实验六 酶促反应中的竞争性抑制  《食品生物化学实验 》课程 一、实验目的 1、掌握琥珀酸脱氢酶的提取方法 2、学习离心机和高速组织捣碎机的使用 3、观察竞争性抑制剂和底物浓度对酶促反应速率的影响  二、实验原理 琥珀酸脱氢酶是催化琥珀酸脱氢变为延胡索酸,脱下的 氢转移到受氢体FAD。如果在有甲烯蓝存在的情况下,还原态 的FADH2会迅速地把氢原子传递给甲烯蓝,从而引起非常明显 的颜色变化反应,接受氢原子的甲烯蓝变为无色。酶的活性 越高,甲烯蓝脱色的时间就越短。因此甲烯蓝脱色的快慢, 可用来表示酶活性的高低。当结构上与琥珀酸极为相似的丙 二酸存在时,琥珀酸脱氢酶活性受到抑制。 由于还原的甲烯蓝容易被空气中的氧氧化而重现蓝色, 所以本实验用石蜡油封闭反应液,制造无氧的环境。 三、实验步骤 1、琥珀酸脱氢酶的提取 取新鲜猪心一个(100g),切碎,加 100ml的1/15 mol•L-1 Na2HPO4,放入组织捣碎机 中捣烂成浆。然后在高速离心机上用12000 rpm离 心15min,0-4℃ ,取上清液即为琥珀酸脱氢酶提 取液。(各组共用) 2、竞争性抑制观察 取四支指形管,按下表依次加入各种液体 (CK指形管中的酶液要事先煮沸10min),在指形 管中加入酶液后,迅速加入甲烯蓝溶液并摇匀, 立即加入石蜡油封闭液体(加入石蜡油封闭液体 后千万不可震动),以隔绝空气。于室温下静止 观察变色情况。 管号  CK  1%琥珀酸(滴)  5%琥珀酸(滴)  1%丙二酸(滴)  水  (滴)  酶液  (滴)  8煮沸  根据酶活力情况调整  10min  (20 )  (20 )  (20 )  滴数  (20 )  甲烯蓝 (滴)  石蜡油 (滴)
实验六 酶促反应中的竞争性抑制 《食品生物化学实验 》课程 一、实验目的 1、掌握琥珀酸脱氢酶的提取方法 2、学习离心机和高速组织捣碎机的使用 3、观察竞争性抑制剂和底物浓度对酶促反应速率的影响 二、实验原理 琥珀酸脱氢酶是催化琥珀酸脱氢变为延胡索酸,脱下的 氢转移到受氢体FAD。如果在有甲烯蓝存在的情况下,还原态 的FADH2会迅速地把氢原子传递给甲烯蓝,从而引起非常明显 的颜色变化反应,接受氢原子的甲烯蓝变为无色。酶的活性 越高,甲烯蓝脱色的时间就越短。因此甲烯蓝脱色的快慢, 可用来表示酶活性的高低。当结构上与琥珀酸极为相似的丙 二酸存在时,琥珀酸脱氢酶活性受到抑制。 由于还原的甲烯蓝容易被空气中的氧氧化而重现蓝色, 所以本实验用石蜡油封闭反应液,制造无氧的环境。 三、实验步骤 1、琥珀酸脱氢酶的提取 取新鲜猪心一个(100g),切碎,加 100ml的1/15 mol•L-1 Na2HPO4,放入组织捣碎机 中捣烂成浆。然后在高速离心机上用12000 rpm离 心15min,0-4℃ ,取上清液即为琥珀酸脱氢酶提 取液。(各组共用) 2、竞争性抑制观察 取四支指形管,按下表依次加入各种液体 (CK指形管中的酶液要事先煮沸10min),在指形 管中加入酶液后,迅速加入甲烯蓝溶液并摇匀, 立即加入石蜡油封闭液体(加入石蜡油封闭液体 后千万不可震动),以隔绝空气。于室温下静止 观察变色情况。 管号 CK 1%琥珀酸(滴) 5%琥珀酸(滴) 1%丙二酸(滴) 水 (滴) 酶液 (滴) 8煮沸 根据酶活力情况调整 10min (20 ) (20 ) (20 ) 滴数 (20 ) 甲烯蓝 (滴) 石蜡油 (滴)