Transcript 血型血清学试验
血型血清学试验 红细胞抗原抗体实验技术 红细胞抗原 血型系统33 血型集合 血型系列： 低频率系列 高频率系列 红细胞抗体（1） 预期抗体：若已知红细胞ABO血型，按 Landsteiner s法则可预知的ABO血型抗体， 即抗A和抗B。 预期抗体也叫做规则抗体 意外抗体：抗A或抗B以外的抗体。在ABO 亚型中，变异的抗A1或某种抗B等抗体，也 称为意外抗体。 意外抗体过去也叫做不规则抗体 红细胞抗体（2） 天然抗体：没有可察觉的抗原刺激，而机体对抗 原免疫应答的产物。天然抗体多为IgM抗体，能与 含有相应抗原的红细胞结合，在盐水介质中出现 肉眼可见的凝集反应，所以也叫盐水抗体, IgM抗 体的最适反应温度为0-25℃。 免疫抗体：抗原刺激机体而产生的。免疫抗体多 为IgG抗体，在盐水介质中只能致敏含有相应抗原 的红细胞，但不产生凝集，需要采用抗球蛋白搭 桥、酶处理细胞或聚凝胺介导等方法，才能产生 凝集反应。 IgG抗体的最适反应温度为37℃。 红细胞抗原抗体体外反应形式 凝集反应 溶血反应 红细胞凝集反应的两个阶段 致敏阶段：抗原抗体特异性结合 非特异性聚集阶段：致敏红细胞间形成桥 连，形成凝集格局 影响第一阶段的因素 抗体亲和力常数 温度：IgM4-25℃ IgG37℃ PH：生理PH值范围 孵育时间 离子强度 抗原抗体比例 影响第二阶段的因素 细胞间的距离：IgM直接凝集红细胞 IgG致敏红细胞，不产生凝 集 阳性电荷分子：聚凝胺 酶的作用 IgM抗体检测 玻片法 纸片法 试管离心法 微量板法 微胶柱（卡式） IgG抗体检测 抗人球蛋白试验 酶试验 聚凝胺法 一抗人球蛋白试验（Coombs试验） 使用抗球蛋白在被球蛋白致敏的红细胞之间搭桥， 使之出现凝集，称为抗球蛋白试验（Coombs试 验）。 抗球蛋白试验的原理： 抗体分子和补体成分都是球蛋白。 用人球蛋白免疫动物使之产生抗体即抗人球蛋白。 抗球蛋白试剂会与结合在红细胞上或游离在血清 中的人球蛋白反应。 抗球蛋白试剂可凝集被人球蛋白致敏的红细胞。 抗人球蛋白试验（ Coombs试验） 直接抗人球蛋白试验（DAT） 检测红细胞是否在体内被抗体或补体致敏， 用于检测自身免疫溶血性贫血、药物引起 的溶血、新生儿溶血病、溶血性输血反应 间接抗人球蛋白试验（IAT） 在体外抗体致敏红细胞，用于抗体筛选和鉴 定、交叉配备、血型鉴定 间接抗人球蛋白试验（IAT） 经典IAT LISS-IAT:试管法 卡 PEG-IAT 酶-IAT 聚凝胺-IAT 经典IAT 程序：2滴血清、1滴2~5%的红细胞，37℃ 孵育45-60分钟，生理盐水洗涤3遍后倾倒上 清液，控干，加2滴抗人球蛋白试剂，离心 后判读结果。用抗体致敏的红细胞检测试 验结果的正确性。 LISS-IAT 原理：通过降低红细胞周围的离子氛，使 抗体易于接近抗原，促进抗原在更短的时 间内致敏红细胞，再使用抗人球蛋白试剂， 使被致敏的红细胞产生凝集。 程序：2滴血清、1滴2-5%的红细胞，加2-4 滴LISS液后混匀，37℃孵育15分钟，离心观 察细胞的凝集情况，用生理盐水洗涤3遍后 倾倒上清液，控干，加2滴抗人球蛋白试剂， 离心后判读结果。 PEG-IAT 原理：PEG是一种水溶性的中性多聚体， 当含有抗原与相应抗体的溶液中加入PEG 时，由于空间排斥效应作用，使溶液中的 抗体饱和度提高，加速溶液中的抗原-抗体 复合物的形成。 程序：2滴血清、1滴2-5%的红细胞，加4滴 PEG溶液后混匀，37℃孵育15分钟，生理盐 水洗涤3遍后倾倒上清夜，控干，加2滴抗人 球蛋白试剂，离心后判读结果。 微柱凝胶技术（卡） 原理：微管内有凝胶颗粒和试剂。凝胶颗 粒具有分子筛作用，离心后，不凝集的红 细胞通过全程进入微管底部，而凝集的红 细胞则悬浮停留在颗粒中。 程序：按厂家说明操作 二 酶试验 原理：蛋白水解酶可将红细胞表面的多肽链打断， 使多肽链带负电荷的唾液酸也一起离开红细胞表 面，减少了红细胞之间的排斥力，缩短了红细胞 之间的距离，容易产生凝集反应 程序：2滴血清、1滴2-5%红细胞，加入2滴酶， 37℃孵育15分钟，离心看结果。 注：酶会破坏一些抗原结构，如M、N、 Fya 、Fyb 等 三 聚凝胺试验 原理：聚凝胺是一种高价阳离子季胺盐多 聚物，溶解后能产生很多正电荷，可以中 和红细胞表面的负电荷，使红细胞之间距 离减小，能引起正常红细胞可逆性的非特 异性凝聚。如果是抗体致敏的红细胞，加 入中和液后，凝集不可逆；无抗体致敏的 红细胞，加入中和液后，凝集解散。 程序：按试剂盒说明书操作。 抗体筛选 抗体筛选的一般程序 接受标本 记录病史 标本处理 抗体筛选 抗体鉴定 1、血液标本 血清和血浆均可，血清更佳。 原因：血浆可形成小的纤维蛋白凝块，使认读结果困 难，用血浆不能检出通过补体激活才能反应的抗体，因为 抗凝剂如EDTA或枸橼酸盐能螯合钙并阻止补体激活。 溶血的标本不能使用，因为可能掩盖抗体引起的溶血 对输液的病人允许从输液管中抽血，但要用盐水冲洗管道， 并弃去最初抽取的5ML血液。 细胞最好洗涤 2、病史 详细询问病人的： 临床诊断 妊娠史 输血史 近期使用的药物 3、试剂 筛选细胞（市售2细胞或3细胞） 增强介质：LISS、PEG、LIP、酶、抗体筛 选卡等 抗人球蛋白试剂；抗-IgG、抗-IgG+C3d （1）筛选细胞 商品化的抗体筛选细胞是2-3人份O型试剂红细胞， 每一人份细胞单独在一试剂瓶中，不可混合，以 避免对弱抗原表达红细胞的稀释。 美国FDA要求商品试剂红细胞必须表达下列抗原： D、C、c、E、e、M、N、S，s，P1，Lea、Leb， K，k，Fya，Fyb， Jka 、Jkb，对Lua，V，Cw无要求。 实验时应用生理盐水洗涤试剂细胞，幷用生理盐水或LISS液配成细胞悬液 后使用（24小时内有效）。 过了效期的试剂细胞，即使不溶血或外观很好，也不要再用，因为某些抗 原已平丧失。 （2）抗球蛋白试剂 抗-IgG和含有抗-IgG和C3d的多特异性抗球蛋白试 剂都可用于抗体检测 多特异性抗球蛋白试剂可用于检测一些可以激活 补体的稀有抗体，Kidd血型系统的一些抗体只能 被多特异试剂检出，而抗-IgG不能检出；还有一 些抗体与多特异试剂可产生更强的反应。因此， 一些实验室工作人员更愿意用多特异性抗球蛋白 试剂 多特异性抗球蛋白试剂的缺点是可检出临床无意 义的抗体。 4、抗体筛选 患者血清或血浆+筛选细胞 患者血清或血浆+自身细胞 用试管法室温盐水离心检测IgM抗体 用抗人球法（试管法、卡）、聚凝胺法、 酶法检测IgG抗体 患者的血清或血浆与筛选细胞在不 同的介质中反应，若： 抗体筛选阴性，只能说明患者血清中没有 针对筛选细胞所有抗原的抗体，不能排除 有抗低频抗原抗体的可能 抗体筛选阳性，说明患者血清中有意外抗 体，可进一步进行抗体鉴定，以确定抗体 的特异性。 注：一定做自身对照，只有自身对照阴性， 抗体筛选的结果才有可比性。 血清反应类型 试剂细胞 自身细胞 + 0 + 0 + + 解释 同种抗体 自身抗体 自身抗体 自身抗体+同种抗体 自身对照阳性的解释 自身抗体 如果患者对近期输入的红细胞产生同种抗 体，其体内献血者的红细胞被抗体致敏， 使自身对照阳性，很容易误认为是自身抗 体。因此了解患者近期输血史和有无输血 反应十分重要 血清学结果的分析（1） 在分析抗体筛选结果时，应综合运用以下资料： 受检血清与每个筛选细胞的反应结果 受检血清与自身细胞的反应结果 检查比较不同反应相的结果，如盐水介质、抗人 球蛋白试验、酶试验等 是否溶血等 阳性反应的强度，有无剂量效应 对照筛选细胞表，通过阴性排除法可初步看 出可能有哪些抗体，再通过谱细胞做抗体鉴定， 来确定抗体的特异性 血清学结果的分析（2） 自身对照阴性 患者血清与筛选细胞室温盐水和抗人球蛋白试验均阴性， 说明抗体筛选阴性。 患者血清与筛选细胞室温盐水介质凝集，说明有IgM性质 的同种抗体。 患者血清与筛选细胞室温盐水介质不凝集，抗人球蛋白试 验阳性，说明有IgG性质的同种抗体。 患者血清与筛选细胞室温盐水介质凝集，用DTT或2-Me处 理血清后，抗人球蛋白试验阴性，说明只有IgM抗体，没 有IgG性质的同种抗体；抗人球蛋白试验阳性，说明既有 IgM抗体还有IgG性质的同种抗体。 血清学结果的分析（3） 自身对照阳性 1 患者血清与筛选细胞室温盐水和抗人球蛋白试验均阴性， 说明抗体筛选阴性。 2.患者血清与筛选细胞室温盐水介质凝集，说明有IgM性质 的自身抗体或/和同种抗体。 3.患者血清与筛选细胞室温盐水介质不凝集，抗人球蛋白 试验阳性，说明有IgG性质的自身抗体或/和同种抗体。 4.患者血清与筛选细胞室温盐水介质凝集，用DTT或2-Me 处理血清后，抗人球蛋白试验阴性，说明没有IgG性质的 自身抗体或/和同种抗体；抗人球蛋白试验阳性，说明还 有IgG性质的自身抗体或/和同种抗体。 冷自身抗体的吸收 采一份抗凝标本置37℃孵育，采另一份 不抗凝标本置4℃。将温育10min以上的抗凝 血样中的细胞用37℃盐水洗涤3次，平均分 置3个试管中，将待检血清加入其中一管混 匀，置4℃30-60min，使其充分吸收，若吸 收不完全，可在另2管重复吸收试验. 温自身抗体的吸收 将患者的红细胞用37℃盐水洗涤3次，取 1ml压积红细胞+1%木瓜酶1ml 37℃孵育 10min，红细胞用37℃盐水洗涤3次，将压积 红细胞分为2等份，1份+2ml待检血清37℃孵 育30min，离心，吸取上清加入另一份压积 红细胞管中重复吸收试验。 5 抗体鉴定 患者血清或血浆+谱细胞 患者血清或血浆+自身细胞 用试管法室温盐水离心检测IgM抗体 用抗人球法（试管、卡）、聚凝胺法检测 IgG抗体 对照谱细胞表用阴性排除法确定抗体的特 异性 血清学结果的分析 在分析反应结果，确定抗体特异性时，应综合运用 以下资料： 1.受检血清与每个谱细胞的反应结果 2.受检血清与自身红细胞的反应结果 3.受检血清与酶处理红细胞的反应结果 4.检查和比较各个反应相的结果，包括不同的温度、悬浮介质、酶和抗 球蛋白反应情况，一些抗体的特异性与反应相直接有关 5.有否溶血现象 6.阳性反应的强度，有无剂量效应 7.对自身红细胞上的抗原详细检查，从缺乏的抗原情况中，可提示存在 相应的抗体 8.抗体效价的滴定 异常血清反应 抗各种药物和添加剂的抗体可能引起阳性 反应 配置试剂红细胞使用的防腐剂的抗体可能 引起阳性反应 解决办法：使用前洗涤试剂细胞 交叉配血 交叉配血方法的选择 立即离心试管法 不使用增强介质的方法：IAT 使用增强介质的方法： -PEG-IAT -LISS-IAT -酶-IAT（基本不采用，除非有酶-IAT才能检出的 抗体） -凝聚胺（Rh系统） -凝胶卡式 立即离心交叉配血的重要性 立即离心法是抗人球方法无法替代的 立即离心技术可以用于： - 检测ABO不配合：血型鉴定错误、血袋上标签错误、 存在亚型抗体、骨髓移植产生的嵌合体。 - 存在緍钱现象 - 存在冷特异性抗体（如抗-Lea） - 存在冷自身抗体 预温技术和IAT技术会漏检弱的具有临床意义的冷抗体 （如抗-Lea、抗-A1、抗-E等） 我们在配血时，不能只选用IAT方法，必须同时选用立即 离心技术和IAT技术。 立即离心交叉配血阳性的处理 首先考虑ABO系统不配合：对患者和供者 的ABO血型再次鉴定。 ABO不配合的骨髓移植产生的嵌合现象， 或输注大量血浆带入大量外源性抗-A或抗-B 抗体 缗钱：采用盐水替代试验 自身冷抗体：预温试验 不同交叉配血方法的选择（1） 对于抗体筛选阳性，自身对照为阴性的样 本，为了提高反应强度，有助于弱抗体的 检出，可以采用PEG-IAT、LISS-IAT的、凝 胶卡的方法。 不同交叉配血方法的选择（2） 增强介质的使用 对于有临床意义的弱反应性特异性抗体， 如果不使用增强介质，就有可能丢失有临 床意义抗体的检出。 根据自身对照试验的结果，选择不同的增 强介质 灵敏度：凝胶卡＞PEG-IAT ＞LISS-IAT ＞ IAT 有临床意义抗体记录患者的配血 随时间推移，患者体内有临床意义的抗体会减弱 以至无法检测出来。 30-35%的抗体在鉴定为阳性的1年后检测转为阴性。 接近50%的抗体在10年后检测转为阴性。 抗原抗体的反应强度与所采用的检查技术有关。 对于有临床意义抗体记录患者的配血，仅仅交叉 配血相合是不够的，还必须保证相合的供者红细 胞上不含有与记录中有临床意义抗体相对应的抗 原。 预温技术（1） 预温技术：指将存放在各自独立试管中的血 清/血浆、红细胞及增强介质在水浴/孵育 箱中预先孵育并达到预定温度后（一般是 指37℃）才进行混合，然后按照试验技术的 要求孵育一定的时间，孵育完成后如果需 要洗涤红细胞，要用预温的生理盐水来洗 涤。 预温技术（2） 用途：用于排除冷反应性抗体对间接抗人 球蛋白试验的干扰，检测在37℃有增强反应 的抗体。 缺点：不论是否使用增强介质，预温技术 得到的阴性反应来排除抗体的存在具有风 险，因为预温技术会降低许多具有潜在临 床意义的弱反应性、新生成的、低亲和力 的同种抗体反应强度，甚至漏检。 预温技术（3） 预温技术中，洗涤红细胞的生理盐水温度 不宜超过37℃，较高温度（如45 ℃）的生理 盐水洗涤红细胞会导致特异性结合的抗原 抗体复合体解离。 洗涤过程中，每次离心结束后应立即弃上 清液，减少红细胞和预温盐水一起混合的 时间。 预温技术（4） 预温技术的使用条件 必须确认存在冷自身抗体：IS盐水法具有反 应活性、自身对照阳性、患者不具有特异 性冷抗体等。 患者不存在近期输血情况：因如果近期有 输血史，则最初形成的可能是IgM抗体，预 温技术会漏检此IgM抗体。 对于已经确定具有临床意义的IgM抗体（如 抗- Lea）不能使用预温技术。 WAIHA患者的输血（1） 原则建议不要输血，因为对于WAIHA患者： 患者机体对于贫血已经具有耐受性，除非病人的 生命处在危险中，血色素明显快速下降，已经危 及到患者生命安全，否则不要输血。 很难找到完全相配合的血液： WAIHA患者输血要比常规的输血治疗更加危险， 由于很难找到和患者相配合的血液（即缺乏自身 抗体相对应抗原的血液）；因此输入的血液和自 身血液一样都是不配合的，且输入的红细胞在体 内存活期短于自身细胞。 WAIHA患者的输血（2） 3、输血引起患者同种免疫，容易产生同种抗 体，给以后输血造成困难。 4、输血有可能导致溶血病情加重： （1）由于自身抗体的存在，很难排除是否存 在同种抗体，输血可能导致输血反应 （2）输血会促进自身抗体的生成，加快溶血 速度，且输入的红细胞干扰血清学检测。 WAIHA患者的输血（3） （3）输血会抑制患者自身的代偿性造血机能， 反而加重病情。 （4）对于WAIHA患者，溶血也是线性的，即 体内红细胞越多，溶血的就越多，因此输 血增加了患者的血容量，同时造成更多输 入的红细胞溶血，产生的血红蛋白造成患 者脏器如肾脏负担加重。 WAIHA患者的输血（4） 血色素超过8g/L的慢性WAIHA患者很少需要输血， 很多5g/L甚至更低的患者也不必输血治疗。 当患者必须输血来挽救生命时，需要输血治疗， 以提供足够的携氧能力，如： —患者血色素快速下降，数值很低且血压过低 —血色素快速下降引起的严重贫血 —患者严重贫血并伴发心肺疾病 —患者出现缺氧的症状 输注量：以维持足够携氧能力的最少量的红细胞， 且在输注过程中密切观察患者情况。 WAIHA患者的输血（5） WAIHA患者必须输血时 自身吸收确认：只有自身抗体或同时存在 同种抗体 只有自身抗体，采用IAT法选择反应最弱的 血输用 同时存在同种抗体，选择没有相应抗原的 血输用 药物抗体（1） 服用或注射某些药物后，可以在体内产生抗 体，产生的抗体可以与药物本身反应，也 可以与固有的红细胞抗原反应，从而引起 DAT阳性，红细胞破坏、粒细胞和血小板 减少等现象。 药物抗体（2） 药物引起的免疫溶贫的作用机制 半抗原型：如青霉素，进入体内与红细胞结合成完全抗原， 刺激机体产生抗体。 免疫复合型：非那西丁、氨基比林、奎尼丁、磺胺类等药 物作为半抗原进入体内后，与血浆蛋白结合成为完全抗原， 引起针对相应半抗原决定簇的抗体产生。 自身免疫病型：甲基多巴可造成红细胞变性，激发机体免 疫应答，产生的抗体能作用于红细胞。 非免疫蛋白吸附型：先锋霉素等药物可牢固结合在红细胞 上且损伤RBC，使血浆蛋白非特异性的吸附到RBC表面， 引起DAT阳性，一般不产生溶血。 输血前血型血清学检测 输血前血型血清学检测 血型鉴定：检查受血者和供血者的ABO和 Rh血型. 抗体筛选和鉴定:检查受血者血清中的不规 则抗体，抗体的特异性及性质. 交叉配血: 检查受血者和献血者血液的配合 性. AABB要求输血前检测必须做到 明确无误的确定受血者和受血者标本的一致性 受血者ABO和RH血型定型试验 受血者血清或血浆的血型抗体检测试验 将本次受血者标本检测结果与其以前检测结果记 录做比较 对献血者血液的检测：血型、输血传染病 选择与受血者ABO和Rh血型相容的血液 交叉配血 在待输血液的血袋上明确标记受血者的姓名、性 别等鉴别信息 输血前检查的一般程序 血液标本的采集及准备 血清学试验 交叉配血 已配合血液的标记及发放 一血液标本的采集及准备 1 输血申请单 申请单上必须具备肯定病人身份的资料，必须含有病人姓名及病 人特有的身份号（住院号、床号）及负责医师的签名。此外，还应该 包含申请日期、用血的原因及时间、用血的种类及数量。病人的出生 年月日、性别、种族、疾病诊断、输血史、妊娠史、有无不规则抗体 及血型。以上资料有助于解决可能出现的血型血清学问题 。 2 受血者血液标本的采集 在采集病人血液标本前必须认真核对输血申请单和病人资 料，在确认准确无误后，才能进行血液标本的采集。 血液标本必须收集到有正确标记的带塞子的试管里，并且 在标本管上标明病人姓名、住院号、采集日期及采集者 血液标本应该是不抗凝血，以避免纤维蛋白、抗凝剂成分 对血清学试验的干扰。溶血的血液标本及混入静脉输注液 体而导致标本稀释的血液标本不得使用。 必须使用输血前三天以内采集的血液标本。 每次输血后，病人的血液标本必须在4℃至少保存7天，以 备用于重复试验。 3 献血员血样 从血袋上附着的血样小辫获得献血员血液 标本。 在标本收集管上粘贴血袋上有关血液制品 的条形号码。 准确核对血袋上的条形码及标本管上的条 形码，保证正确无误。 二 血清学试验 受血者试验 （一）血型鉴定 1.ABO血型鉴定（正、反定型） 2.Rh（D）血型鉴定（IgM抗-D） 受血者试验 （二）抗体筛选和鉴定 对受血者的血清或血浆进行抗体筛查是 非常必要的，有临床意义的抗体会导致溶 血性输血反应，破坏输入的不配合的红细 胞或缩短其寿命 必须对有输血史、妊娠史或短期内需要 接受多次输血的受血者及交叉配血不合者 进行抗体筛选试验。 （二）抗体筛选和鉴定 在病人血清不规则抗体检查为阳性时，且时 间允许的情况下，在交叉配血之前，应该 可以进行简单的抗体鉴定试验，确定抗体 的特异性，会有助于选择无对应抗原的相 合血。 供血者检测 ABO血型 Rh血型 三 交叉配血 交叉配血有两个重要作用： 确认供血者及受血者的ABO血型的相合 性 可检测出受血者血清中不规则抗体，此 抗体可能在抗体筛选试验中由于筛选试剂 红细胞缺乏相应抗原而漏检。 主侧交叉及次侧交叉配血试验 主侧交叉：病人血清+供血者红细胞 （输洗涤红细胞只配主侧）。 次侧交叉：病人红细胞+供者血清 （由于我国还未对供血者进行抗体筛选， 因此输全血次侧交叉是非常必要的）。 自身对照：病人自身血清+病人自身红细 胞。自身对照有助于分析解释交叉配血试 验中出现的阳性结果。 四 已配合血液的标记及发放 配血合格后，由医护人员到输血科（血库） 取血。取血与发血的双方必须共同查对病 人姓名、性别、疾病诊断、病案号、ABO 及Rh血型；血液有效期、血制品名称、数 量和外观、供血者编号；交叉配血试验结 果、试验人员姓名等；确保准确无误时， 经双方共同签字后方可发出。 谢谢