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Hanna Lorig Betreuerin: Julia Schulz (Fraunhofer IBMT) Einführung Grundlagen Kryokonservierung Der Einfriervorgang Kryoprotektiva: „Frostschutzmittel“ Kryobanken: Lagerung der Zellen Kryokonservierung von hESC Embryonale, adulte und induzierte Stammzellen Fallbeispiele Probleme Ausblick Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 28.01.2011 2 Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 28.01.2011 3 Embryonale Stammzellen (ESC) [1] Besitzen mindestens zwei Eigenschaften: 1. 2. self renewal durch asymmetrische Zellteilung Pluripotenz Fähigkeit, sich in alle Zellen der drei Keimblätter zu differenzieren (Ecto-, Endo- und Mesoderm) Entdeckung murine ESC (1981), humane ESC (1998), Induzierte pluripotente Stammzellen (IPS) (2006/07)[2] Gewinnung aus der inneren Zellmasse von Blastozysten Regulierung der Forschung in Deutschland über das Embryonenschutzgesetz Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 28.01.2011 4 Adulte Stammzellen im Allgemeinen geringeres Selbsterneuerungsvermögen eingeschränktes Differenzierungspotential (Multipotenz) Während der gesamten Lebensdauer zu finden, v.a. in Organen wie Knochenmark, Haut, Leber, Nabelschnur(blut), etc. IPS – Induzierte pluripotente Stammzellen Adulte Stammzellen, die durch Reprogrammierung in pluripotente Stammzellen umgewandelt wurden bis dato ist die absolute Übereinstimmung mit ESC nicht eindeutig bestimmt Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 28.01.2011 5 Abb. 1: Überblick IPS/ Differenzierung [15] 28.01.2011 6 Gewinnung aus der inneren Zellmasse der Blastozyste › Zerstörung der Trophoblasten durch Laserstrahl/Antikörper Kultivierung [3]: › Feederzellen Monolayer (inaktivierte murine embryonale Fibroblasten) › Koloniewachstum -> 3D Struktur Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 28.01.2011 7 Grundlagenforschung der molekularen Mechanismen (z.B. Differenzierung) Klinische Forschung › Zell- und Gewebeersatz › Immunsystemaufbau (HIV) Krankheits- und Patientenspezifische Behandlung Zellmodell für toxikologische/ pharmakologische Untersuchungen Lagerung und Bereitstellung von hESC Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 28.01.2011 8 Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 28.01.2011 9 Verfahren für das Lagern (Einfrieren) von Zellen in lN2 Der Einfrierprozess Langsames vs. schnelles Einfrieren Zellschäden durch extra- und intrazelluläre Eisbildung Kryoprotektiva als Frostschutz (im)permeable Substanzen [16] Lagerung der Zellen in Kryobanken Vorschriften, Handling und Qualitätskontrolle Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 28.01.2011 10 Zwei Einfriergeschwindigkeiten: 1. Langsam (Kristallisation) Wässrige Lösung gefriert unter Phasentrennung, wobei es zur Aufkonzentration der gelösten Stoffe kommt (Gefrierkonzentration) Eutektisches Verhalten 2. Schnell (Vitrifikation) a. Extrem schnelle Abkühlung, die zur sog. Glasbildung führt z.B. direkter Kontakt mit lN2 Übersättigte Lösung b. unkontrolliertes Einfrieren Abb. 3: kristalline Mannitstruktur (links), amorphe Saccharosestruktur (rechts) [3] Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 28.01.2011 11 Verhalten von Zellsuspensionen bei kristallinem Eis dendritisches Wachstum der extrazellulären Wasserphase der Lösung Schädigungen der Zellen v.a. durch extrazelluläre Effekte [14] Extrazelluläre Schäden Zelldeformationen aufgrund der Zelldichte in interdentritischen Kanälen Mechanisch bedingte Schäden aufgrund von Zellschrumpfen Osmotisch bedingte Schäden (solutions effects) Membranporenbildung Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 28.01.2011 12 Zelleffekte bei Vitrifikation Schnelles Abkühlen führt zu intrazellulärer Eisbildung (flash out Effekt) Schädigungen der Zellen durch intrazelluläre Eisbildung aufgrund von ice seeding durch Membranporen Zwei-Faktor-Hypothese (Mazur et al.) [6]: Abb. 4: Schema der 2-Faktor Hypthese von Mazur Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 28.01.2011 13 Stoffe, die positive Effekte auf die Überlebensrate während des Einfrieren ausüben Verbreiterung des optimalen Kühlratenbereichs Permeable Stoffe Impermeable Stoffe Kolligative Effekte Nicht-kolligative Effekte Reduktion der Elektrolytkonzentration während des Einfrierens Umstrukturierung der Wassermoleküle Verringerung der solution effects Stabilisierung der Membranen und Proteine -> intrazelluläre Eisvermeidung Toxisch in hohen Konzentrationen und bei RT Im Allgemeinen geringere Wirkung DMSO, Glycerin, Methanol Trehalose, Hydroxyethylstärke Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 28.01.2011 14 Internationaler Forschungsfortschritt bedingt die Registrierung, Lagerung und Verwaltung von biologischem Material (UK Stem Cell Bank, HUES, …) Ziel: metabolisch inaktiver Zustand, der Langzeitstabilität garantiert Verschiedene Möglichkeiten der Konservierung [7]: Material Lagerung Lagerzeit versch. Bakterien, Hefen, Pilze Gefriertrocknung 5 – 35 Jahre Pflanzensamen lN2 > 10 Jahre Stammzellen lN2 15 Jahre Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 28.01.2011 15 Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 28.01.2011 16 mechanische Dissoziation in Klumpen von 50-200 Zellen › Enzymatisches Ablösen der Zellen (hESC zusammen mit Feederzellen) 10 – 20 Zellklumpen pro Kryosubstrat Auswahl der geeigneten Abkühlrate Resuspension der Zellen in geeignetem Kryomedium [18] Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 28.01.2011 [17] 17 Kontrolliertes Einfrieren 1. Probe wird mithilfe eines Einfrierautomaten kontrolliert eingefroren › › › 2. Kühlrate variierbar Schrittweises Abkühlen möglich Reproduzierbare Protokolle Unkontrolliertes Einfrieren Probe wird direkt in Gefrierschrank/ lN2 überführt Vitrifikation Probe wird direkt in LN2 gefroren Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 28.01.2011 18 Controlled-rate freezing of hESC [8] Kryomedium: Kryosubstrat: Kontrolle: 90% Kulturmedium + 10 % DMSO 0,25 ml Cassou Straw I) ohne Kryokonservierung (Probe A) II) unkontrolliertes Einfrieren bei -80 °C (Probe B) Schritt Probe Prozedur Zeit [min] 1 alle Äquilibrierung der Zellen in Kryomedium 15 2 alle Einfrieren bei -10 °C 1 3 D–F Ice seeding 5 4 C+D Abkühlen auf -33 °C 1 °C / min 4 E Abkühlen auf -33 °C 1,8 °C/ min 4 F Abkühlen auf -33 °C 2,7 °C /min 5 C-F Überführung in lN2 6 C-F Auftauen bei Raumtemperatur (RT) > 5 min 19 Vitalität Probe Einfrierrate Vitailität Kontrolle (A) - 100 % Kontrolle (B) direkt bei -80 °C 1 % ± 0,6 C 1 ° C / min 3,0 % ± 2,0 D (seeding) 1 °C / min 79 % ± 15 E (seeding) 1,8 °C / min 65 % ± 20 F (seeding) 2,7 °C / min 20 % ± 10 Kontrolliertes Einfrieren mit Ice seeding optimal Höhere Einfrierraten wirken sich negativ auf die Vitalität aus Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 28.01.2011 20 Improved cryopreservation of hESC with trehalose [4] Kryomedium: 90% Knockout serum replacement + 10 % DMSO + 0,2 mol/ l Trehalose Kryosubstrat: 0,5 ml Kryovial Kühlrate: 1 °C / min auf – 80 °C, nach 12 h in lN2 Kontrolle: 90% Knockout serum replacement + 10 % DMSO Probe Kryomedium Auftaumedium Kontrolle (A) - - B mit Trehalose - C - mit Trehalose D mit Trehalose mit Trehalose 21 Differenzierungsstatus: Probe Undifferenzierte Kolonien [%] Passage 28 Undifferenzierte Kolonien [%] Passage 38 A 16 13 B 41 35 C 43 44 D 51 45 n = 75 Kolonien Jüngere Passagen erholen sich besser nach der Kryokonservierung Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 28.01.2011 22 Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 28.01.2011 23 hESC besitzen großes Potential als Forschungsobjekt: › › › regenerative Medizin Grundlagenforschung in der Embryonalentwicklung Individuelles Testsystem für Pharmazeutika Forschung nach besseren Kryoprotektiva ist weiterhin von großer Bedeutung Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 28.01.2011 24 Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 28.01.2011 25 [1]: [2]: [3]: [4]: [5]: [6]: [7]: [8]: [13]: [14]: [15]: [16]: [17]: [18]: Human embryonic stem cells, Pera M.F., Reubinoff B., Trounson A., J. Cell. Sci., 2007, 113: 5-10 Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors, Takahashi K. et al., Cell, 2007 Nov 30, 131 (5): 834-5 Embryonic Stem Cell Lines Derives from Human Blastocysts, J.A. Thomson et al., Science, 1998, 282: 1145 Improved cryopreservation of human embryonic stem cells with trehalose, Chun F. Wu et al., Reproductive BioMedicine Online, 2005, 11, 6:733 - 739 The Banking and Cryopreservation of Human Embryonic Stem Cells, Charles J. Hunt, Transfusion medicine Hemotherapy, 2007, 34: 293-304, A two-factor hypthesis of freezing injury: Evidence from Chinese hamster tissue-culture cells, Mazur et al., Experimental Cell Research,1971, 71:345-355 Biobanking, John G. Day, Glyn N. Stacey, Mol. Biotechnol., 2008, 40:202 - 213 Controlled-rate freezing of human ES cells, Carol B. Ware, Angelique M. Nelson, Anthony Blau, BioTechniques, 2005, 38:879 - 883 Ein Mikro-Waageverfahren zur kontinuierlichen Bestimmung der Sublimationsgeschwindigkeit während der Gefriertrocknung, Dissertation Claudia Roth, Universität Erlangen-Nürnberg, 2000 http://www2.chemie.uni-erlangen.de/services/dissonline/data/dissertation/ Claudia_Roth/html/ Dissertation-Roth.html Cryosurgery, Boris Rubinsky, Annual review of Biomedical Engineering, 2000, Vol. 2:157-187 http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/life-science/stem-cell-biology/ipscpathway.Par.0001.Image.566.gif http://www.sciencedaily.com/images/2008/09/080910090825-large.jpg Kryovial, http://www.fisher.co.uk/offers/fisherbrand/images/FB74401.jpg Kryo straws, http://www.cryobiosystem-imv.com/Portals/3/produits/zooms/Z_CBS_straws.jpg Seminar Masterstudiengang Biotechnologie 28.01.2011 26