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Métodos Rápidos de Análisis de Leche mediante
Instrumentos Infrarrojos
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Teoría NIR
MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000
2 - 17
Descubrimiento de
NIR por William
Herschel en abril de
1800
Ref. J. Near Infrared Spectrosc. 8, 75-86. 2000.
MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000
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¿ Por qué Infrarrojo Cercano ?

Poca o ninguna preparación de
muestra.
 No destructivo
 No se utilizan reactivos
 Operación simple
 Rápido
 menos de un minuto para parámetros múltiples


MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000
Confiable
Preciso
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Espectroscopía Infrarroja

El espectro Infrarrojo Cercano (NIR) se encuentra
justo sobre la región visible del espectro
electromagnético
 800 to 2500 m
50,000 cm-1
Ray-X
12,500 cm-1
UV
200nm
Incrementa Frecuencia
Visible
380nm
4,000 cm-1
MIR
NIR
800nm
2500nm
Incrementa Longitud de Onda
• Frequencia = 1 / longitud de onda
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400 cm-1
25,000nm
FIR,
Microondas
Efectos de la Energía Electromágnética en las
Moléculas

Microondas
Rotación de moléculas

IR
Vibraciones Moleculares
Fundamentales

NIR
Sobretonos y combinaciones de IR

UV / Visible Transiciones electrónicas, energía de
los electrones llevada a un estado de
excitación

X-Ray
Transiciones a nivel del núcleo del
átomo
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Vibraciones Moleculares

Cuando la Energía Electromagnética encuentra una substancia, la
misma será absorbida o transmitida dependiendo de su frecuencia y la
estructrura molecular de la substancia.
 Las moléculas vibran naturalmente.
 Estiramiento
Estiramiento Simétrico
 Flexión
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Estiramiento asimétrico
Vibraciones Moleculares
Cuando existe una coincidencia entre la

frecuencia de la energía excitante y la frecuencia
de vibración natural de la molécula, entonces
esta molécula absorbe esta energía.
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Vibraciones Moleculares
Coincidencia entre la
vibración natural y la
vibración de la energía
exitante.
La energía es absorbida,
se incrementa la amplitud
de vibración de la molécula
= un pico de absorbancia
No hay coincidencia
No hay absorbancia
No hay pico
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Ejemplo de Absorbancia
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Absorbancia Molecular
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Ley de Lambert Beer
T=
b
P0
Solución absorbente
de concentración ”c”
A = -log10T = log
P0
P
A=abc
P0
Absorbancia
P
P
Concentración
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Bandas de Absorción
Las bandas de absorción observadas en
la región del Infrarrojo Cercano (NIR),
provienen principalmente de vibraciones
de moléculas con enlaces de átomos de
hidrógeno.
- CH
Grasa
- OH
Humedad
H
H-C-O-C-R
O
Proteína
O
H-C-O-C-R
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O
Proteína
N-CH-C
CH3
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Grasa
H-C-O-C-R
H
- NH
O
Absorción Molecular
H2C OH
H2C OH
O
HO
H
H
OH
H
H
O
H
H
OH
O
OH
H
OH
H
H
H
Alcoholes
C
O
9.5  m
OH
Lactosa
COOH
H
=
R
Aminoácido
Proteína
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=
C
=
H2N
R2
O
O
H
HC C N CH C N CH C N
H
R1
O
H
R3
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Amidos
N -H
6.5 
m
Absorción Molecular
Grasa A
=
O
H
H H
C C C C C
H2C
O
CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH
+
HC
O
CH3(CH2)14COOH
H
CH2-OH
H2C
CH3CH2CH2COOH
3.5 
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H
m
O
Grasa B
Glicerol
C
H
O
H
H H
C C C C C
H
Ácido butírico
Grasa B
H
R2
=
Ácido palmítico
CH-OH
H
O
H
H H
C C C C C
R1
=
Ácido oleico
CH2-OH
H
H
Grasa A
C=O
5.7  m
H
H
R3
Tecnología IR
Descomposición de la luz
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Transmitancia / Reflectancia
Fuente de
energía
Detector
Detector
Fuente de
energía
ITEC168A
ITEC169A
Transmitancia (NIT)
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Reflectancia (NIR)
Transflectancia
Detector
Reflector
Fuente de
Energía
Detector
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Espectro completo Infrarojo de la leche
2
1.8
0.8
Carb.
0
200
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400
19 - 17
Fat B
0.4
Fat A
P
Urea
Ci
0.6
0.2
Homog.
1
P ref
Carb. ref
1.2
Fat B ref
Fat A ref
1.4
TS
Absorbance
1.6
600
800
Pin number
1000
1200
Monocromador
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Interferómetro
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Instrumento de filtros
Sistema Óptico
Rueda de
filtros
Sensor
Infrarojo
Fuente
Infraroja
Cubeta
Espejo
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MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000
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MilkoScan S50B Sistema de Flujo
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MilkoScan Tecnología IR
Fuente IR
Filtro óptico
Cubeta
Detector
Procesador
Los enlaces moleculares absorben energía en longitudes de onda específicas.
En este caso, tenemos 4 filtros IR que proveen esas longitudes de onda específicas
 3.5  (Grasa B),correspondiente a vibraciones en el enlace C-H de las moléculas de GRASA
 6.5 , correspondiente a las vibraciones en los enlaces péptidos en las moléculas de PROTEINA
 9.5 , correspondiente a vibraciones en los enlaces hidroxilos en las moléculas de lactosa
 Longitud de onda de refencia, donde no hay absorbancia de ningún componente
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Linearidad - Cubeta
T0 =
Ts=
E
Absorbancia
A = log
Pagua
Pleche
A=abc
Er
P
Concentración
A = log
Pr
T0
Función lineal
Ts
CH = -S ln
E . Pr
Er P
-O
+ I
1-O
S = Pendiente Ch = Datos de la longitud de onda
I = Ordenada
O = Desplazamiento
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Datos cubeta

Material:
 Fluoruro de Calcio
 Zafiro

Paso óptico
 30 a 50 micrones

Para analizar más de 100 muestras por hora, normalmente se precisa un
acumulador (o hacer más ancho el paso óptico) para evitar
deformaciones momentáneas de los cristales por la presión de la bomba
 Los vidrios no se montan paralelos para que la reflectancia de la cubeta
sea igual a la de la leche y evitar errores de medición
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Homogeneizador

El concepto es que los glóbulos grasos tengan todos el mismo tamaño para no
interferir en la medición.
 Normalmente se busca que el diámetro del glóbulo graso no sea mayor a 1/3 de la
longitud de onda mínima que se utiliza en la medición (en la práctica para leche:
1 micrón)
 La presión normalmente utilizada para esto es 200 bares, aprox. 205 kg / cm2
 Se hace siempre a 40°C
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Datos fuente y detector IR


Fuente IR: trabaja a una temperatura de 1150 °K
Detector IR: termocupla
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Factores que afectan la medición




Temperatura: debe ser estable +/- 0,10°C
Aire libre en la muestra: mantener la presión estable en la cubeta
Humedad en la caja infraroja
Vibraciones (especialmente en los equipos FTIR)
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Tecnología FTIR
Descomposición de la luz
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Espectro completo vs. Instrumentos de filtros
2
1.8
0.8
Carb.
0
200
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400
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Fat B
0.4
Fat A
P
Urea
Ci
0.6
0.2
Homog.
1
P ref
Carb. ref
1.2
Fat B ref
Fat A ref
1.4
TS
Absorbance
1.6
600
800
Pin number
1000
1200
Monocromador
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Red holográfica

Líneas finas producidas
con un Laser (400/mm)
separan la luz blanca en
todas las longitudes de
onda que la componen.
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Interferómetro
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35 - 17
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36 - 17
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MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000
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MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000
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Algunas diferencias de parámetros entre Filtros y FTIR
“Filtros”
“FTIR
Longitudes de Onda
Tradicionales (2 por
parámetro
normalmente)
Todas las necesarias
(normalmente 30)
Parameters
Grasa(a)
Grasa(b)
Proteína
Lactosa
Grasa(a)
Grasa(b)
Proteína
Lactosa
Urea
Sólidos totales (medidos)
Caseína
Acetona
Descenso Crioscópico
Azúcares específicos
Calcio
Acidez
Ácido láctico
etc
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Configuración Maestro y Esclavo
Laboratorio central
Maestro
Fábrica A
Esclavo 1
Fábrica C
Esclavo 2
Fábrica B
Fábrica D
Esclavo 3
Esclavo 4
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41 - 17
2
Estandarización: Instrumento Maestro
1.8
1.6
Absorbance
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
200
400
600
800
Pin number
MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000
42 - 17
1000
1200
Estandarización: Instrumento Esclavo
2
1.8
1.6
Absorbance
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
200
400
600
800
Pin number
MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000
43 - 17
1000
1200
2
Maestro y Esclavo no coinciden
1.8
1.6
Absorbance
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
200
400
600
800
Pin number
MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000
44 - 17
1000
1200
2
Haciendo coincidir las longitudes de onda
1.8
1.6
Absorbance
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
200
400
600
800
Pin number
MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000
45 - 17
1000
1200
2
Haciendo coincidir las longitudes de onda
1.8
1.6
Absorbance
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
200
400
600
800
Pin number
MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000
46 - 17
1000
1200
2
Coincidencia de longitudes de onda
1.8
1.6
Absorbance
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
200
400
600
800
Pin number
MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000
47 - 17
1000
1200
2
Haciendo coincidir las absorbancias
1.8
1.6
Absorbance
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
200
400
600
800
Pin number
MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000
48 - 17
1000
1200
2
Haciendo coincidir las absorbancias
1.8
1.6
Absorbance
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
200
400
600
800
Pin number
MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000
49 - 17
1000
1200
Coincidencia Perfecta
2
1.8
1.6
Absorbance
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
200
400
600
800
Pin number
MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000
50 - 17
1000
1200
Principio de Calibración
Calibración Básica
Calibración in situ
Viene de fábrica, no se modifica
normalmente
Responsabilidad del cliente
“Tradicional”:
Linearización - Intercorrecc - Ganancia
IR
“MLR”:
Linearización - MLR matrix - Ganancia
PLS:
(“Modelo PLS” - Const & Coef. B
Conductividad
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Pendiente y Ordenada
(Slope & Bias)
Calibración Básica
Calibración básica realizada en fábrica
H2C OH
H
O
H
OH
H
O
H
H H
C C C C C
=
HO
FAT A
O
H
HC
H
O
FAT B
H
H
H
R3
OH
Lactosa
CX = S (F1 Chlac + F2Chpro + F3Chgra) +
B
52 - 17
=
MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000
=
Ch = Datos del canal X
CX = Concentración del componente X
S = Pendiente
B = Ordenada al origen
R2
O
HC C N CH C
H
R1
O
Proteína
Ejemplo de Calibración de
Pendiente y Ordenada
MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000
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Parámetros Derivados
Calibraciones
Pend. y Ordenada
Grasa (a)
S/I
Grasa (a)
Grasa(b)
S/I
Grasa(b)
Proteína
S/I
Proteína
Lactosa
S/I
Lactosa
IR
+
+
+
+
MilkoScan 4000 -CombiFoss 5000
54 - 17
Sólidos
Derivados (2)
Derivados (1)
Calibraciones
Básicas
Grasa A/B
S/I
Sólidos
S/I
Grasa A/B