbiol 2011, 49: 3068-70
Causse M et al J Clin Microbiol 2011, 49: 3065-7
Friedrich SO et al . J Clin Microbiol 2011 , 49:4341-2
Vadwai V et al J Clin Microbiol 2011, 49:2540-5
Armand S et al J Clin Microbiol, 2012 49: 1772-76
Evaluación del sistema Xpert /MTB Rif
para detectar la resistencia a rifampicina
n
%
(IC 95%)
Sensibilidad
513/535
95,9
(94,2-97,5)
Especificidad
2081/2120
98,2
(97,6-98,8)
2655
Helb D et al J Clin Microbiol. 2010 ; 48:229-37
Boehme CC et al N Engl J Med. 2010 9; 363:1005-15
Hillemann D et al J Clin Microbiol. 2011 , 49:1202-5
Marlowe EM et al . J Clin Microbiol. 2011, 49:1621-3
Moure R et al. J Clin Microbiol 2011, 49:1137-9
Bowles EC et al Int J Tuberc Lung Dis 2011, 15: 988-9
Ionnidis P et al J Clin Microbiol 2011, 49: 3068-70
Scott LE et al PLoS Med, 2011, 8: e1001061
Lawn SDE et al PLoS Med, 2011, 8: e1001067
Boheme CC et a l, Lancet 2011, 377: 1495-1505
Vadwai V et al J Clin Microbiol 2011, 49:2540-5
Xpert MTB/RIF plataforma multiple.
Otras aplicaciones
Xpert SA Nasal
Staphilococcus aureus meticilino resistente
Xpert EV
Enterovirus (meningitis)
Xpert C. difficile
Xpert vanA
Detection of Clostridium difficile
Enterococcus vancomicina resistente
Clostridium difficile
Flu A, Flu B, and 2009 H1N1
Marcadores oncológicos
Se espera prueba para HIV en diciembre 2013
Costo Xpert/MTB Rif
Para que sea viable y sostenible
se debe calcular no sólo el costo de los equipos y cartuchos
sino tambien de
 Fuentes suplementarias de energia (donde los cortes son frecuentes)
 Acondicionamiento de la temperatura (si es muy alta)
 La gestión de calidad
entrenamiento, validación en el país, evaluaciones externas periodicas
(no sustituible por la experiencia internacional
ni por la disponibilidad de controles internos)
 Manejo y mantenimiento de stock en buenas condiciones
 Calibracion y mantenimiento
 Desecho de grandes volumenes de insumos plásticos (cartuchos)
Recomendaciones de utilización del Xpert-MTB/Rif®
en condiciones de programa en Latinoamérica
http://new.paho.org/hq/dmdocuments/2011/Implantacion_Xpert-MTB-Rif_AMRO_Guatemala.pdf
Consenso Laboratorios Supranacionales, Centros Colaboradores de OMS
y Laboratorios de Referencia Nacional de países priorizados de las Américas
para la aplicación costo-efectiva del sistema GenXpert MTB/RIF
El sistema debería ser empleado como primera prueba
de diagnóstico en los siguientes dos grupos de pacientes
SR o caso con TB pulmonar con alto riesgo de TB-MDR
(todo previamente tratado, contactos de MDR, positivos al
2do mes y otros grupos de riesgo reconocidos por el país)
SR VIH positivos
Complementada con
baciloscopia y cultivo
La baciloscopia permite monitorear el tratamiento
rápida y económicamente
El cultivo sigue siendo necesario para
 confirmar el diagnóstico de 30% adicional
de casos BK detectar resistencia a R originada por mutaciones no
investigadas por los sistemas moleculares comerciales
y validar resultados dudosos
 investigar sensibilidad a otras drogas
de primera y segunda línea
Los métodos moleculares aplicados
al diagnóstico rápido de tuberculosis
no reemplazan a la baciloscopia
para detectar casos avanzados
en escenarios con alta prevalencia y
limitados recursos
porque son mas caros
no reemplazan al cultivo
para la detección de casos
poco avanzados o formas extrapulmonares
porque son menos sensibles
parecen ser muy precisos para
el diagnóstico de tuberculosis y
detección de resistencia a rifampicina
Muchas gracias